大鼠骨髓间充质干细胞的分离与培养贴壁分离和消化控制相结合可否为简便高效的技术方法

目的:对骨髓间充质干细胞的培养一般采用流式细胞仪分离法及密度梯度离心法和免疫磁珠分离法,本实验观察了采用贴壁分离和消化控制相结合方法分离纯化的可行性。方法:实验于2004-09/12在锦州医学院附属第一医院外科实验室完成。选取6～8周龄的SD大鼠,雌雄不限,从其股骨、胫骨中取材,在无菌条件下操作,用剪刀分别剪去股骨胫骨的两端,暴露骨髓腔,用含有体积分数为0.15的胎牛血清Dulbecco改良培养基从骨髓腔中冲出骨髓于平皿中,用含有体积分数为0.1的胎牛血清的Dulbecco改良培养基培养,用消化控制及贴壁分离法分离纯化骨髓间充质干细胞,并观察其生长状态,测定骨髓间充质干细胞的生长曲线,分裂指数,贴壁率,用免疫细胞化学方法对骨髓间充质干细胞进行表型分析。结果:原代培养的骨髓间充质干细胞呈椭圆型、短梭型、长梭型、多角型等。纯化、扩增后骨髓间充质干细胞呈均匀一致的长梭型,第6代前生长性状稳定,增殖能力强。传代周期为7d,每次传代时细胞活力测定均>97%,传代后24h内贴壁率99%。免疫细胞化学检测第3代细胞均匀表达CD54(ICAM-1)、纤维连接蛋白。结论:实验建立了一种可行的大鼠骨髓间充质干细胞取材、纯化、扩增方法。培养的骨髓间充质干细胞纯度高,细胞活力强,生物学性状稳定。本实验通过贴壁分离和消化控制相结合的培养方法具有操作简便,条件要求低等优点,是目前一种比较理想的分离纯化方法。     

兔骨髓间充质干细胞的分离、培养与鉴定

背景：目前对骨髓间充质干细胞常用的分离方法有密度梯度离心法、贴壁筛选分离法。目的：联合应用密度梯度离心法和贴壁筛选分离法体外分离培养、扩增兔骨髓间充质干细胞，并对其进行鉴定。设计、时间及地点：对比观察的细胞学实验，于2007-10／2008-03在上海市第六人民医院中心实验室完成。材料：2月龄新西兰纯种大耳白兔6只用于骨髓间充质干细胞取材与原代培养，1．073kg／L的Percoll分离液。方法：实验采用Percol分离液利用密度梯度离心法及结合贴壁分离筛选法来分离、纯化骨髓间充质干细胞，在采用密度梯度离心法得到骨髓间充质干细胞后，经贴壁培养及反复换液纯化骨髓间充质干细胞。分别取第3，5，7，9代骨髓间充质干细胞，行细胞计数，绘制细胞生长曲线。主要观察指标：倒置显微镜下观察原代及传代细胞的形态、生长情况。采用CD44及CD34抗体进行间接免疫荧光标记鉴定培养的干细胞。CD44染色呈阳性，CD34染色呈阴性，说明所提取、纯化的细胞是骨髓间充质干细胞。结果：增殖传代的骨髓间充质干细胞呈长梭形均匀分布生长，形态比原代培养的细胞更均匀，细胞生长旺盛、增殖迅速，胞核明显，核仁清晰，核浆比例大，细胞形态均匀，平行排列呈螺旋状或漩涡状，传代至第5代时无明显变化。随传代次数的增加，细胞增殖能力逐渐下降，第3～5代细胞增殖能力强。所分离培养的细胞均表达CD44，不表达CD34。结论：在体外采用密度梯度离心及贴壁培养法可获得高纯度的兔骨髓间充质干细胞。     

