大肠埃希菌MG1655 Lon蛋白酶编码基因敲除株的构建

目的构建Lon蛋白酶编码基因缺失的大肠埃希菌（E．coli MG1655）菌株。方法PCR扩增基因序列,该序列两端与Lon蛋白酶基因部分序列同源,中间部分为氯霉素抗性基因。电转化法将该片段转入大肠埃希菌MG1655。利用宿主菌-大肠埃希菌MG1655内pKIM6编码的入重组系统,以PCR产物中的氯霉素抗性基因替代靶基因-Lon编码基因。氯霉素抗性平板筛选阳性重组体,琼脂糖凝胶电泳和DNA测序两种方法鉴定lon敲除突变株。结果氯霉素抗性平板成功筛选出重组菌株,基因检测结果表明Lon编码基因被氯霉素抗性基因替代。结论本研究通过该方法成功获得了E．coliMG1655蛋白酶编码基因lon敲除突变株,为探讨大肠埃希菌Lon在牙菌斑形成中的作用奠定了基础。     

Ag43／GFP 嵌合表达质粒的构建及其在大肠杆菌表面的表达

目的：构建大肠杆菌抗原Ag43（pETAg43′）以及Ag43和绿色荧光蛋白（GFP）（pETAg43′／GFP）的重组表达质粒,了解pETAg43′／GFP是否能够将GFP表达于细菌表面。方法用PCR扩增获得Ag43大部分基因序列（ Ag43′）,同时用酶切方法从质粒pEGFP－C1切取GFP基因序列,首先将Ag43′基因序列插入表达质粒pET－22b中,获得重组质粒pETAg43′,然后再将GFP基因序列插入pETAg43′获得质粒pETAg43′／GFP。将重组质粒pETAg43′／GFP转化Ag43基因缺失的菌株JM109（△Ag43）,用荧光显微镜和SDS－PAGE了解是否能将GFP表达于细菌表面,同时了解加热是否能够直接获得Ag43′／GFP的嵌合重组蛋白。结果琼脂糖凝胶电泳发现PCR扩增的Ag43′和GFP基因序列分子量大小与预期值相一致,酶切分析重组质粒pETAg43′和pETAg43′／GFP结果与预期值相符,基因测序显示质粒pETAg43′和pETAg43′／GFP的基因序列和阅读框架均准确无误。质粒pETAg43′／GFP经诱导后可以将Ag43′／GFP嵌合蛋白表达于大肠杆菌JM109（△Ag43）的表面,55℃加热50 min是提取Ag43′／GFP嵌合蛋白的最佳条件。结论成功构建了能够将外源蛋白GFP表达于细菌表面的重组表达载体,在大肠杆菌表面有效表达并加热提取获得了嵌合重组蛋白Ag43′／GFP,为制备其他自身抗原分子的Ag43嵌合蛋白奠定了基础。     

hns基因对大肠埃希菌生物膜形成能力的影响

目的 建立大肠埃希菌Red重组系统无痕敲除方法,探讨hns基因对大肠埃希菌生物膜形成能力的影响.方法 以大肠埃希菌MG1655为研究对象,将pKD46质粒转化入MG1655感受态细胞.以质粒pKD3为模板扩增氯霉素抗性基因片段,并将其转化入MG1655/pKD46,氯霉素抗性平板筛选阳性克隆.利用pCP20质粒删除氯霉素抗性基因,构建MG1655 hns基因缺失菌株.96孔板结晶紫染色法分析MG1655 hns基因缺失株生物膜形成能力的变化.苯酚-硫酸法检测细菌胞外多糖含量.结果 氯霉素抗性基因消除后的hns基因缺失株PCR产物长度为434 bp,测序鉴定正确,成功构建MG1655 △hns基因缺失株.MG1655△hns菌株生物膜形成能力和胞外多糖产生显著低于MG1655(P＜0.01).结论 利用Red重组技术成功构建出MG1655△hns菌株,hns基因对细菌生物膜的形成具有重要的调控作用.     

大肠埃希菌qnrB耐药基因与细菌耐药的关系探讨

目的了解大肠埃希菌qnrB基因的流行状况及其与细菌耐药的关系。方法收集250株大肠埃希菌作为检测对象,qnrB阳性对照菌由某医科大学提供。分别进行qnrB基因扩增及序列测定、药敏试验和质粒结合试验。结果共有14株（5．6％）检出存在qnrB基因。而ESBLs阳性菌的检出株数为117株（46．8％）,且14株阳性株中有13株为ESBLs阳性。阳性质粒接合试验均接合成功,且可于选择平板或丙环沙星TSA琼脂上生长,表明qneB具有转移性。选取2例qnrB阳性扩增产物进行DNA测序,发现qnrB扩增片段为469bp,与GenBank数据库中qnrB基因的同源性为100％。结论qnrB基因在本市存在流行情况,且原因推测为抗生素的滥用。因此,应制定临床用药规范,杜绝抗生素的滥用。     

