胰岛素样生长因子-I对人骨髓间充质干细胞增殖的影响

目的:建立人胚骨髓间充质干细胞(MSCs)分离及培养的方法,探讨胰岛素样生长因子-I(IGF-I)对MSCs增殖的影响。方法:通过密度梯度离心,贴壁法分离培养人胚MSCs,取第4代MSCs,应用流式细胞术测定细胞周期和CD44、CD34、CD45表达。采用MTT法观察不同含量和不同作用时间的IGF-I对MSCs增殖的影响。结果:体外培养的MSCs呈现成纤维细胞形态,流式细胞仪检测结果显示,MSCs阳性表达CD44,阴性表达CD34,CD45。细胞周期分析显示IGF-I使S+G2+M期细胞数增加,占细胞总数(29.9±2.3)%(t=10.4,P<0.01)。1μg/LIGF-I促MSCs增殖作用不明显,10μg/LIGF-I即可促MSCs增殖,IGF-I含量为100μg/L时,其促增殖作用达最大值,吸光度为2.95。而当IGF-I含量大于100μg/L时,促细胞增殖作用反而下降;时效关系显示,IGF-I第1天发挥促增殖作用,第5天促增殖作用达高峰,维持时间可达7d。结论:外源性IGF-I能促进MSCs增殖,为实现MSCs体外快速扩增提供适宜的条件。     

胰岛素样生长因子-Ⅰ对人骨髓间充质干细胞增殖的影响

目的建立人胚骨髓间充质干细胞(MSCs)分离及培养的方法, 探讨胰岛素样生长因子-I(IGF-I)对 MSCs增殖的影响.方法 通过密度梯度离心,贴壁法分离培养人胚 MSCs,取第 4代 MSCs,应用流式细胞术测定细胞周期和 CD44、 CD34、 CD45表达.采用 MTT法观察不同含量和不同作用时间的 IGF-I对 MSCs增殖的影响.结果 体外培养的 MSCs呈现成纤维细胞形态,流式细胞仪检测结果显示, MSCs阳性表达 CD44,阴性表达 CD34, CD45.细胞周期分析显示 IGF-I使 S+ G2+ M 期细胞数增加,占细胞总数(29.9± 2.3)%(t=10.4, P< 0.01).1 μ g / L IGF-I促 MSCs增殖作用不明显, 10 μ g / L IGF-I即可促 MSCs增殖, IGF-I含量为 100 μ g / L时,其促增殖作用达最大值,吸光度为 2.95.而当 IGF-I含量大于 100 μ g / L时,促细胞增殖作用反而下降;时效关系显示, IGF-I第 1天发挥促增殖作用,第 5天促增殖作用达高峰,维持时间可达 7 d.结论 外源性 IGF-I能促进 MSCs增殖,为实现 MSCs体外快速扩增提供适宜的条件.     

大鼠骨髓间充质干细胞体外分离培养表型鉴定与标记

目的 探讨大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）体外分离培养、表型鉴定和标记的方法，为临床进行细胞移植治疗心、肝、脑等器官急性衰竭提供种子细胞。方法 无菌条件下取大鼠股骨、胫骨和腓骨，用冲洗法冲出骨髓，用直接贴壁法分离纯化MSCs，体外扩增，用免疫细胞化学法及流式细胞仪分别对培养的MSCs进行鉴定，并检测第3代MSCs的细胞周期。结果体外培养的原代MSCs 72h内可见有少量贴壁细胞，7d左右达到汇合。免疫细胞化学示，MSCs CD29、CD44、CD73、CD105、CD166表达阳性，而CD14、CD34、CD45表达阴性。流式细胞仪示，CD14阳性率为0．19％、CD29为64．36％、CD34为0．17％、CT44为86．73％、CD45为0．18％、CD73为90、21％、CD105为74．25％、CD166为54．60％。细胞周期显示，第3代MSCs约有90％的细胞处于G0／G1期。结论 MSCs在体外很容易分离培养和扩增，DAPI标记MSCs敏感性好，标记效率高，可作为标记细胞的一种有效手段，MSCs体外培养成功为细胞移植治疗急危重症器官衰竭提供新的治疗途径。     