全骨髓贴壁并差速传代分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞:与密度梯度离心法的比较

背景:目前国内外分离纯化骨髓间充质干细胞有两种主要方法;密度梯度离心法及全骨髓贴壁法,前者步骤较复杂,后者简单易操作,但纯化效果不理想.目的:在全骨髓贴壁分离骨髓间充质干细胞基础上,并用差速传代消化法,建立大鼠骨髓间充质干细胞体外分离培养纯化方法.方法:全骨髓贴壁培养法分离并差速消化传代大鼠骨髓间充质干细胞,利用间充质干细胞在消化传代过程中较其他骨髓细胞消化悬浮速度快,以及贴壁快的特点,代替密度梯度离心操作来分离纯化间充质干细胞,对其形态学特征进行观察,并与密度梯度离心法比较两种分离培养法的细胞生长增殖情况;观察碱性磷酸酶及油红染色情况,验证骨髓间充质干细胞的分化能力;检测细胞表面标记物,验证免疫特性及检测其纯度.结果与结论:全骨髓贴壁培养法分离并差速传代大鼠骨髓间充质干细胞,流式细胞鉴定、成骨成脂肪培养结果显示其细胞免疫特性、纯度、分化能力与密度梯度离心法无显著差异,但细胞活力,增殖能力有明显提高.     

大鼠骨髓间充质干细胞体外分离培养与CM-DiI荧光标记

背景：目前,对骨髓间充质干细胞的分离、纯化和扩增还没有统一的、标准化的方法。CM-DiI作为荧光标记物稳定、可靠、标记率高、标记简便。 目的：建立SD大鼠骨髓间充质干细胞体外分离培养及标记的方法。 方法：取2只体质量50-100 g雄性SD大鼠,无菌条件下采集双侧股骨、胫骨骨髓,用全骨髓贴壁分离法和密度梯度离心法培养出原代骨髓间充质干细胞,通过及时、反复传代对细胞进行扩增纯化,在体外用荧光活性染料CM-DiI标记第3代骨髓间充质干细胞后作为供体细胞来源。 结果与结论：用全骨髓贴壁分离法和密度梯度离心法两种方法均能成功体外分离培养骨髓间充质干细胞,经流式细胞仪分析,培养出的细胞CD34阳性率为17.5%,CD44阳性率为97.9%、CD90阳性率为91%,与骨髓间充质干细胞表面抗原一致。但培养出的细胞数量全骨髓贴壁分离法明显多于密度梯度离心法,两种方法培养骨髓间充质干细胞的细胞活力和增殖能力无明显差异。CM-DiI能够成功荧光标记骨髓间充质干细胞, CM-DiI作为荧光标记物稳定、可靠、标记率高、标记简便。     

全骨髓法体外培养分离大鼠骨髓间充质干细胞及PKH26标记

背景：要获得动物实验需要的标记大鼠骨髓间充质干细胞,体外培养、扩增和示踪已成为实验的关键环节。目的：采用全骨髓培养分离大鼠骨髓间充质干细胞,以及PKH26对其体外标记,建立一种方便、实用的分离培养并示踪骨髓间充质干细胞的方法。方法：通过全骨髓培养分离法纯化大鼠骨髓间充质干细胞。经传代扩增,细胞进一步纯化。取第3代大鼠骨髓间充质干细胞按PKH26标记程序进行标记后培养,荧光显微镜下观察标记后细胞生长状态、萤光强度变化和传代培养效果。利用四唑盐比色法测定标记后骨髓间充质干细胞的生长曲线。结果与结论：全骨髓培养分离法能成功获得纯度高的骨髓间充质干细胞,用PKH26标记后的骨髓间充质干细胞呈红色荧光,体外连续传代培养3代后,细胞荧光强度逐渐减弱。PKH26标记骨髓间充质干细胞的生长形态、生长活力不发生改变。结果证实全骨髓培养分离法简便易行,能获取较高纯度的生长增殖状态良好的骨髓间充质干细胞,PKH26荧光标记大鼠骨髓间充质干细胞是一种有效、实用的方法。     

