雌激素对缺氧视网膜Müller细胞PEDF和VEGF表达的影响

目的：探讨雌激素对缺氧视网膜Müller细胞色素上皮衍生因子（PEDF）和血管内皮生长因子（VEGF）表达的影响。方法：采用反转录聚合酶链反应（RT-PCR）和Western-blot印迹分析方法分别测定不同浓度雌二醇（E2）作用于缺氧Müller细胞后,细胞内PEDF mRNA,VEGF mRNA及相应的蛋白表达水平。结果：缺氧24h后PEDFmRNA及蛋白表达明显降低,10-5mmol/L和10-6mmol/LE2作用于Müller细胞后可明显缓解由于缺氧引起的细胞内PEDF mRNA及蛋白表达的降低,并与E2的浓度有关。缺氧24h后VEGF mRNA及蛋白表达明显升高,10-5mmol/L和10-6mmol/LE2作用于Müller细胞后可以明显降低细胞内VEGF mRNA及蛋白表达水平,并与E2的浓度有关。结论：雌激素可以调控缺氧条件下视网膜Müller细胞内PEDF和VEGF的表达,对视网膜病理性新生血管的形成具有保护作用。     

缺氧对视网膜Müller细胞VEGF和PEDF表达的影响

目的探讨缺氧对体外培养的大鼠视网膜M櫣ller细胞血管内皮生长因子(vas-cular endothelial growthfactor,VEGF)和色素上皮衍生因子(pigment epitheliumderived fac-tor,PEDF)表达的影响。方法采用RT-PCR和Western印迹分析方法分别对不同缺氧时间视网膜M櫣ller细胞VEGF和PEDF的mRNA及蛋白水平进行测定。结果M櫣ller细胞VEGF mRNA及蛋白表达在缺氧12h后明显升高,缺氧24h更为显著,24h时2者分别为对照组的2.12倍(P<0.05)和1.70倍(P<0.05)。PEDF mRNA及蛋白表达在缺氧6h后明显下降(P<0.05),缺氧24h下降更为显著,24h时2者分别为对照组的0·11倍(P<0.01)和0.54倍(P<0.05)。结论缺氧条件下,体外培养的大鼠M櫣ller细胞VEGF和PEDF表达失衡,PEDF表达下降,同时VEGF表达增加,2者的表达失衡可能在视网膜病理性新生血管形成过程中起一定作用。     

色素上皮衍生因子对高糖刺激下大鼠视网膜Müller细胞凋亡的影响

目的 探讨色素上皮衍生因子(pigmentepitheliumderivedfactor,PEDF)对高糖刺激下视网膜Müller细胞凋亡的影响,为PEDF治疗糖尿病视网膜病变提供实验依据。方法 实验分3组,分别是正常对照组、高糖模型(HG)组(培养基内含有25mmolL-1的葡萄糖)和PEDF处理高糖模型(HG+PEDF)组(在高糖培养基础上加入25mgL-1的PEDF)。反复胰蛋白酶消化法培养纯化SD大鼠视网膜Müller细胞,免疫荧光双标鉴定纯度;应用倒置相差显微镜观察Müller细胞形态,AnnexinVFITC、PI染色流式细胞技术检测Müller细胞的凋亡率,RTPCR测定Müller细胞bcl2、baxmRNA的表达变化。结果 原代培养的Müller细胞传至3代时纯度为95%以上。正常对照组、HG组、HG+PEDF组Müller细胞早期凋亡率分别为(1.223±0106)%、(2.657±0.120)%、(1.907±0.117)%,baxmRNA相对灰度值分别为0.269±0.041、0.804±0.052、0.528±0.018,bcl2mRNA相对灰度值分别为0.904±0.021、0.413±0015、0.521±0.010。HG组与正常对照组相比,Müller细胞形态发生明显改变,细胞凋亡率显著增加(P<0.001),baxmRNA表达显著升高,bcl2mRNA表达显著降低(均为P<0.01);HG+PEDF组Müller细胞凋亡率较HG组显著降低(P<0.001),baxmRNA表达显著降低,bcl2mRNA表达显著升高(均为P<0.01),但仍有别于正常对照组(均为P<005)。结论 外源给予PEDF可以显著减少高糖刺激引起的Müller细胞的凋亡,对视网膜Müller细胞具有显著的保护作用。     