重组人红细胞生成素促进体外培养的人骨髓间充质干细胞增殖

为了观察重组人红细胞生成素（rhEPO）对人骨髓间充质干细胞（MSCs）增殖活性的影响，抽取健康志愿者的骨髓液，贴壁培养获取第3代细胞，通过细胞形态特征、细胞表面抗原及诱导分化的方法进行MSCs鉴定；取经过鉴定的第3代MSC（P3-MSC）加入不同浓度rhEPO（0．5、1、5、10、50U／ml）后培养，应用细胞计数法及MTT法检测细胞增殖，用流式细胞术（FCM）分析细胞周期。结果发现：骨髓贴壁培养获取的第3代细胞同时表达CD105和CD90，不表达CD34和CD45，并可被诱导分化为脂肪、骨及软骨细胞，被鉴定为MSC。MTT结果显示EPO处理组的光密度值（OD）均高于对照组（P〈0．05）；50U／ml浓度EPO组作用最显著，细胞计数法获得的结果与其一致。FCM细胞周期分析表明，rhEPO能明显降低G0／G1期细胞比例，并提高S＋G2／M期细胞比例，与对照组相比，差异均具有显著统计学意义（P〈0．01）。结论：EPO能促进体外培养的人骨髓MSCs增殖，该效应与EPO调节其进入细胞增殖周期有关。     

体外诱导人骨髓间充质干细胞分化为软骨细胞

背景：自体软骨细胞来源困难是束缚软骨细胞移植和软骨工程学发展的主要问题之一。骨髓间充质干细胞具有多向分化潜能，在不同诱导条件下，骨髓间充质干细胞能分化形成多种组织细胞，如软骨细胞、成骨细胞、成肌细胞及神经细胞等。胰岛素样生长因子-Ⅰ是一种对肢体和软骨的形成及发育起重要调控作用的生长因子。 目的：观察胰岛素样生长因子-Ⅰ和软骨细胞培养液是否能在体外诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化。 设计：开放性实验。 单位：中山大学附属第二医院骨科和医学研究中心。 材料：实验于2003-03／11在中山大学附属第二医院医学研究中心完成。人骨髓间充质干细胞取自因健康原因需终止妊娠的4～6月龄水囊引产的胚胎。 方法：采用Percoll分离液分离培养人胚骨髓间充质干细胞，体外扩增，用流式细胞仪测定骨髓间充质干细胞的CD44，CD71，CD34, CD45表达；在第4代骨髓间充质干细胞的培养基中加入100μg／L胰岛素样生长因子-Ⅰ和软骨细胞培养液，采用倒置显微镜观察、Ⅱ型胶原免疫组织化学、细胞内蛋白多糖含量测定等方法判断诱导细胞的形态变化和表达软骨基质的能力。 主要观察指标：通过检测细胞CD34，CD44，CD45的表达，进行骨髓间充质干细胞表型鉴定。通过观测诱导后细胞Ⅱ型胶原免疫组织化学及细胞分泌蛋白多糖能力的变化判断其是否向软骨细胞分化。 结果：①倒置显微镜观察结果：体外培养的骨髓间充质干细胞呈现成纤维细胞形态。②骨髓间充质干细胞表面抗原鉴定：流式细胞仪结果显示细胞均一性较好，第4代骨髓间充质干细胞阳性表达CD44，阴性表达CD34，CD45，说明分离获得的细胞符合骨髓间充质干细胞的特点：③光镜下观察骨髓间充质干细胞诱导为软骨细胞的形态变化：加入软骨细胞条件培养液和胰岛素样生长因子-Ⅰ共培养，在培养过程中见骨髓间充质干细胞逐渐变圆，15d后可见部分细胞呈短梭形或多角形．突起短，呈现软骨细胞的特征。④Ⅱ型胶原免疫组织化学染色：胰岛素样生长因子组细胞在培养后第15天约72．5%的细胞可见棕黄色的颗粒分布于胞浆内，呈弱阳性或较强阳性。对照组骨髓间充质干细胞第15天的Ⅱ型胶原免疫组织化学为阴性。⑤蛋白多糖含量测定：胰岛素样生长因子-Ⅰ和软骨细胞培养液共培养组培养15d后，细胞内蛋白多糖含量为[8．92&;#177;0．91）μg／L，高于单纯骨髓间充质干细胞培养组Ⅰ（2．56&;#177;0．26）μg／L，P〈0．05]，但低于软骨细胞组[（13．69&;#177;1．51）μg／L，P〈0．05]。 结论：胰岛素样生长因子-Ⅰ和软骨细胞培养液能诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化。     

