大鼠肾小球系膜细胞体外培养及鉴定的实验研究

目的:探索一种重复性好、传代次数多的大鼠肾小球系膜细胞(glomerular mesangial cell,GMC)体外培养和鉴定的方法.方法:麻醉状态、无菌条件下取得大鼠的肾脏,用3种不同目数的不锈钢筛网提取肾小球,搜集到的肾小球分别加入2.5 g/L、0.5异/LⅣ型胶原酶及2 g/L Ⅱ型胶原酶各5 mL,分别在37 ℃水浴箱中振荡消化20 min、30 min、25min,然后接种肾小球,比较不同培养条件下肾小球系膜细胞的生长状况.结果:Ⅱ型、Ⅳ型胶原酶3种不同浓度作用不同的消化时间,细胞的生长速度及生长状况不同,Ⅳ型胶原酶(2.5 g/L)消化20 min的为最佳.结论:培养的细胞为肾小球系膜细胞,用Ⅳ型胶原酶(2.5 g/L)消化20 min的肾小球系膜细胞生长状态最佳.     

采用Ⅳ型胶原酶构建大鼠脑出血模型

目的：利用Ⅳ型胶原酶构建大鼠脑出血模型，并研究血肿形成速度和血肿形成大小的影响因素。方法：使用健康雄性200－250g Wistar大鼠，随机分组，分别脑内尾状核注射不同容积Ⅳ型胶原酶／肝素生理盐水溶液，单纯Ⅳ型胶原酶生理盐水溶液，单纯生理盐水，于术后6h,12h,24h,3d,7d分别观察冰冻切片连续切片血肿大小，结果：单纯生理盐水注射仅引起12h内的针道渗血，单纯胶原酶生理盐水注射3d可以形成直径3mm左右的血肿，IV型胶原酶／肝素生理盐水注射24h可形成直径3mm左右的血肿，结论：IV胶原酶／肝素生理盐水注射可以建立理想稳定的脑出血动物模型，且血肿大小和注射溶液容积呈正相关。     

大鼠肾小球足细胞的原代培养与鉴定

目的 建立一种简单适用的原代培养与鉴定大鼠肾小球足细胞的方法。方法 通过差异过筛法收获SD大鼠（体质量60~100 g）肾小球,2 g/L Ⅳ型胶原酶消化肾小球,组织块种植法将肾小球种植于添加有ITS-X (含转铁蛋白-亚硒酸钠-胰岛素）的K1-3T3培养基,9~10 d后首次传代培养。通过观察细胞形态结合免疫组织化学SP法检测角蛋白、结蛋白和Wilms瘤抑癌因子-1(WT-1)表达以鉴定足细胞。结果 种植肾小球3 d后,可见从肾小球内生长出来的细胞逐渐增多,9~10 d后融合成鹅卵石样外观。传代后的细胞变为大而扁平的星形细胞,有明显突起和微绒毛;免疫组织化学法显示结蛋白表达呈阴性、角蛋白和WT-1表达呈阳性,提示所培养的细胞为足细胞。 结论 种植胶原酶消化的肾小球是一种简单易行的原代培养大鼠肾小球足细胞方法。WT-1可作为鉴定大鼠肾小球足细胞的合适标记。     

猕猴原代肾小球系膜细胞分离提取培养与鉴定

目的 探索一种简单方便、重复性好的非人灵长类动物原代肾小球系膜细胞(GMCs)体外提取、培养及鉴定的方法。方法 在无菌条件下取出猕猴肾脏,利用两种不同孔径的纱网(介于100目到200目之间)分离出肾小球,设置不同浓度(0.1、0.2 mg/ml)Ⅵ型胶原酶消化肾小球,同时在这两个浓度基础上设置不同消化时间(10、15 min),将消化后的肾小球接种到细胞瓶中,观察不同消化条件下GMCs的生长状况。显微镜下观察GMCs的结构,免疫荧光和Western blot法检测GMCs中α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、Nephrin蛋白的表达。利用肿瘤坏死因子-α(TNF-α)刺激后观察GMCs生物学特性,CCK-8法和高内涵细胞成像系统法分别检测GMCs活力和增殖情况;Transwell法和细胞划痕实验检测GMCs迁移能力。结果 利用0.1 mg/mlⅥ型胶原酶消化10 min搜集到的肾小球贴壁较多,肾小球细胞生长状态较好。原代培养的肾小球3 d贴壁,7 d开始移出不规则形状或星状的细胞,经21～35 d GMCs逐渐铺满瓶底。GMCs中α-SMA蛋白阳性,Nephrin蛋白阴性。10 ng/m...     