抗血管内皮生长因子单克隆抗体bevacizumab对缺氧Müller细胞水通道蛋白4表达的影响

目的 观察抗血管内皮生长因子(VEGF)单克隆抗体bevacizumab(商品名Avastin)对氯化钴(CoCl2)诱导的缺氧Mller细胞水通道蛋白4(AQP4)表达的影响,探讨bevacizumab在治疗视网膜水肿中的作用机制.方法 采用酶消化法培养人视网膜Müller细胞,通过电子显微镜、细胞免疫荧光染色进行Müller细胞的鉴定.采用半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测不同浓度的CoCl2和VEGF作用不同时间后Müller细胞AQP4和VEGF mRNA的表达.观察200 μg/ml bevacizumab预处理对CoCl2诱导的缺氧人视网膜Müller细胞AQP4 mRNA表达的影响.结果 细胞免疫荧光染色显示,所培养的细胞95％表达波形蛋白、谷氨酰胺合成酶、α平滑肌肌动蛋白和胶质纤维酸性蛋白;电子显微镜下可见特征性的8～10 nm的微丝.证实培养的细胞为Müller细胞.RT-PCR结果显示,CoCl2上调Mller细胞AQP4和VEGF mRNA表达水平,AQP4和VEGF mRNA表达随CoCl2作用时间延长和CoCl2浓度增加的变化趋势均呈成正相关(r=0.952、0.954,P＜0.05).VEGF可上调Müller细胞上AQP4 mRNA的表达(F=12.43,P＜0.05).bevacizumab可抑制CoCl2诱导的Müller细胞AQP4 mRNA表达的上调(F=2 370.37,P＜0.05).结论 bevacizumab可以下调CoCl2诱导的Müller细胞AQP4的表达.这一效应可能是通过抑制VEGF对AQP4的诱导作用所发挥的,推测这是bevacizumab治疗视网膜水肿的机制之一.     

高浓度胰岛素对视网膜Müller细胞VEGF表达的影响(英文)

目的:探讨在高浓度胰岛素条件下,体外培养的兔视网膜Müller细胞的血管内皮细胞生长因子(vas-cularendothelialgrowthfactor,VEGF)的变化。方法:在不同浓度胰岛素条件下(4,8,12kU/L),体外培养兔视网膜Müller细胞,采用免疫细胞化学法、原位杂交法,定性测定Müller细胞分泌VEGF的变化,采用ELISA方法,定量测定Müller细胞分泌VEGF的变化。结果:高浓度胰岛素能明显增强VEGF的表达(P< 0.05)。结论:高浓度胰岛素可能通过刺激Müller细胞编码VEGF基因的转录,进而增强VEGF蛋白的表达,而在糖尿病视网膜病变的新生血管生成中发挥重要作用。     

色素上皮衍生因子对高糖环境下视网膜Müller细胞钾离子通道Kir4.1的调控

目的 探讨高糖环境下视网膜Müller细胞钾离子通道Kir4.1的表达改变及色素上皮衍生因子(PEDF)对Kir4.1的调控及可能机制.方法 培养的大鼠Müller细胞随机分为对照组、高糖组、PEDF干预组和干预对照组.其中,对照组使用5 mmol/L葡萄糖的培养液,高糖组使用25 mmol/L葡萄糖的培养液,PEDF干预组在25 mmol/L葡萄糖的培养液中加入100 ng/ml PEDF,干预对照组在25 mmol/L葡萄糖的培养液中只加入相同容积的磷酸缓冲盐溶液.通过蛋白免疫印迹法和实时荧光逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测各组Müller细胞Kir4.1表达的改变,同时采用二氯二氢荧光素二已酯荧光法检测各组细胞中氧自由基(ROS)生成;实时荧光RT-PCR法检测脂质过氧化物酶(GPx)的表达变化.结果 蛋白免疫印迹法和实时荧光RT-PCR法检测结果提示,高糖可以降低视网膜Müller细胞Kir4.1的表达(蛋白免疫印迹法:t=3.53,P＜0.05;实时荧光RT-PCR法:t=4.12,P＜0.05),同时引起ROS生成增多(t=3.76,P＜0.05)以及GPx表达下降(t=3.18,P＜0.05).PEDF处理后,高糖状态下视网膜Müller细胞的Kir4.1表达显著上升(蛋白免疫印迹法:t=6.43,P＜0.01;实时荧光RT-PCR法:t=3.66,P＜0.05),同时使ROS浓度下降及GPx表达升高(t=4.11,P＜0.05;t=5.12,P＜0.01).结论 高糖可以通过诱发氧化应激从而使Müller细胞Kir4.1的表达下调,PEDF能改善由高糖诱发的这一变化.     