豚鼠骨髓间充质干细胞的分离培养及成骨诱导

背景:利用骨髓间充质干细胞的取材灵活性及快捷性,对已掌握的培养技术及成骨诱导进一步探索性研究。目的:通过建立豚鼠骨髓间充质干细胞的体外分离培养法,探讨豚鼠骨髓间充质干细胞表型特征以及多项分化潜能。方法:利用贴壁培养法分离纯化豚鼠骨髓间充质干细胞,传代扩增,流式细胞分析检测细胞表面分子CD29、CD44、CD45的表达。分别采用成骨诱导培养液和成脂诱导培养液定向诱导骨髓间充质干细胞向脂肪细胞、成骨细胞分化。结果与结论:原代分离的骨髓间充质干细胞在接种后96h贴壁,细胞形态为椭圆形,多角形及短梭形,8d时细胞呈长梭形并达到90%单层融合。经传代扩增,细胞进一步纯化,细胞形态为均一的长梭形并呈漩涡状排列,而且生长速率加快。流式细胞检测CD29、CD44阳性率分别为95.7%和65.7%。不同诱导剂定向诱导后,经油红O、茜素红S、碱性磷酸酶染色、免疫组织化学Ι型胶原酶鉴定,P3代骨髓间充质干细胞分别向脂肪细胞及成骨细胞分化。结果表明,通过贴壁筛选方法,体外分离培养的豚鼠骨髓间充质干细胞具有很强的增殖能力,并保持稳定的表型特征及多向分化潜能。     

大鼠骨髓间充质干细胞的培养与鉴定

背景：骨髓间充质干细胞在骨髓中含量极低,体外培养难度较大。体外分离培养纯度高、活力强、生物特性均一的间充质干细胞,对组织工程及细胞的体内、体外实验显得至关重要。目的：建立大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养、纯化方法,并进行细胞形态学观察、表面标志物鉴定及多向分化能力检测。方法：通过全骨髓贴壁法体外分离、培养、纯化大鼠骨髓间充质干细胞,进行形态学观察,绘制生长曲线,细胞周期分析,流式细胞仪检测细胞表面标记物,分别向成骨、成脂方向诱导分化。结果与结论：大鼠骨髓间充质干细胞生长以梭形细胞为主,呈放射状排列的细胞集落,细胞生长旺盛,可连续稳定传代10代以上。生长曲线及细胞周期显示骨髓间充质干细胞符合正常细胞生长特征且生长活跃。第3代骨髓间充质干细胞CD44,CD90,CD105均呈阳性表达,而CD34,CD45呈阴性表达。成脂、成骨诱导后,油红O染色、碱性磷酸酶染色、von Kossa法染色和茜素红染色均呈阳性。全骨髓贴壁培养法操作简单,可大量分离、纯化、扩增骨髓间充质干细胞,所获细胞具有间充质干细胞的一般生物学特性,经诱导培养后具有多向分化潜能。实验所用的全骨髓贴壁法法为组织工程提供充足的种子细胞来源具有重要的现实意义。     

兔骨髓间充质干细胞体外分离培养条件的优化组合

背景：骨髓间充质干细胞分离培养方法的不同可导致其活性与纯度各异，直接影响组织工程的修复效果。目的：对骨髓间充质干细胞体外分离培养条件进行优化组合，并验证其获取骨髓间充质干细胞的效果。设计、时间及地点：细胞学体外实验，于2007-10／12在山西医科大学第二医院骨科实验室完成。材料：清洁级3月龄新西兰白兔2只，由山西畜牧研究所提供。方法：向含有新鲜骨髓的DMEM培养液中加入等量淋巴细胞分离液，采用密度梯度离心和差速贴壁法分离培养兔骨髓间充质干细胞，每间隔8h将未贴壁细胞转移入新的培养瓶，接种5d后首次换液，细胞融合率达90％时胰酶消化传代，第1、3、5代细胞用于实验。主要观察指标：镜下观察细胞形态及生长状态，绘制细胞生长曲线，测定倍增时间，流式细胞仪检测细胞表面抗原CD44标记率。结果：原代培养的骨髓间充质干细胞呈圆形、梭形、多角形等，48h可见贴壁细胞有伸展现象，呈梭形，多角形，成纤维细胞样展开，细胞核清晰，首次换液后可见细胞透亮并充分展开，14d左右可达90％融合。第1、3、5代骨髓间充质干细胞整体呈S型，1～3d为潜伏期，3d后进入对数生长期，7～8d为平台期，平均倍增时间为24．22h。第2代骨髓间充质干细胞CD44呈阳性表达，标记率为93．0％。结论：采用密度梯度离心联合差速贴擘、离心介质选择淋巴细胞分离液、接种5d首次换液的体外分离培养纯化方法，获得的骨髓间充质干细胞生长状态良好，且纯度较高。     