地黄低聚糖对体外培养的小型猪脂肪组织来源干细胞增殖的影响

目的分离培养小型猪脂肪组织来源干细胞(ASCs),观察不同浓度地黄低聚糖(RGOs)对其增殖的影响。方法酶消化法及贴壁法从小型猪腹股沟脂肪组织中分离、培养ASCs,流式细胞仪检测ASCs表面抗原CD29、CD31、CD34、CD44、CD45、CD90、CD105、HLA-DR的表达,CCK-8比色法观察不同浓度RGOs(0g/L、0.001g/L、0.01g/L、0.1g/L、1g/L、10g/L)对其增殖的影响。结果第4代ASCs表面抗原CD29、CD44、CD90、CD105表达呈阳性,CD31、CD34、CD45、HLA-DR表达呈阴性。RGOs在0.01～1 g/L浓度范围内对体外培养的小型猪ASCs具有促增殖作用(P<0.05),最佳浓度为0.1 g/L。结论一定浓度的RGOs对体外培养的小型猪ASCs具有促增殖作用。     

骨髓间充质干细胞体外分离培养及其生物学特性的初步研究

目的建立成人骨髓间充质干细胞（MSCs）体外培养和扩增的方法，探讨其生物学特性，建立稳定的MSCs体外培养扩增体系。方法取正常成人骨髓5ml，用Pereoll分离液（密度1．073g／ml）经密度梯度离心法分离得到单个核细胞，以2×10^5个细胞／cm^2的密度接种于含10％新生牛血清的LG-DMEM培养液。经培养、扩增后，应用倒置相差显微镜观察其形态，MTT法测定生长曲线，流式细胞仪行细胞表面抗原及细胞周期的检测，并在透射电镜下观察其超微结构。结果培养扩增获取的成人骨髓MSCs形态均一，为梭形或纺锤形的成纤维细胞样外观，生长曲线示其增殖能力强。流式细胞仪检测显示有90％以上的细胞处于G0／G1期，表面标记物中CD44表达阳性，而造血细胞表面标志CD3、CD4、CD7、CD13、CD14、CD15、CD19、CD22、CD33、CD34、CD45和与移植排斥发生密切相关的HLA—DR表迭阴性。超微结构显示细胞内有丰富的粗面内质网，细胞器发达。结论所建立的分离和培养方法可获取骨髓粘附细胞中一组独特的细胞群，具有MSCs的生物学特性，可作为组织工程中的种子细胞。     

类胰岛素生长因子Ⅰ在人鼻中隔软骨细胞体外培养中的作用

目的：为加速体外培养的人鼻中隔软骨细胞的增殖，观察类胰岛素样生长因子Ⅰ（IGF-Ⅰ）对体外培养软骨细胞的影响。方法：体外培养人鼻中隔软骨细胞，MTT法观察IGF-Ⅰ对软髓细胞增殖的影响；流式细胞仪检测IGF-Ⅰ对软骨细胞周期的影响；斑点杂交法了解IGF-Ⅰ对软骨细胞Ⅱ型胶原mRNA的影响。结果：IGF-Ⅰ浓度大于5ng/ml即可促进体外培养软骨细胞的增殖，缩短软骨细胞增殖周期，有助于Ⅱ型胶原mRNA的合成。结论：IGF-Ⅰ促进人鼻中隔软骨细胞增殖与缩短细胞周期有关，并可能通过促进软骨细胞Ⅱ型胶原mRNA的合成使软骨细胞保持表型稳定。     