长链非编码RNA 母系表达基因3调控miR-34a对糖尿病视网膜病变Müller细胞活化及炎症因子分泌的影响

目的　探讨母系表达基因3（maternally expressed gene 3,MEG3）对糖尿病视网膜病变（DR）Müller细胞的活化及炎症因子分泌的影响及机制。方法　高脂饮食联合链脲佐菌素腹腔注射构建小鼠DR体内模型。高糖刺激人视网膜Müller细胞株MIO-M1构建DR体外模型。免疫荧光化学染色及Western blot检测小鼠视网膜及Müller细胞中胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的表达。Western blot及酶联免疫吸附实验（ELISA）检测小鼠视网膜及细胞培养基上清中血管内皮生长因子（VEGF）蛋白的表达。ELISA检测小鼠视网膜及细胞培养基上清中IL-1β蛋白的表达。分别或同时向Müller细胞中转染pcDNA-MEG3及miR-34a mimic对其表达进行干预。qRT-PCR检测MEG3 mRNA及miR-34a表达。结果　与正常对照组小鼠比较,DR组小鼠视网膜中GFAP、VEGF及IL-1β蛋白表达均增多（均为P<0.05）,MEG3 mRNA表达降低(P<0.01)。与对照组比较,高糖组Müller细胞中MEG3 mRNA表达降低(P<0.01),而GFAP、VEGF及IL-1β蛋白表达均升高（均为P<0.05）。与高糖组比较,高糖+pcDNA-MEG3组中GFAP、VEGF及IL-1β蛋白表达均降低（均为P<0.05）。与正常对照组比较,DR组小鼠视网膜及高糖刺激的Müller细胞中miR-34a表达均升高(均为P<0.05)。与pcDNA组比较,pcDNA-MEG3组中miR-34a表达减少(P<0.01)。与pcDNA+NC mimic组比较,pcDNA+miR-34a mimic组中GFAP、VEGF及IL-1β蛋白表达均升高（均为P<0.05）,而pcDNA-MEG3+NC mimic组中GFAP、VEGF及IL-1β蛋白表达均减少（均为P<0.05）。与pcDNA-MEG3+miR-34a mimic组比较,GFAP、VEGF及IL-1β蛋白表达水平均升高（均为P<0.05）。结论　MEG3在DR小鼠视网膜及高糖刺激的Müller细胞中表达均降低,其可通过负向调控miR-34a抑制Müller细胞活化及炎症因子的分泌。过表达MEG3可能成为DR治疗的新靶点。     

缺氧下外源性血管内皮生长因子对体外大鼠Müller细胞的影响

目的:观察缺氧条件下外源性血管内皮细胞生长因子(VEGF)对体外大鼠Müller细胞的影响.方法:体外酶消化法纯化培养并鉴定大鼠Müller细胞.台盼兰染色测定细胞活性.应用光镜、细胞计数、免疫细胞化学、MTT法、原位细胞凋亡等方法分析Müller细胞在不同的缺氧时间(0～24 h)、添加不同浓度VEGF(10～100μg/L)及VEGF受体FIk-1阻断剂SU1498处理后,细胞中VEGF和FIk-1,FIt-1的表达、细胞活性及凋亡等变化.结果:纯化培养至第3代的Müller细胞,经鉴定其纯度为90%,活力是87.3%.缺氧8～12h时Müller细胞胶质源纤维酸性蛋白(GFAP)染色增强,VEGF和FIk-1,FIt-1表达增加,可见细胞肿胀、脱落.缺氧20h时,与对照组相比,细胞增生降低到79.3%,细胞凋亡指数增加了6.5倍.缺氧24h前加入75μg/L VEGF使细胞活性增强了1.3倍,凋亡指数下降到2/3.VEGF在10～75μg/L 范围内此作用呈剂量依赖性.正常情况下,FIk-1,FIt-1表达很少,但是缺氧后,表达量明显上升,FIt-1更显著.加入SU1498后能部分抑制VEGF对Müller细胞的作用.结论:短时间缺氧使Müller细胞反应性增生,VEGF和FIk-1,FIt-1表达增加,外源性VEGF可能部分地借助于受体FIk-1和FIt-1对缺氧的Müller细胞起到保护作用.     

骨形成蛋白4靶向调控SMAD9表达影响Müller细胞迁移和活性氧产生

目的观察并初步探讨骨形成蛋白4(BMP4)靶向调控SMAD9表达对Müller细胞迁移、活性氧(ROS)生成以及血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响。方法体外培养的Müller细胞分为正常对照组、BMP4组、BMP4+空载质粒组(BMP4+NC组)、BMP4+SMAD9小干扰质粒组(BMP4+siSMAD9)。BMP4组、BMP4+NC组、BMP4+siSMAD9组细胞培养基加入100 ng/ml BMP4诱导细胞24 h。其后, BMP4+NC组转染空载质粒;BMP4+siSMAD9组转染SMAD9小干扰质粒48 h。细胞划痕实验测定BMP4对Müller细胞迁移的影响;流式细胞仪检测BMP4对Müller细胞内ROS生成的影响;蛋白质免疫印迹法(Western blots)、实时荧光定量聚合酶链反应(qPCR)检测Müller细胞内谷氨酰胺合成酶(GS)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)蛋白、mRNA相对表达量;免疫荧光检测Müller细胞内VEGF的表达。多组间比较采用单因素方差分析。结果细胞划痕实验检测结果显示, BMP4+ siSMAD9组细胞迁移率较BMP4组、BMP4+NC...     