大肠埃希菌qnrA基因的检测

[目的]了解大连地区耐环丙沙星的大肠埃希菌中qnrA基因的流行情况并研究其耐药机制。[方法]收集临床分离的耐环丙沙星的大肠埃希菌213株,通过PCR法扩增qnrA基因,对qnrA基因阳性株,KB纸片法检测抗菌药的体外抗菌活性,琼脂稀释法测MIC,并进行质粒结合试验。[结果]213株菌中查到2株qnrA阳性菌株,测序结果与Genbank中qnrA基因比对吻合率达100%。其中一株对多种抗菌药耐药,另一株则比较敏感。[结论]大连地区检测到了qnrA基因阳性的菌株,耐药机制复杂,应引起临床重视。     

泌尿道致病性大肠埃希菌Ⅰ型PapG黏附素基因的扩增与分析

目的获得Ⅰ型黏附素代表菌株-泌尿道致病性大肠埃希菌（UPEC）J96 PapG全基因扩增片段并进行克隆子分析.方法设计合成一对可扩增Ⅰ型papG全长基因的PCR引物,采用长片段PCR扩增法获得该基因的扩增片段,以限制性内切酶酶解后克隆pUC18质粒载体.结果限制性酶谱、PCR和序列分析表明,所获得重组质粒pJG29中已带有Ⅰ型papG全长基因片段的克隆.结论所设计合成的引物和建立的PCR扩增法可用于大量获取并分析UPECⅠ型黏附素基因.     

大肠埃希菌耐药基因近年国内研究进展

本文就大肠埃希菌耐药基因近年国内研究进展进行扼要的阐述,包括β-内酰胺类药物耐药基因、氨基糖甙类药物耐药基因、喹诺酮类药物耐药基因、广谱抗菌药物耐药基因、消毒剂耐药基因耐药基因载体等。     

大肠埃希菌连续分离株耐药性与三类整合酶基因的研究

目的 了解大肠埃希菌连续分离株整合酶基因存在情况和耐药性。方法 应用聚合酶链反应（PCR）法对耐药的大肠埃希菌进行int I1、int I2、int I3三类整合酶基因检测与分析。结果 PCR结果显示：整合酶基因检测68株中int I1基因阳性47株（69．1％）,int I2基因阳性1株（1．5％）,无int I3基因阳性。结论 整合子在细菌耐药性播散过程中起非常重要的作用,整合子使细菌能够很快获得新的耐药基因以适应环境要求。     

mSpag9肾脏特异性基因敲除小鼠模型的构建与鉴定

目的:为研究支架蛋白JLP在肾脏中的生理功能,建立小鼠精子相关抗原(mSpag9)肾脏特异性基因敲除小鼠模型,为研究该基因所发挥的重要生理功能提供材料和思路。方法:构建mSpag9基因重组载体,通过电转打靶转染胚胎干细胞(ES细胞),将筛选出的阳性ES细胞克隆,经显微注射至超排小鼠的囊胚腔后移植于受体小鼠,从子代筛选嵌合体小鼠,与携带flp位点C57/BL6N小鼠杂交后得到mSpag9flox/+基因敲除小鼠,自交筛选出mSpag9flox/flox小鼠,再与KSP-CreERT2小鼠杂交得到mSpag9flox/flox-Cre肾脏特异性基因敲除小鼠并进行鉴定,待小鼠成长至5周,使用Tamoxifen(10 mg/mL葵花籽油溶解)腹腔注射(0.04 mg/g)诱导Cre重组酶特异性表达于肾小管上皮细胞。结果:经PCR扫描后得到10株阳性ES细胞克隆,其中6株使用Southern Blot鉴定;经显微注射后得到4只雄性、5只雌性嵌合体小鼠,与flp小鼠杂交后得到9只mSpag9flox/+基因敲除小鼠,将自交得到的mSpag9flox/flox小鼠与KSP-CreERT2小鼠交配筛选出mSpag9flox/+-Cre+3只小鼠,将其与mSpag9flox/flox小鼠回交得到基因型为mSpag9flox/flox-Cre+小鼠,即为mSpag9肾脏特异性基因敲除小鼠。结论:该模型利用Cre-Loxp系统实现基因mSpag9的基因打靶,Tamxifen诱导基因mSpag9实现该基因在肾小管上皮细胞上敲除,为进一步研究mSpag9基因及支架蛋白在肾脏生理病理进展中所发挥的作用提供工具。     