人骨髓间充质干细胞亚群ZHJ-MAPCs特征表型及细胞遗传学分析

目的：对经过CD45，血型糖蛋白-A免疫微磁珠体外负分选纯化并传代培养的ZHJ-MAPCs进行体外部分细胞学鉴定，了解其特异性标志物表达及增殖、传代过程中的遗传学稳定性。 方法：实验于2004-01／12在珠江医院中心试验室完成。①原代冻存的ZHJ-MAPCs经复苏培养、传代。②利用流式细胞仪对其进行CD29，CD44，CD34和HIJA-DR流式细胞分析，以对照管作为空白定标，计算10000个细胞，记录标本的阳性细胞百分率。③分别在传代至第6代和第13代时进行细胞核型分析了解细胞核型变化。④细胞计数及细胞活力检测方法：细胞数／mL=四个大方格总数／4&;#215;104&;#215;稀释倍数。细胞存活率=5g/L锥虫蓝染色阴性细胞／100个细胞／高倍镜&;#215;100。 结果：①流式细胞仪检测结果：流式细胞仪检测ZHJ-MAPCs中CD29阳性表达细胞比率为99．2％，CD44阳性细胞比率为98.3％，CD34阳性细胞比率为1．2％，HLA-DR阳性细胞比率为5.3％。②细胞核型分析结果：ZHJ-MAPCs在增殖传代过程中表现出非正常二倍体特征，染色体于系数目在第6，13代均为55～58条，占80％，染色体数介于超二倍体和亚三倍体之间，镜下见细胞均发生染色体变异，且变异形态多样。 结论：①ZHJ-MAPCs具有骨髓间充质干细胞的特征及较高的纯度。②ZHJ-MAPCs在增殖传代过程中表现出非正常二倍体特征，染色体数介于超二倍体和亚三倍体之间．染色体变异形态多样。     

碱性成纤维细胞生长因子对培养的半月板纤维软骨细胞的促进增殖作用

目的：研究碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)对培养兔纤维软骨细胞增殖的影响，探讨其作用机制。方法：培养1月龄新西兰兔半月板纤维软骨细胞，以1，10，100μg／L的bFGF作用细胞，以四氮甲基唑蓝(MTT)比色法检测细胞的增殖情况，并在10μg／L bFGF作用下，采用流式细胞技术进行细胞周期亚时相分析。结果：在1～100μg／L范围内bFGF对培养纤维软骨细胞的增殖均有促进作用，10μg／L bFGF即可有显著效果。实验组细胞周期较对照组明显缩短，DNA合成前期(G1期)，DNA合成期(S期)和分裂前期及分裂期(G2M)的时间分别为14．58，12．30，11．43h，对照组分别为22．77.17．90，20．62h。结论：bFGF对培养的半月板纤维软骨细胞增殖有促进作用，能缩短纤维软骨细胞DNA合成G1期及G2M期，从而缩短细胞周期、促进细胞分裂增殖。     

骨髓间充质干细胞的生物学特性及其向心肌样细胞的分化

【目的】体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs),分析其生物学特性;5-氮胞苷(5-Azacytidine,5-aza)定向诱导其向心肌细胞分化。【方法】采用体外密度梯度离心法分离培养大鼠骨髓单个核细胞,流式细胞仪检测细胞表面标志;用含有5-aza(10μmol/L)的培养液培养第二代MSCs24h,诱导其向心肌细胞分化;诱导4周后采用免疫荧光技术检测心肌细胞特异性标志物Connexin 43和TroponinⅠ的表达。【结果】体外分离培养的细胞形态主要为纺锤形和长梭形,细胞表面抗原CD29、CD44表达为阳性,CD34、CD45表达为阴性;经5-aza诱导后细胞表达心肌细胞特异蛋白Connexin 43和TroponinⅠ。【结论】MSCs是存在于骨髓中的多能干细胞,体外经5-aza诱导可以定向分化为心肌样细胞。MSCs为心血管疾病的治疗提供了种子细胞。     