缺氧对视网膜Müller细胞上水通道蛋白-4表达的影响

目的 利用体外培养的视网膜Müller细胞,研究在缺氧条件下视网膜Müller细胞上水通道蛋白-4(AQP-4)表达的变化.方法 采用组织块培养法从新西兰大白兔视网膜中获取Müller细胞,在含20%胎牛血清的DMEM培养液中原代培养,培养的细胞通过胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫细胞化学染色及透射电子显微镜进行鉴定.取第2代细胞进行实验,将化学缺氧诱导剂CoCl_2联合DMEM培养液培养24h的细胞作为缺氧组;将DMEM培养液单独培养24h的细胞作为对照组.采用免疫细胞化学法及半定量RT-PCR法分别检测2组Müller细胞上AQP-4蛋白及AQP-4 mRNA的表达.结果 Müller细胞(第2代)上GFAP的阳性率为90%以上,细胞质染色呈棕色.细胞内含特征性的中间丝,细胞表面有微绒毛,细胞质内含丰富的细胞器.CoCl_2联合DMEM培养液培养24h后Müller细胞上AQP-4蛋白的表达较对照组明显增加(t=6.74,P＜0.05);AQP-4 mRNA的表达亦明显增加(t=21.79,P＜0.05).结论 缺氧能增强Müller细胞上AQP-4的表达,进而使视网膜内液体的积聚增加.提示Müller细胞在糖尿病视网膜病变(DR)或增生性视网膜病变的视网膜水肿形成过程中起重要作用.     

叔丁基对苯二酚对高糖环境下大鼠视网膜Müller细胞的抗氧化应激作用及其机制

目的研究叔丁基对苯二酚(tBHQ)对高糖环境下SD大鼠视网膜Müller细胞氧化应激的影响及其机制。方法体外培养SD大鼠视网膜Müller细胞。将实验分为正常对照组、高糖组和tBHQ干预组,采用Western blot法和实时荧光定量PCR测定各组Müller细胞核因子-E2相关因子(Nrf2)、血红素氧化酶1(HO-1)、缺氧诱导因子1α(HIF-1α)和血管内皮生长因子(VEGF)蛋白及其mRNA的相对表达量。结果体外培养Müller细胞的细胞体扁平不规则,细胞核呈卵圆形,细胞质丰富,相邻细胞交织形成网状;Western blot法检测结果显示,正常对照组、高糖组和tBHQ干预组Müller细胞中Nrf2、HO-1、HIF-1α和VEGF的蛋白相对表达量总体比较,差异均有统计学意义(F=73.831、148.618、152.269、91.217,均P<0.001);其中高糖组Nrf2、HO-1、HIF-1α和VEGF蛋白相对表达量分别是0.17±0.02、0.47±0.02、0.67±0.07和0.60±0.05,较正常对照组的0.06±0.01、0.19±0.03、0.06±0.00和0.07±0.02明显增加,差异均有统计学意义(t=4.114、9.275、16.479、13.353,均P<0.001);tBHQ干预组Nrf2、HO-1蛋白表达量分别为0.40±0.06、0.72±0.05,较高糖组增加,差异均有统计学意义(t=7.847、7.947,均P<0.001);tBHQ干预组HIF-1α、VEGF蛋白表达量分别为0.18±0.04、0.26±0.07,较高糖组降低,但较正常对照组增加,差异均有统计学意义(t=13.215、8.444,均P=0.000)。实时荧光定量PCR测定结果显示,正常对照组、高糖组和tBHQ干预组Müller细胞中Nrf2、HO-1、HIF-1α和VEGF mRNA相对表达量总体比较,差异均有统计学意义(F=340.317、1582.911、488.852、185.699,均P<0.001);其中高糖组Nrf2、HO-1、HIF-1α和VEGF mRNA相对表达量分别是1.53±0.06、1.50±0.04、2.56±0.09和3.04±0.19,较正常对照组的1.07±0.07、0.95±0.05、0.99±0.02和1.09±0.08明显增加,差异均有统计学意义(t=7.292、15.014、30.550、18.573,均P<0.001);tBHQ干预组Nrf2、HO-1mRNA相对表达量分别为2.68±0.09、2.94±0.05,较高糖组增加,差异均有统计学意义(t=18.046、39.458,均P<0.001);tBHQ干预组HIF-1α、VEGF mRNA相对表达量分别为1.48±0.05、1.6±0.08,较高糖组降低,但较正常对照组增加,差异均有统计学意义(t=21.036、13.739,均P<0.001)。结论tBHQ通过激活抗氧化应激Nrf2/ARE信号通路,对高糖环境下Müller细胞损伤起保护作用。     