兔骨髓间充质干细胞分离培养后的活力检测

背景：目前分离纯化骨髓间充质干细胞多采用单一的方法,对扩增培养过程中细胞活力的变化没有较为系统而全面的评估。目的：探索体外分离培养和纯化兔骨髓间充质干细胞的方法,并对细胞的活力进行检测。方法：采用密度梯度离心联合贴壁筛选的方法分离纯化兔骨髓间充质干细胞,从形态学、细胞表型和成骨成脂能力方面进行鉴定;并从细胞生长曲线、贴壁率和克隆形成率3个方面评估细胞活力。结果与结论：原代细胞多呈梭形和圆形,48h后大部分细胞贴壁,8-10d细胞融合达80%-90%,传代周期为3-5d;流式检测显示CD14、CD34和CD45表达阴性,CD29、CD44和CD90表达阳性;成骨诱导茜素红染色可见明显的钙结节,成脂诱导油红O染色可见大量脂肪细胞;细胞生长曲线、贴壁率及克隆形成率的结果表明第1代和第3代细胞的活力优于第5代细胞。结果说明密度梯度离心联合贴壁筛选的方法能够有效的分离纯化骨髓间充质干细胞,并能较好的保持其生物功能,在扩增传代过程中,细胞活力会有不同程度的下降。     

人骨髓间充质干细胞的贴壁分离与体外培养

目的:验证贴壁方式分离人骨髓间充质干细胞,并进行体外扩增培养的可行性。方法:实验于2006-02/12在解放军济南军区总医院脊髓修复科完成。①实验材料:骨髓来源于解放军济南军区总医院脊髓修复科收治的脊髓完全性损伤患者,对本实验知情同意。基础培养液由含体积分数为0.15胎牛血清和低糖α-MEM配置。②实验方法:无菌条件下髂后上棘穿刺抽取骨髓组织6mL,进行细胞培养,观察细胞生长情况,待细胞融合成片、长满培养瓶底部后,用质量浓度为2.5g/L的胰蛋白酶流过所有细胞表面。倒置显微镜下观察细胞变圆、部分脱壁后,立即加入有血清培养液终止消化。③实验评估:取第3代生长状态良好的细胞,胰蛋白酶消化制成细胞悬液,接种,以细胞数为纵坐标,时间为横坐标,绘制细胞生长曲线。同时每隔2h进行细胞贴壁率检测。结果:①骨髓间充质干细胞的形态学观察:倒置显微镜下,骨髓间充质干细胞接种1d即贴壁,去除悬浮细胞后继续培养3d贴壁细胞开始增殖,伸展为椭圆型、短梭型、多角型及不规则型等。至14d细胞密集在集落中心,基本铺满瓶底,第3～5代细胞呈均匀一致的长梭型,排列成旋涡状或放射状。②骨髓间充质干细胞的生长曲线:细胞传代后3d内处于潜伏期,3d后进入生长期,7d后进入平台期。③骨髓间充质干细胞的贴壁率:随着培养时间的延长,骨髓间充质干细胞贴壁率逐渐升高。传代后2,4,6,8,10,12,14,16,18,20h细胞贴壁率分别为(20.20±0.25)%,(33.00±0.29)%,(46.50±0.32)%,(69.20±0.30)%,(76.60±0.34)%,(86.50±0.27)%,(90.30±0.20)%,(96.10±0.28)%,(98.50±0.12)%,(99.00±0.07)%。结论:贴壁法分离骨髓间充质干细胞操作简便,经体外扩增培养后细胞增殖活性强,传代周期为7d,是比较理想的骨髓间充质干细胞培养方法。     