人脐带血间充质干细胞体外分离培养研究

目的:探讨人脐带血来源间充质干细胞体外分离及培养方法.方法:采用Ficoll-paque(1.077 g/ml)分离液密度梯度离心法结合直接贴壁分离人脐带血单个核细胞中间充质干细胞(MSCs),20?S/DMEM培养,培养至48 h换液并将其上清加入另一培养皿继续培养.观察2个时期细胞贴壁情况;应用流式细胞仪检测各时期细胞.结果:密度梯度法分离来脐血单个核细胞进行培养,可观察12 h即可见少量细胞贴壁生长,绝大部分MSCs在96 h内完成贴壁,经传代纯化第1、2个48 h贴壁细胞均可培养出形态呈较均一长梭形细胞.流式细胞仪检测:单个核细胞中CD44 细胞比例占7.1%、CD34 占28.9%,而在第1个48 h贴壁细胞CD44 、CD34 比例分别占47.2%、6.7%;而第2个48 h贴壁细胞CD44 、CD34 分别占53.3%、4.6%.结论:人脐血间充质干细胞能在体外分离培养,贴壁细胞稳定表达MSCs相关抗原.     

成人骨髓间充质干细胞体外培养扩增的初步研究

目的:建立成人骨髓间充质干细胞(mesenchymalstemcells,MSCs)体外培养和扩增的方法,探讨其生物学特性,建立稳定的MSCs体外培养扩增体系。方法:取正常成人骨髓,用含10%新生牛血清的LG-DMEM培养液培养、扩增后,进行倒置显微镜观察,测定生长曲线,流式细胞仪行细胞表面抗原检测。结果:培养扩增获取的成人骨髓MSCs形态均一,增殖能力强。所获得细胞CD44表达阳性,CD19、CD15、CD45、CD34、CD38、CD4、CD8表达阴性。结论:所建立的分离和培养方法可获取骨髓黏附细胞中一组独特的细胞群,具有MSCs的生物学特性。     

体外分离培养兔脂肪干细胞的生物学特性

目的：建立兔脂肪干细胞的体外分离培养方法，鉴定并分析其生物学特性。方法：实验于2005—06／2006—03在华中科技大学同济医学院附属同济医院骨科实验室和同济医院中心实验室完成。选用雌性新西兰大白兔，兔龄4个月，无菌取出雌兔双侧腹股沟脂肪垫，贴壁法及Ⅰ型胶原酶法分离出兔脂肪干细胞，并进行体外培养，取5代以后的兔脂肪干细胞观察其形态特征，并绘制细胞生长曲线及倍增时间，同时进行细胞过氧化物酶、苏丹黑B、碱性磷酸酶、α-醋酸萘酚酯酶与糖原化学染色；用流式细胞仪检测其细胞表面标志并进行细胞周期分析。结果：①兔脂肪干细胞原代及传代细胞形态：原代及传代的兔脂肪干细胞均呈长梭形或多边形贴壁生长，生长分化活跃。②兔脂肪干细胞的生长曲线及倍增时间：传代的兔脂肪干细胞生长曲线呈“S”形，群体倍增时间为22h。③兔脂肪干细胞的化学染色特点：兔脂肪干细胞的过氧化物酶、苏丹黑B染色呈阴性，而碱性磷酸酶、α-醋酸萘酚酯酶与糖原染色呈阳性。④兔脂肪干细胞表面标志及细胞周期：流式细胞仪检测结果显示兔脂肪干细胞的表面标志物CD29，CD44，CD90，CD15，CD166表达阳性，而CD31，CD34，CD45和CD106表达阴性。细胞周期分析显示，G0／G1期占80．25％，G2/M期占6．03％，S期占13．72％。结论：本次实验所分离出来的兔脂肪干细胞在体外具有生长稳定，增殖较快的特点。     