曲安奈德和酮咯酸氨丁三醇对缺氧视网膜Müller细胞上水通道蛋白-4及VEGF表达的影响

背景 曲安奈德(TA)玻璃体腔内注射可引起高眼压、白内障及眼内炎等并发症.酮咯酸氨丁三醇(Ketorolac)是一种作用机制与TA相似、不良反应较少的新型非甾体类抗炎药,其在治疗视网膜水肿方面可能替代或部分替代TA. 目的 研究TA和Ketorolac对CoCl2诱导的缺氧条件下兔视网膜Müller细胞上水通道蛋白-4(AQP4)及血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响,探讨其治疗视网膜水肿的作用机制. 方法 收集健康新西兰白兔20只,采用酶消化法培养兔视网膜Müller细胞并进行鉴定.取第2代细胞用于实验.分别用含500μmol/L CoCl2的DMEM 2 ml孵育细胞0、6、12、24 h建立视网膜Müller细胞缺氧模型,采用半定量逆转录PCR(RT-PCR)法观察缺氧对Müller细胞中AQP4 mRNA及VEGF mRNA表达的影响,确定造模的最佳时间点.将培养24 h的细胞分为正常对照组,缺氧对照组,缺氧+50、100、200 mg/L TA组,缺氧+50、100、200 mg/L Ketorolac组,分别在缺氧细胞培养基中加入相应的药物进行共培养,采用半定量RT-PCR法观察TA和Ketorolac对Müller细胞中AQP4 mRNA及VEGF mRNA表达的影响. 结果 培养的细胞呈不规则形、星形,细胞核呈卵圆形,培养14 ～25 d时细胞达到80％以上融合.95％的培养细胞中间丝波形蛋白(vimentin)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)阳性表达,呈绿色荧光.RT-PCR法检测结果显示,培养后各时间点间Müller细胞中AQP4 mRNA和VEGF mRNA表达的吸光度(A)值总体比较差异均有统计学意义(F=18.70、53.20,P＜0.01),CoCl2作用6、12、24 h值均明显高于正常Müller,差异均有统计学意义(P＜0.05),其中24 h时AQP4 mRNA和VEGF mRNA的表达量达峰值.缺氧24 h时8个组Müller细胞中AQP4 mRNA和VEGF mRNA表达(A)值的总体比较差异均有统计学意义(F=27.98、10.03,P＜0.01);与缺氧对照组比较,除缺氧+50 mg/L TA组、缺氧+50 mg/L Ketorolac组外,其他各缺氧实验组Müller细胞中AQP4mRNA、VEGF mRNA表达量均明显下降,差异均有统计学意义(P＜0.05);缺氧+100 mg/L TA组和缺氧+100 mg/LKetorolac组以及缺氧+200 mg/L TA组和缺氧+200 mg/L Ketorolac组AQP4mRNA、VEGF mRNA的表达,组间差异均无统计学意义(P＞0.05). 结论 TA和Ketorolac均可下调化学性诱导的缺氧Müller细胞中AQP4和VEGF的表达水平,二者对视网膜水肿的治疗作用类似.     

花色苷对高糖、高胰岛素下Müller细胞合成VEGF的影响

目的观察高糖、高胰岛素培养下Mller细胞血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的合成与分泌,以及花色苷对其合成、分泌VEGF的影响。方法对大鼠视网膜Mller细胞进行原代培养。用50mmol.L-1葡萄糖和不同浓度的胰岛素处理Mller细胞24h,分为高胰岛素组(3kU.L-1胰岛素)、低胰岛素组(3U.L-1胰岛素)和对照组(不含胰岛素)。分别用121.1μmol.L-1、22.8μmol.L-1、0μmol.L-1花色苷对各组细胞进行干预。48h后用酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)测定上清液中VEGF的含量,免疫细胞化学测定Mller细胞中VEGF的表达。结果相比对照组,高胰岛素处理Mller细胞后上清液与细胞中的VEGF表达均增加;低浓度和高浓度花色苷均可使该组细胞与上清液中的VEGF表达减少,与未加入花色苷的Mller细胞相比差异均有统计学意义(均为P<0.05)。经2种浓度花色苷分别处理后,高胰岛素组与对照组上清液和细胞中的VEGF表达差异均无统计学意义(均为P>0.05),2种浓度之间差异亦无统计学意义(均为P>0.05)。结论高浓度胰岛素在短期内即可使Mller细胞合成、分泌VEGF增加,花色苷能有效逆转该过程。     