人骨髓间充质干细胞和汗腺细胞的体外分离与培养

背景：体外研究人骨髓间充质干细胞和汗腺细胞的分离培养与鉴定,可为探讨骨髓间充质干细胞再生汗腺的可行性打下基础。目的：探寻在体外分离培养骨髓间充质干细胞和汗腺细胞的有效方法。方法：采用直接贴壁法从成人骨髓中体外分离培养骨髓间充质干细胞,并进行扩增和鉴定。采用胶原酶消化法从人全层无烧伤皮肤中分离汗腺细胞,并进行扩增和鉴定。结果与结论：倒置显微镜下见分离培养的骨髓间充质干细胞呈梭形,折光性强,免疫细胞化学染色显示细胞表达CD29、CD105,高表达CD44,不表达造血干细胞表面标志CD34和CD45。汗腺细胞呈扁平多角形,表达汗腺细胞表面标志细胞角蛋白7,8,18,19和癌胚抗原。说明直接贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞和胶原酶消化法分离培养汗腺细胞是可行的。     

大鼠骨髓间充质干细胞体外分离及对原发性骨质疏松性骨折的实验研究

目的用全骨髓贴壁分离法分离培养骨髓间充质干细胞,通过建立原发性骨质疏松性骨折模型,探讨骨髓间充质干细胞对骨质疏松性骨折愈合情况。方法无菌条件下采集双侧股骨、胫骨骨髓,用全骨髓贴壁分离法培养出原代骨髓间充质干细胞,选取11周雌性SD大鼠60只,卵巢切除术(OVX)建立骨质疏松模型后,均做双侧骨折模型,随机分成对照组(OVX骨折不处理组)、生理盐水组(OVX骨折+生理盐水组)和细胞治疗组(OVX骨折+骨髓间充质干细胞治疗组),术后于第3天、第4、8周分别进行X-光扫描。结果全骨髓贴壁法成功分离出骨髓间充质干细胞,经流式细胞仪分析,培养出来的细胞与骨髓间充质干细胞表面抗原一致。X-光结果表明,细胞治疗组相比于其它组能加快骨质疏松性骨折愈合。结论体外分离大鼠骨髓间充质干细胞对原发性骨质疏松性骨折愈合有促进作用。     

分离培养方法及冻存技术对犬骨髓间充质干细胞生长和增殖的影响

背景：骨髓间充质干细胞在体外长期培养易发生自发分化，而失去多分化潜能，因此必须对培养的细胞及时冻存，需要时再进行复苏。目的：建立犬骨髓间充质干细胞体外分离、培养、增殖、冻存的方法。设计、时间及地点：对照观察细胞学实验，于2005-06／2008—06在浙江中医药大学附属第一医院骨伤研究所完成。材料：健康成年雄性Beagle犬用于骨髓间充质干细胞的提取。方法：采用密度梯度离心法结合贴壁培养法分离纯化骨髓间充质干细胞，并进行传代扩增培养。将第2代骨髓间充质干细胞与12．5％DMSO混匀置于冻存管中，采用慢冻快融法进行冻存和复苏：将冻存管置于-4℃冰箱2h，然后移入-30℃冰箱2h，再置于厚壁塑料泡沫盒中，扎紧密封，置-80℃冰箱过夜后，取出冻存管直接放入液氮中保存，或放入-80℃冰箱保存。复苏时将冻存管从液氮或80℃冰箱中取出，立即置37℃水浴并轻轻摇动，1-2min内迅速解冻。主要观察指标：复苏前后细胞成生长活性及形态变化。结果：分离的骨髓间充质干细胞为以均一的梭形的成纤维细胞样贴壁生长，贴壁及增殖能力强，传代细胞贴壁较快。经过液氮长期冻存后，将复苏后的骨髓间充质干细胞再培养，细胞形态及生长状态与冻存前无差异，均呈长梭形均匀分布生长，细胞生长增殖旺盛。结论：采用密度梯度离心法结合贴壁培养法町获得犬骨髓间充质干细胞，应用慢冻快融技术进行冻存和复苏，较好的保持了冻存细胞的活力和功能。     