体外培养成人脂肪间充质干细胞生物学特性及向心肌样细胞的诱导分化

目的：体外分离培养成人脂肪组织来源的间充质干细胞，探索其基本生物学特性及向心肌细胞诱导分化的潜能，为心肌再生提供理想的自体干细胞来源方法：实验于2005—01／12在解放军兰州军区兰州总医院医学实验中心完成。取本院微创外科中心一急性单纯性阑尾炎患者大网膜脂肪组织（取得家属同意并告知仅用作实验室研究）。体外分离成人脂肪组织来源的间充质干细胞并传代扩增培养。采用相差显微镜及透射电镜观察细胞形态学特点，四氮唑蓝比色法绘制细胞生长曲线，流式细胞仪测定细胞周期及CD44、CD34的表达，第4代细胞用5-氮胞苷诱导使其向心肌细胞分化，免疫细胞化学鉴定心肌样细胞。 结果：①分离培养的脂肪间充质干细胞经传代纯化后细胞形态呈均一梭形生长，电镜显示细胞较为幼稚，核大，核仁明显，常染色质多，异染色质少，细胞器结构及种类简单，以粗面内质网和线粒体为主。②细胞生长曲线呈“S”形，第1和2天为细胞生长潜伏期，第3天开始进入对数生长期，第7天达顶点，群体细胞倍增时间为18～20h。③流式细胞仪检测91．83％细胞CD44表达阳性、CD34阴性。④细胞周期分析显示76．2％细胞处于G0／G1期，S期细胞占8．7％，G2／M细胞占15．1％。⑤5-氮胞苷诱导后4周免疫细胞化学显示部分细胞缝隙连接蛋白-43表达阳性，表达率约为（29．0&;#177;1．2）％。 结论：成人脂肪组织存在细胞活力旺盛的间充质干细胞且易于体外分离扩增，并在体外一定条件下具有向心肌细胞分化的潜能，可望成为心肌再生医学理想的自体干细胞种子来源。     

大鼠骨髓MSCs表面分子检测及诱导分化研究

目的通过建立大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）的体外分离培养方法，探讨大鼠MSCs表型特征以及多向分化潜能。方法利用密度梯度离心法结合贴壁培养法分离纯化SD大鼠骨髓MSCs，传代扩增，进行形态学观察，测定生长曲线。免疫细胞组织化学及流式细胞分析检测细胞表面分子的表达。定向诱导MSCs向脂肪细胞、成骨细胞及软骨细胞分化。结果原代分离的MSCs在接种后48h贴壁，细胞形态为椭圆形，多角形及短梭形，12天时细胞呈长梭形并达到90％单层融合。经传代扩增，细胞进一步纯化，细胞形态为均一的长梭形并呈漩涡状排列，而且生长速率加快，Pl代细胞群体倍增时间为20．3h。细胞免疫组化结果显示P2代细胞表面分子CD44、FN表达阳性，而CD14、CD34阴性，流式细胞检测CD44、FN阳性率分别为92．09％和90．55％。不同诱导剂定向诱导2周，经油红O、阿新兰及茜素红S染色鉴定，P3代MSCs分别向脂肪细胞，软骨细胞及成骨细胞分化。结论通过密度梯度离心结合贴壁筛选方法，体外分离培养的大鼠骨髓MSCs具有很强的增殖能力，并保持稳定的表型特征及多向分化潜能。     

骨髓基质细胞表面CD40分子配基化促进IL-6和Flt3配体的释放及其作用

目的：分析人骨髓基质细胞（BMSC）CD40分子及其配体（CD40L）的表达，观察BMSC经CD40激发型单抗（5C11）激发后，其培养上清中IL－3、IL－6、Flt3配体（FL）和干细胞因子（SCF）含量变化及对纯化脐血CD34^ 细胞的作用。方法：新鲜分离人骨髓单个核细胞，经体外培养获得BMSC。间接免疫荧光标记，流式细胞仪分析细胞表面CD40和CD40L的表达，并与5C11（20μg/ml）共同孵育，分别于24，48和72h取上清液，ELISA法测定IL－3、IL－6、FL和SCF含量；在与5C11共同培养24h后，收取培养上清，与纯化的脐血CD34^ 细胞共同孵育，1周后进行细胞计数、细胞集落培养，并用钙磷脂结合蛋白（Annexin V)标记，流式细胞仪分析细胞凋亡。结果：发现BMSC表达CD40分子，经5C11激发后，BMSC IL－6和FL分泌增加，而对IL－3及SCF含量无影响。BMSC经5C11激发培养后支持脐血CD34^ 细胞的增殖，培养7d后其细胞数和集落数显著多于对照组，且细胞凋亡率低，二者差异有显著性（P＜0．01）。结论：BMSC CD40分子配基化可促进IL－6和FL的分泌，并支持CD34^ 细胞的增殖，CD40／CD40L可能通过调节细胞因子的释放参与造血调控。     