人工合成人恶性疟原虫58肽抗原基因在大肠杆菌中的表达

使用DNA合成仪合成的人恶性疟原虫58肽抗原基因,与大肠杆菌表达性载体质粒PWR450—Ⅰ重组,转化到大肠杆菌JM83中。用斑点杂交技术和电泳分析DNA方法筛选出阳性重组转化菌株,经SDS-聚丙烯酰胺凝胶蛋白电泳分析,证明合成基因在大肠杆菌中表达,产生与β—半乳糖苷酶融合的多肽。     

广范围高效的植物乙型肝炎病毒表面抗原表达载体构建及鉴定

目的构建含乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）基因的植物双元表达载体。方法采用高保真PCR方法从T—adr质粒扩出HBsAg基因，定向克隆到中间载体pUC18-DHA，经测序证实核酸序列正确后，再亚克隆到植物双元表达载体pGreen0029-GFP上，采用电击法将含HBsAg的植物表达载体转入根癌农杆菌中，并进行酶切证实。结果扩增的HBsAg片断亚克隆到中间载体，得到pUC18-HBsAg—DHA，测序证实HBsAg核酸序列正确，再与根癌农杆菌双元载体pGreen0029-GFP连接，获得含HBsAg基因的植物双元表达载体pGreen0029-HBsAg—DHA，转入根癌农杆菌，酶切证实正确。结论采用正确技术路线，构建了含HBsAg基因的植物表达载体，为下一步的转基因植物表达研究奠定了基础。     

含乙型肝炎表面抗原基因重组腺相关病毒的构建及其基因的表达和功能初步研究

目的构建含乙型肝炎表面抗原(HBsAg)基因的重组腺相关病毒(rAAV)并观察目的基因的表达和功能。方法采用PCR法从PTHBV-1质粒中扩增HBsAg基因(ayw 亚型);将PCR扩增产物插入腺相关病毒(AAV)表达质粒pSNAV中,构建重组质粒pSNAV-HBsAg;用脂质体转染的方法将重组质粒转入BHK-21细胞中,G418筛选得到转入重组质粒并能表达目的基因的细胞系BHK-HBsAg;用具有rAAV包装功能的HSV-1- HSV1-rc/△UL2感染BHK-HBsAg,纯化后得到rAAV-HBsAg;ELISA检测重组病毒表面抗原基因在BHK-21细胞和293细胞中的表达;用rAAV-HBsAg免疫BalB/C小鼠,RIA法检测血清中表面抗体的滴度。结果ELISA法检测到混合细胞系BHK-HBsAg中HBsAg的表达量为(28.6±6.7)ng/5×106细胞;rAAV-HBsAg感染BHK-21细胞和293细胞后均能检测到HBsAg的表达,表达量随感染复数的增加而升高;rAAV-HBsAg免疫的BalB/C小鼠能产生表面抗体(抗-HBs抗体)。结论rAAV-HBsAg在体外能表达,免疫动物能诱导体液免疫反应的产生。rAAV-HBsAg有希望成为乙型肝炎候选疫苗,也可以进一步用于探索慢性乙型肝炎的免疫治疗。     

查菲埃立克体120 000表面抗原蛋白基因的克隆与表达

目的 构建查菲埃立克特异性表面抗原P120基因的原核表达质粒,并使该基因在E.coli中高效表达。方法 依据查菲埃立克体P120基因序列设计一对特异性引物,用PCR从查菲埃立体克体的基因中扩增含有编码P120原决定簇的基因片段,而后将PCR产物用T载体克隆。用酶将PCR产物从T载体切下,将它定向插入原核表达质粒PET11C构建PET11C／p120基因。PET12C／p120重组质粒转化的E．coli在TPTG的诱导下产生一分子量为41000的天然蛋白,它的产量占细菌蛋白总量的28％,用免疫印迹分析证明它能特异地与查菲埃立体克感染病人血清反应。结论 查菲埃立克体特异性的P120抗原在原核表达系统被高效表达,该抗原的研制成功为制备人单核细胞埃立克体病诊断抗原和疫苗奠定了基础。     

变形链球菌唾液结合区段(SBR)在大肠杆菌中的表达

目的构建含变形链球菌唾液结合区段(SBR)基因的原核表达载体,并在大肠杆菌JM109(DE3)中诱导表达。方法采用定向克隆方法将变形链球菌唾液结合区段(SBR)基因插入表达载体pcMVT 7,构建重组原核表达质粒pcMVT 7-SBR,转化大肠杆菌JM109(DE3),IPTG诱导表达,亲和层析纯化SBR目的蛋白。结果经酶切鉴定及DNA序列测定,重组质粒pcMVT 7-SBR序列及阅读框架正确,亲和层析纯化得到SBR融合蛋白。结论成功构建了含变形链球菌唾液结合区段(SBR)基因的原核表达载体,为防龋疫苗的动物实验研究奠定基础。     

Amplification，cloning，sequencing and expression of the gene encoding the major surface antigen of Toxoplasma gondii isolated

Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｃｌｏｎｉｎｇ，ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｔｈｅｇｅｎｅｅｎｃｏｄｉｎｇｔｈｅｍａｊｏｒｓｕｒｆａｃｅａｎｔｉｇｅｎｏｆＴｏｘｏｐｌａｓｍａｇｏｎｄｉｉｉｓｏｌａｔｅｄｉｎＣｈｉｎａ￥ＣｈｅｎＸｉａ...     