全骨髓贴壁接触培养SD大鼠骨髓间充质干细胞

背景：体外分离培养出生长状态好、高纯度、增殖能力强和数量充足的大鼠骨髓间充质干细胞,是将其作为种子细胞用于组织和细胞移植的重要前提。 目的：建立简便、快速、有效的SD大鼠骨髓间充质干细胞体外分离培养方法,并观察其生物学特性。 方法：采用全骨髓法将 SD 大鼠双侧股骨和胫骨骨髓细胞进行体外分离培养,贴壁接种法进行细胞纯化、传代。观察细胞生长形态及特征,绘制细胞生长曲线,检测细胞表面标记物,采用体外诱导剂诱导细胞分别向成骨、成软骨、成脂方向分化。 结果与结论：全骨髓贴壁接种法分离培养的骨髓间充质干细胞生长旺盛、纯度高,细胞生长形态呈长梭形,极性排列,细胞生长呈S形生长曲线,群体倍增时间为29 h,细胞在连续传10代后仍具有较强的增殖能力。第3代骨髓间充质干细胞的表面标记物CD44、CD29、CD90均呈阳性表达,CD45、CD34、CD11b则呈阴性表达。第3代骨髓间充质干细胞分别经成骨、成软骨、成脂诱导剂诱导后,茜素红染色、碱性磷酸酶染色、von-kossa矿化结节染色、甲苯胺蓝染色和油红O染色均呈阳性。结果验证全骨髓贴壁接种法是一种简便可靠的体外分离培养方法,能获得纯度较高的骨髓间充质干细胞,经实验鉴定第3代骨髓间充质干细胞生物活性最佳,且具有多向诱导分化能力,适合作为后续实验的种子细胞。     

脐血间充质干细胞的分离培养及生物学特性

背景：脐血富含干细胞,刺激后进入细胞周期的速度以及自泌生长因子的能力均强于骨髓及外周血干细胞。目的：建立一种分离纯化、培养扩增脐血间充质干细胞的方法,并观察体外培养脐血间充质干细胞的生物学特性。方法：密度梯度离心,贴壁培养和消化时间控制相结合,分离纯化脐血间充质干细胞。观察细胞形态,绘制细胞生长曲线,应用流式细胞仪测定细胞周期,以免疫组织化学法（SP 法）测定 CD29,CD44,CD34。采用体积分数 20%马血清诱导脐血间充质干细胞分化为脂肪细胞,以油红 O 染色鉴定;0.1 μmol/L 地塞米松,10 mmol/L β-甘油磷酸钠和 50 μmol/L 抗坏血酸诱导脐血间充质干细胞分化为成骨细胞,以碱性磷酸酶染色鉴定。结果与结论：分离获得了高纯度贴壁生长的间充质干细胞,间充质干细胞呈梭形,细胞传代稳定,在体外连续传代培养 9 代,未发生形态学改变,无衰老征象。第 3 代间充质干细胞体外可以分化为脂肪细胞和成骨细胞。提示采用淋巴细胞分离液密度梯度离心,贴壁培养和消化时间控制相结合,可以获得纯度较高的脐血间充质干细胞,脐血间充质干细胞体外增殖和传代能力强。     