碱性成纤维细胞生长因子在糖基化终产物作用下视网膜Müller细胞中的表达及对血管内皮生长因子影响

目的 观察糖基化终产物(AGEs)作用下兔视网膜Müller细胞中碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的表达,以及bFGF对该细胞表达血管内皮生长因子(VEGF)的影响,探讨AGEs对于糖尿病视网膜病变(DR)发生发展的可能作用机制.方法 制备牛血清白蛋白AGEs(AGEs-BSA)及其对照物并将其作用于体外培养的兔视网膜Müller细胞,采用免疫细胞化学(ICC)方法 半定量检测不同时间点(1d、3d、6d、9d)Müller细胞bFGF表达变化.利用外源性bFGF(0.1、1.0、10.0、50.0、100.0)ng/mL干预Müller 细胞,采用ICC方法 半定量检测不同时间点(1d、3d、6d、9d)M üller细胞VEGF的表达变化.结果 AGEs作用下兔视网膜M üller细胞bFGF的表达增高(P<0.05或P<0.01)且具有一定的时间和浓度依赖性.外源性bFGF可上调视网膜M üller细胞VEGF的表达,且具有一定的浓度依赖性及时限性.结论 AGEs可以上调视网膜Mü ller细胞表达bFGF,而bFGF可以上调Müller细胞表达VEGF,推测AGEs可能通过增加bFGF的表达,以及通过分泌的bFGF间接促进VEGF的表达,从而在DR形成过程中起重要作用.

Abstract：

Objective To investigate the effect of advanced glycosylation end products (AGEs) on expression of basic fibroblast growth factor (bFGF) in rabbit retinal Müller cells, also the effect ofbFGF on expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) in rabbit retinal Müller cells in vitro. Methods Rabbit retinal Müller cells were cultured first, then AGEs-BSA and its control were prepared. Müller cells were treated with 5 different concentration series of AGEs-BSA and AGEs-BSA control for 1, 3, 6 and 9 days, while blank control group was incubated without any intervention. Then bFGF expression in Müller cells was half-quantitatively identified by immunocytochemistry (ICC). Cultured rabbit Müller cells were also treated with bFGF of 5 concentrations (0.1, 1.0, 10.0, 50.0, 100.0) ng/mL for 1, 3, 6, 9 days, while blank control group was incubated without any intervention. Then VEGF expression in Müller cells was half-quantitatively identified by ICC. Results Comparing with control group, AGEs-BSA evoked a time and concentration-dependent increase ofbFGF expression on cultured retinal Müller cells (P ＜0. 05 or P ＜0. 01). And comparing with blank control group, bFGF also evoked a time and concentration-dependent increase of VEGF expression on retinal Mi ller cells in a certain range. Conclusions AGEs up-regulates the expression ofbFGF, which can up-regulate the expression of VEGF in Müller cells. These results indicate that AGEs might promote the progress of DR.     

CDK抑制剂对糖尿病大鼠视网膜Müller细胞胶质增殖及新生血管形成的抑制作用

目的　探讨CDK抑制剂对糖尿病大鼠视网膜Müller细胞胶质增殖及新生血管形成的影响。方法　雄性SD大鼠30只，随机分成对照组、糖尿病组、治疗组(CDK抑制剂SCH727965)，每组各10只。后两组大鼠采用单次腹腔注射55 mg·kg^-1链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)的方法诱导糖尿病模型。模型诱导成功后，治疗组玻璃体内注射SCH727965 8 μL(3 nmol·L^-1)。12周后，免疫荧光检测三组大鼠视网膜胶质纤维酸性蛋白质(glial fibrillary acidic protein,GFAP)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表达，免疫组织化学检测视网膜色素上皮衍生因子(pigment epithelium-derived factor,PEDF)表达，Western blot检测GFAP、增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)、PEDF蛋白相对表达量。结果　与对照组GFAP (100.00±0.00)%、VEGF(100.00±0.00)%、PEDF(38.26±0.52)%、PCNA(9.34±0.47)%表达相比，糖尿病组GFAP(168.24±2.72)%、VEGF(156.79±1.75)%、PCNA(16.11±0.34)%表达均明显增加，PEDF(23.72±0.71)%表达明显降低(均为P<0.01)；而与糖尿病组相比，治疗组GFAP(124.37±3.01)%、VEGF(118.36±1.98)%、PCNA(12.05±0.67)%表达均明显降低，PEDF(8.22±0.36)%表达明显增加(均为P<0.05)。结论　SCH727965可下调大鼠糖尿病状态下视网膜GFAP、VEGF、PCNA表达，上调PEDF表达，进而抑制Müller细胞增殖及新生血管形成。     