Downregulation of Rho associated coiled-coil forming protein kinase 1 in the process of delayed myocardialization of cardiac proximal outflow tract septum in connexin 43 knockout mice embryo

Background  The connexin43 knockout (Cx43 KO) mouse dies at birth with an enlarged conotruncal region, which leads to the obstruction of the right outflow tract (OFT). Since myocardialization of the proximal OFT septum is one of the key events during heart development, we investigated the process in the Cx43 KO embryo hearts. Rho associated coiled-coil forming protein kinase 1 (ROCK1), is a recently found key molecule to regulate the myocardialization of OFT, but its spatiotemporal expression pattern during myocardialization remains unknown. The objective of this study was to investigate the differentially expressed pattern of ROCK1 between Cx43 KO and wild type embryo hearts, and its relationship with the delayed myocardialization in Cx43 KO embryo hearts.

Methods  Using immunohistochemistry, the processes of myocardiolization were investigated both in Cx43 KO and wild type embryo hearts. The differentially expressed pattern of ROCK1 between Cx43 KO and wildtype embryo hearts was evaluated both at the mRNA and protein level by real-time RT-PCR and immunohistochemistry.

Results  The expression of α-sarcomeric actin (α-SCA) in the proximal OFT septum of Cx43 KO embryos was delayed. Meanwhile, it was shown that the downregulation of ROCK1 coincided with delayed myocardialization. The expression of ROCK1 protein was mainly limited to the proximal outflow tract septum from embryo day (E) E11.5 to E15.5. Its expression pattern was similar with that of α-SCA. Real-time RT-PCR found that the expression level of Rock-1 mRNA began at a low level on E11.5 and reached peak at E13.5 and E14.5.

Conclusions  ROCK1 may have an important role in the process of myocardialization of the proximal OFT septum. Downregulation of ROCK1 is likely to contribute to the aberrant myocardialization in Cx43 KO embryo hearts.

     

重组乙肝表面抗原真核表达质粒的构建及表达

采用限制性内切酶从重组的真核表达质粒pcDNA-S2S中分离出经过测序鉴定的乙肝表面抗原中蛋白（preS2 S)基因片段,将其亚克隆于pVAX1真核表达载体,构建编码乙肝表面抗原中蛋白的卡那霉素抗性真核表达质粒pVAX-S2S,酶切鉴定后将重组质粒体外转染COS7细胞,ELISA法检测上清液中的HBsAg呈阳性,说明重组质粒pVAX-S2S在体外能够有效表达HBsAg,为进一步的体内免疫反应打下基础。     

大鼠GAP-43基因的克隆及其在COS-7细胞的表达

目的: 克隆大鼠GAP-43基因,构建其真核表达载体,并观察其在哺乳动物细胞COS-7中的表达。方法: 采用RT-PCR方法,以大鼠少突胶质前体细胞RNA为模板,扩增GAP-43基因,定向克隆到pEGFP-N3载体中。以LipofectamineTM 2000试剂转染pEGFP-N3-GAP-43表达载体至COS-7细胞中进行瞬时真核表达。以免疫荧光方法鉴定GAP-43的表达。结果: 从大鼠少突胶质前体细胞中克隆到序列正确的GAP-43全长编码序列。所构建的GAP-43质粒在COS-7细胞中获得高效表达。结论: 大鼠GAP-43基因的克隆、真核表达载体的构建及在COS-7中的表达获得成功,为进一步研究其功能,尤其是探讨其在少突胶质细胞发育中的作用奠定了基础。     

p21waf1基因的克隆及在大肠杆菌中的高效表达

目的:构建人p21^waf1基因的原核表达载体并在大肠杆菌JM109中高效表达。方法:从人肝细胞中分离总RNA,经逆转录多聚酶链反应（RT-PCR）得到p21^waf1全基因。用原核细胞表达载体构建了pBV220/p21^waf1重组质粒,经DNA测序确认后,将其转化到大肠杆菌JM109进行表达、初步纯化。 结果:SDS-PAGE凝胶电泳分离显示在分子量21 000处有一诱导蛋白带,薄层扫描显示表达产物在诱导5 h时可达细菌总蛋白的38%,Western blotting证明表达产物与抗人P21^waf1单克隆抗体有特异性免疫反应。 结论:成功构建出p21^waf1表达载体,诱导产生蛋白经检测证实为P21^waf1蛋白。