人脐血间充质干细胞分离、培养及向成骨细胞分化的实验研究

目的探讨脐血间充质干细胞(MSCs)的分离培养及向成骨细胞的分化潜能。方法从足月儿脐血中获得间充质干细胞,体外培养传代,流式细胞检测细胞表面及抗原细胞周期;1.0×10-8mol/L地塞米松,2.0×10-4mol/L抗坏血酸,7.0×10-3mol/Lβ-磷酸甘油的IMDM培养基对MSCs进行诱导向脂肪细胞分化,von-Kossa染色鉴定。结果成功建立了脐血间充质干细胞分离及培养扩增的方法;流式细胞仪检测结果显示,贴壁细胞均表达CD105、CD29和CD44,不表达造血细胞表型CD34、CD45和内皮细胞表型CD31;经脂肪培养液诱导后细胞间可见黑色矿化物沉积阳性。结论脐血间充质干细胞能进行体外分离培养,并能诱导分化为成骨细胞。     

TLR2配体肽聚糖对骨髓间充质干细胞增殖和细胞周期的影响

本研究探讨不同剂量的Toll样受体2（TLR2）的配体肽聚糖（peptidoglycan,PGN）在体外对人骨髓间充质干细胞（BM—MSC）增殖和细胞周期的影响。采用Ficoll淋巴细胞分离液、密度梯度离心法分离BM—MSC,体外扩增,并通过流式细胞术检测其表面标志以鉴定纯度;将分离培养的BM—MSC按一定浓度接种于96孔板中,以1、10、20μg/ml的PGN与BM—MSC共培养为实验组,不加PGN的BM—MSC为对照组;培养第1至第7天,MTT法检测BM—MSC的增殖情况;以上述浓度的PGN与BM—MSC共培养72小时后,流式细胞术检测BM—MSC的细胞周期。结果表明,BM—MSC与PGN共培养后,BM—MSC的增殖指数明显增加,呈时间、剂量依赖性,以10μg／ml PGN促BMMSC增殖作用最明显。与对照组比较,PGN干预组G0／G1期细胞比例降低,S期和G2／M期细胞比例增加,以10μg／ml组最明显。结论：在培养条件下PGN可以促进更多的BM—MSC进入DNA合成期,从而有更多的细胞分裂,产生大量的增殖细胞,并且这种影响呈时间、剂量依赖性。     

中药诱导大鼠骨髓间质干细胞分化的实验

背景：体外定向诱导分化可使骨髓间质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)转化为成骨细胞、脂肪细胞、软骨、肌肉细胞、神经元样细胞等，而中药是否能对大鼠骨髓间质干细胞有诱导分化作用呢.目的：研究SD大鼠MSCs体外扩增培养及用中药定向诱导分化为神经元样细胞的功效。设计：以细胞为研究对象，重复观察测量，探索性研究.单位：一所医学院病理生理学教研室。材料：实验用骨髓取自经检验健康的SD雄性大鼠。方法：通过贴壁法分离大鼠MSCs，体外扩增培养，流式细胞仪检测其表面抗原表达，多种中药成分定向诱导MSCs分化为神经元样细胞。光镜下观察细胞形态，免疫细胞化学法检测神经细胞特异性抗原标志：主要观察指标：①MSCs分离和扩增结果。②MSCs表面抗原及神经元样细胞鉴定结果。结果：大鼠MSCs可通过贴壁法成功分离并可在体外大量扩增。流式细胞仪检测结果显示CD14，CD11α，C34，CD38，CD45，CD80，CD86为阴性，CD29，CD44，CD90，CD105，CD166呈阳性。黄芪、天麻、人参、当归、脑新舒、人参蜂王浆等多种中药诱导1～3h后大部分MSCs转变为神经元样细胞，出现胞体和突起，免疫细胞化学染色神经元特异性烯醇酶、巢蛋白呈阳性，胶质纤维酸性蛋白阴性。结论：SD大鼠骨髓间质干细胞是具多向分化潜能的细胞，具有较强的增殖、自我更新能力。在适宜的诱导条件下，可以分化为神经元样细胞。