不同分离方法与培养条件下大鼠骨髓间充质干细胞生长增殖情况比较

目的:应用贴壁分离法和密度梯度离心法以不同培养条件观察纯化过程中对获得的骨髓间充质干细胞的影响,试图寻找获得高质量、高活性的骨髓间充质干细胞的培养条件。方法:实验于2005-09/2006-01在解放军第四军医大学实验动物中心实验部进行。①SPF级雄性Wistar大鼠18只,贴壁分离培养取12只,根据血清和培养基的不同分为4组:进口血清 DMEM组、进口血清 F12-DMEM组、国产血清 DMEM组、国产血清 F12-DMEM组,3只/组。密度梯度离心培养实验取剩余6只,以分离液的不同分为Ficoll分离液组、Percoll分离液组,3只/组。②骨髓取材:各组大鼠断颈处死后,无菌取双下肢,剔除股骨、胫骨周围肌肉组织,剪去骨干的两端,暴露骨髓腔,穿刺两侧骨端取出骨髓。③贴壁分离法:进口血清 DMEM组、进口血清 F12-DMEM组、国产血清 DMEM组、国产血清 F12-DMEM组大鼠分别采用相应的血清和培养基冲洗骨髓,制备单细胞悬液,接种于培养瓶中,5d后首次更换培养液,弃去未贴壁细胞,此后每3～4d换液1次。④密度梯度离心法:Ficoll分离液组选用的Ficoll分离液密度为1.077;Percoll分离液组将Percoll分离液与0.1mol/L磷酸盐缓冲液按9∶1比例混匀,密度为1.073。将两组大鼠骨髓置入离心管,离心弃上清,轻轻叠加到相同体积的各自对应分离液上,再次离心收集界面层白色混浊液,采用F12-DMEM培养液重悬细胞,按1×109L-1的密度接种于培养瓶中,培养条件与贴壁分离法相同。⑤指标检测:倒置显微镜下,每天观察贴壁分离、密度梯度离心不同培养条件下细胞的生长情况和活体形态特征。进行锥虫蓝排斥试验,蓝染细胞为死亡细胞,在3min内用计数板分别计数活细胞和死细胞,未被蓝染细胞所占细胞总数的百分比即为初步得到细胞活性的数据。两种分离方法均取生长良好的第3代细胞,以时间为横坐标,细胞数为纵坐标,绘制生长曲线。结果:18只大鼠均进入结果分析。①细胞形态观察结果:贴壁分离法:采用进口血清培养的两组细胞形态学上都表现为长梭形,细胞活性较高,且给予F12-DMEM培养基的细胞增殖较快,集落融合较早,传代所需时间短;采用国产血清培养的两组细胞中,给予F12-DMEM培养基可以获得梭形细胞,而给予DMEM培养基后则多为类圆形骨髓样细胞,仅见极少梭形细胞。密度梯度离心法:Ficoll分离液组和Percoll分离液组均可培养出梭形骨髓间充质干细胞,细胞活性均高,但集落融合、传代所需的时间均较贴壁分离法长。②细胞活性检测结果:贴壁分离法:进口血清 DMEM组、进口血清 F12-DMEM组、国产血清 DMEM组、国产血清 F12-DMEM组的活细胞率分别为98.3%,98.7%,97.1%,97.7%,组间比较差异无显著性意义(χ2=0.054～0.620,P均>0.05)。密度梯度离心法:Ficoll分离液组活细胞率与Percoll分离液组相似(96.9%,97.1%,t=1.066,P>0.05)。③第3代细胞生长曲线测定结果:不同培养条件下各组第3代细胞生长曲线基本相似,在培养1d时,细胞量稍有减少;4d后细胞数均迅速增长;8d进入平台期,细胞增殖减慢。结论:采用全骨髓贴壁分离法和密度梯度离心法,只要选择合适的培养条件均可获得骨髓间充质干细胞,但选用进口胎牛血清、F12-DMEM培养基效果较好。     

不同分离方法对骨髓间充质干细胞成软骨分化的影响

背景：目前并没有特定的实验对骨髓间充质干细胞分离的两种基本方法进行系统评估，所以贴壁分离法和密度梯度离心法对细胞诱导分化是否存在不同影响，尚无定论。目的：拟验证两种基本分离方法对骨髓间充质干细胞成软骨分化影响的差别。设计、时间及地点：对照观察实验，2005—03／09在中国医科大学附属盛京医院儿外实验室完成。材料：2-3月龄体质量1．2-2．0kg的日本大耳兔20只用于抽取骨髓。方法：用贴壁分离法和密度梯度离心法分离骨髓间充质干细胞。选择两组同代的骨髓间充质于细胞，用转化生长因子β1诱导其向软骨方向分化。主要观察指标：①倒置显微镜观察骨髓间充质干细胞的生长情况，绘制两组细胞生长曲线。②免疫组化检测两组Ⅱ型胶原表达。⑧原位杂交检测两组细胞Ⅱ型胶原mRNA表达。结果：绘制生长曲线表明两组细胞生长速度趋于一致。免疫组化法检测两种方法分离的骨髓骨髓间充质干细胞的软骨细胞分化率为76．1％和77．7％，原位杂交法检测的软骨细胞分化率为70．3％和71．0％，差异无显著性意义。结论：两种分离方法对骨髓间充质干细胞的生长和成软骨分化结果的影响无差异。     