表皮生长因子对人眼Müller细胞增生迁移的影响及其作用机制

背景研究证实表皮生长因子（EGF）可促进鼠视网膜Müller细胞的增生和迁移,但EGF能否促进人眼Müller细胞的增生迁移尚未见报道。目的探讨人眼Müller细胞能否自身表达和分泌EGF及EGF对Müller细胞增生迁移的影响及其作用机制。方法同一代人永生株Müller细胞系MIO—M1细胞用高糖DMEM进行培养,利用MTT比色法观察不同质量浓度EGF作用24、48、72h,不同浓度CoCl2作用12h和24h,加入导致Müller细胞半数致死量的CoCl,浓度前2h加入不同质量浓度EGF的Müller细胞增生情况;Transwell小室观察正常及CoCl2缺氧条件下用不同质量浓度EGF作用24、48、72h后Müller细胞的迁移情况;采用ELISA法观察Müller细胞表达和分泌EGF的情况;通过Westernblot法检测体外不同条件培养下EGF对ERK1/2及Akt信号转导通路的作用。结果正常培养条件下,不同质量浓度的EGF作用后Mfiller细胞的吸光度（A570）值的总体比较差异有统计学意义（F=123．765,P=0．000）,100mg／LEGF促Müller细胞增生作用最强,为对照组的1．6倍,10mg／LEGF促Müller细胞迁移的作用最强,为对照组的4．5倍。各EGF组Müller细胞的A570,值均明显高于对照组,差异有统计学意义（P〈O．01）。缺氧条件下培养,Müller细胞半数致死量的CoCl2浓度为600nmol／L,提前2h加入10～100阻g／LEGF后,EGF对抗缺氧所致Muller细胞的损伤作用最明显。700nmol／LCoCl2致Müller细胞损伤80％时其自身低分泌7．8ng／LEGF。10～100mg／LEGF作用Müller细胞促增生迁移作用信号最明显,600nmol／ LCoCl2作用Müller细胞24h后ERKl／2及Akt信号强度减弱,提前2h加入外源性EGF后,ERK1／2及Akt两条信号通路最明显。结论EGF能以剂量依赖的方式促进体外培养的Müller细胞增生及迁移。正常培养条件下的Müller细胞自身不表达,缺氧条件下Müller细胞自身可少量分泌EGF。EGF可能通过ERK1／2及Akt信号转导通路介导Müller细胞的增生和迁移,并对CoCl2损伤的Müller细胞发挥保护作用。     

缺氧对视网膜Müller细胞中谷氨酸转运体及未折叠蛋白相关因子XBP1、CHOP表达的影响

目的研究体外缺氧刺激后视网膜Müller细胞是否存在未折叠蛋白反应(unfol-dedprotein reaction,UPR),及其与L-谷氨酸/L-天门冬氨酸转运体(glutamate-aspartatetrans-porters,GLAST)的关系。方法出生3～7d大鼠视网膜组织采用胰蛋白酶消化法培养视网膜Müller细胞,氯化钴(CoCl2)200μmol·L-1对视网膜Müller细胞进行体外缺氧干预,干预时间为0h、3h、6h、12h、24h、48h、72h;UPR诱导剂二硫苏糖醇(DTT)2mmol·L-1刺激视网膜Müller细胞为阳性对照,干预时间为0h、3h、6h、12h、24h、48h、72h。采用实时荧光定量PCR检测GLAST与UPR相关因子X盒结合蛋白1、C/EBP同源蛋白的表达并分析其相关性。结果视网膜Müller细胞鉴定:细胞免疫荧光染色示90%以上细胞GS、GLAST表达阳性;流式细胞仪检测结果:Müller细胞的GLAST表达阳性率为(84.66±3.51)%。缺氧刺激后,GLAST与X盒结合蛋白1、C/EBP同源蛋白在Müller细胞上均有表达,缺氧早期呈上升趋势,干预后24h表达最强,后呈下降趋势。DTT干预组表达趋势与缺氧干预组一致。结论体外缺氧刺激后视网膜Müller细胞存在UPR,其相关因子的变化与GLAST的变化趋势一致,提示UPR可能是调控GLAST变化的原因之一。     