贴壁法体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞的效果验证

背景:骨髓中的间充质干细胞含量不高,且随着年龄增加或体质衰弱,骨髓间充质干细胞的数量会逐渐减少.目的:验证贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞的效果.方法:大鼠麻醉后取双侧股骨和胫骨,剪去骨骺端,暴露骨髓腔,用含小牛血清的DMEM培养基冲洗骨髓腔,收集骨髓细胞,反复吹打制成单细胞悬液,接种后置于37 ℃、体积分数为5%的CO_2培养箱内孵育,24 h后全量换液,以后每周全量换液1次,筛选易贴壁但贴壁不牢的细胞进行传代培养.观察细胞形态,绘制细胞生长曲线,流式细胞仪及免疫细胞化学染色鉴定骨髓间充质干细胞表面标志的表达.结果与结论:培养24 h后细胞能够贴壁生长,呈梭形或三角形;第二三天贴壁细胞迅速增殖;培养15 d左右出现致密的贴壁细胞层,呈漩涡状生长或成簇生长.细胞在接种后2 d进入对数生长期,12 d左右进入平台期,约15 d细胞可铺满瓶底.分离培养的大鼠骨髓间充质干细胞CD90和CD54均呈阳性表达.结果验证了采用贴壁法可在体外成功分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,操作简单,造成污染的环节和机会较少,不需离心,可以更好的保持细胞活性.     

人骨髓间充质干细胞分离培养方法的改进

背景：当前分离培养骨髓间充质干细胞方法的有多种,但在外科手术中进行获取的方法仍然较少,而外科分离所得细胞对于相应疾病的具有揭示原因和提供研究线索的价值。目的：在骨科手术中以直接贴壁差速贴壁分离培养纯化与鉴定骨髓间充质干细胞。方法：在骨科关节置换等大手术中吸取少量人骨髓血,采用直接贴壁法分离骨髓间充质干细胞,在贴壁后36～48h行洗盘处理,并通过长期体外培养,特定培养基自身的筛选作用对细胞进行筛选,当细胞生长达到足量时进行鉴定。结果与结论：采用直接贴壁法能够在长骨髓腔内混合血中分离培养骨髓间充质干细胞并形成集落,其形态学表现和表面分子经鉴定符合骨髓间充质干细胞特点,能够获得符合要求的人骨髓间充质干细胞,从而进行后续实验。     

全骨髓法体外培养分离大鼠骨髓间充质干细胞及PKH26标记

背景:要获得动物实验需要的标记大鼠骨髓间充质干细胞,体外培养、扩增和示踪已成为实验的关键环节.目的:采用全骨髓培养分离大鼠骨髓间充质干细胞,以及PKH26对其体外标记,建立一种方便、实用的分离培养并示踪骨髓间充质干细胞的方法.方法:通过全骨髓培养分离法纯化大鼠骨髓间充质干细胞.经传代扩增,细胞进一步纯化.取第3代大鼠骨髓间充质干细胞按PKH26标记程序进行标记后培养,荧光显微镜下观察标记后细胞生长状态、萤光强度变化和传代培养效果.利用四唑盐比色法测定标记后骨髓间充质干细胞的生长曲线.结果与结论:全骨髓培养分离法能成功获得纯度高的骨髓间充质干细胞,用PKH26标记后的骨髓间充质干细胞呈红色荧光,体外连续传代培养3代后,细胞荧光强度逐渐减弱.PKH26标记骨髓间充质干细胞的生长形态、生长活力不发生改变.结果证实全骨髓培养分离法简便易行,能获取较高纯度的生长增殖状态良好的骨髓间充质干细胞,PKH26荧光标记大鼠骨髓间充质干细胞是一种有效、实用的方法.