雷公藤红素对高糖环境下大鼠视网膜血管内皮细胞VEGF和PEDF表达的影响

目的观察雷公藤红素对高糖环境下大鼠视网膜血管内皮细胞VEGF和PEDF表达的影响。方法将体外培养的大鼠视网膜血管内皮细胞分为空白对照组、高糖组、高糖+雷公藤红素(0.05mg·L-1)组,进行相应处理后分别用免疫细胞化学及ELISA法检测细胞中VEGF和PEDF的表达。结果免疫细胞化学灰度值测定,空白组、高糖组及高糖+雷公藤红素组VEGF表达分别为74.40±4.19、110.12±7.32、78.11±5.81,PEDF表达量分别为124.65±6.01、88.73±7.84、93.31±5.67;ELISA结果显示空白组、高糖组及高糖+雷公藤红素组VEGF表达量分别为(155.21±13.36)ng·L-1、(237.69±19.41)ng·L-1、(168.57±26.32)ng·L-1,PEDF表达量分别为(251.37±17.95)ng·L-1、(178.35±25.36)ng·L-1、(191.58±31.37)ng·L-1,与正常对照组相比,高糖组VEGF表达增高(P<0.05),PEDF表达减少(P<0.05);与高糖组相比,高糖+雷公藤红素组VEGF表达减少(P<0.05),PEDF表达无明显差异性(P>0.05)。结论雷公藤红素能减少高糖环境下大鼠视网膜血管内皮细胞中VEGF表达,对PEDF表达的影响不明显。     

蛭草茶合剂对糖尿病小鼠视网膜Müller细胞的保护作用及炎症因子表达的影响

目的:观察蛭草茶合剂对糖尿病小鼠视网膜Müller细胞的保护作用及对炎症因子表达的影响。方法:健康清洁级雄性C57BL/6J小鼠75只,采用随机数字表法随机分为正常对照组、糖尿病组、低浓度蛭草茶合剂治疗组(低浓度治疗组)、中浓度蛭草茶合剂治疗组(中浓度治疗组)、高浓度蛭草茶合剂治疗组(高浓度治疗组),每组15只。糖尿病组、不同浓度治疗组小鼠按60 mg/kg剂量腹腔注射STZ诱导糖尿病动物模型。建模后4周,低浓度治疗组、中浓度治疗组、高浓度治疗组大鼠分别按30、60、120 ml/kg的浓度行蛭草茶合剂灌胃治疗。每两周测定各组小鼠体重及血糖。第8周后,采用Western blot检测各组小鼠视网膜Müller细胞中胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达;免疫荧光检测GFAP、谷氨酰胺合成酶(GS)表达;实时荧光定量PCR(RT-qPCR)、ELISA分别检测VEGF、TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA和蛋白表达。组间比较采用单因素方差分析。结果:糖尿病组小鼠体重较正常对照组降低,血糖升高;不同浓度治疗组小鼠血糖呈降低趋势。与正常对照组比较,糖尿病组小鼠视网膜Müller细胞GFAP蛋白表达升高(t=38.318,P<0.001),GS蛋白表达降低(t=29.737,P<0.001),差异有统计学意义;与糖尿病组比较,低浓度治疗组、中浓度治疗组、高浓度治疗组小鼠Müller细胞GFAP蛋白表达下降(t=13.677、19.387、16.305,P<0.05),GS蛋白表达升高(t=5.170、19.399、6.705,P<0.05),差异均有统计学意义。糖尿病组小鼠视网膜Müller细胞VEGF、TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA和蛋白表达均升高,不同浓度治疗组均降低。结论:蛭草茶合剂可降低糖尿病小鼠血糖,减轻糖尿病视网膜炎症反应。     

牛磺酸对高糖刺激大鼠视网膜Müller细胞GLAST和GS表达的影响

目的:通过检测牛磺酸对高糖刺激大鼠视网膜Müller细胞谷氨酸转运蛋白(glutamate-aspartate transporters,GLAST)和谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase,GS)表达的影响,探讨牛磺酸保护糖尿病引起视网膜损伤的机制。方法:高糖培养大鼠视网膜Müller细胞,分正常对照组(NC)、高糖组(high glucose,HG,25mmol/L)、高糖 0.1mmol/L牛磺酸(taurine,T)干预组(HG 0.1T)、高糖 1mmol/L牛磺酸干预组(HG 1T)、高糖 10mmol/L牛磺酸干预组(HG 10T)。用免疫荧光化学法和Western-blotting检测大鼠视网膜Müller细胞中GLAST和GS的表达。结果:高糖培养后,大鼠视网膜Müller细胞中GLAST和GS的表达明显减少(P<0.05),与高糖组相比,1mmol/L和10mmol/L牛磺酸干预可明显增加GLAST和GS的表达(P<0.05)。结论:牛磺酸增加Müller细胞中GLAST和GS的表达抑制糖尿病引起的视网膜Müller细胞功能改变。