兔颈动脉外膜剥离血管出血的动物模型

目的建立一个稳定的血管外膜剥离出血的动物模型,用于临床进一步研究局部止血药物的效果。方法取健康新西兰大白兔12只,随机按胶原酶浓度分为1 g/L、2 g/L、4 g/L三组,胶原酶消化兔颈动脉至动脉外膜疏松,眼科镊钝性剥离外膜,在剥离过程中出现血管渗血,观察对比不同浓度胶原酶消化后动脉出血量的变化,并取消化前后的颈动脉行HE染色,光镜下观察外膜剥离程度,以确定胶原酶最佳消化浓度及剥离程度。结果 1g/L的胶原酶消化动脉外膜不彻底,无法造成动脉稳定的出血,4 g/L的胶原酶导致血管消化过度破裂出血,2 g/L的胶原酶消化血管外膜+眼科镊钝性剥离可使血管外膜剥离彻底,血管出血稳定。结论胶原酶消化+眼科镊钝性剥离血管外膜的方法可建立稳定的血管出血模型,其最佳消化浓度为2 g/L。     

成年大鼠心肌细胞培养方法的建立和形态学观察

为探索稳定的成年大鼠心肌细胞的分离和培养方法 ,应用生物酶 ( 5g/L胰蛋白酶及 1 g/L胶原酶 )灌注法分离成年大鼠心肌细胞 ,用形态学及台盼蓝染色法鉴定分离的心肌细胞 ,并在光镜和电镜下观察和摄像记录。结果 :心肌细胞的存活率为 91 .7% ;存活的心肌细胞静止地贴在培养板底上 ,细胞完整 ,呈杆状 ,长宽比约为 4～ 6∶1。结果提示 :该方法是比较理想的心肌细胞培养法。     

大鼠胸主动脉平滑肌细胞胶原酶解法培养与鉴定

目的 探讨复合胶原酶解离大鼠胸主动脉的原代细胞培养方法 及其生长特性.方法 0.2%Ⅰ型胶原酶和0.2%Ⅱ型胶原酶解离大鼠胸主动脉平滑肌,用相差显微镜观察其生长情况,免疫组化鉴定平滑肌细胞的纯度.结果 24h内细胞贴壁生长,1周左右细胞可传代,传代后细胞呈典型的"峰-谷"样生长,第3代细胞用α-actin染色鉴定平滑肌细胞,其纯度为96%.结论 复合胶原酶解离法原代细胞培养是一种简单、周期短、纯化速度快的方法 ;可作为一种可靠的细胞模型.     

大鼠酒精性肝病Ⅳ型胶原酶的流式细胞术检测

目的：研究Ⅳ型胶原酶在酒精性肝病发生发展中的动态变化。方法：通过灌胃的方法制备大鼠酒精性肝病的动物模型,应用流式细胞术检测Ⅳ型胶原酶在酒精性肝病中的动态变化。结果：酒精性肝病组Ⅳ型胶原酶含量明显高于对照组（P＜0.05),并且随造模时间延长其含量进行性增加。结论：在大鼠酒精性肝病发生发展中Ⅳ型胶原酶水平进行性增加,可能参与酒精性肝病的进展。     

胶原酶Ⅳ肝素生理盐水立体定向注入尾状核建立脑出血大鼠模型

目的使用胶原酶Ⅳ肝素生理盐水立体定向注入大鼠脑尾状核,制作稳定的脑出血大鼠模型。方法使用280～300 g成年SD大鼠,随机分组,以前囟为原点,前囟后0.2、0.6、1 mm位置分别注入胶原酶Ⅳ肝素生理盐水和单纯胶原酶Ⅳ生理盐水,术后不同时相对大鼠进行神经功能学评分。结果前囟后1 mm组在不同时相的神经功能学评分高于前囟后0.2、0.6 mm组;肝素能加速脑出血血肿的形成。结论前囟后1 mm注入胶原酶Ⅳ肝素生理盐水24 h内产生有稳定神经缺损体征的脑出血大鼠模型。     

三种原代大鼠肝细胞分离方法的比较

目的寻求一种高效、价廉的原代大鼠肝细胞分离方法。方法采用组织块法、胶原酶原位灌流法、改良二步胶原酶灌流法对大鼠原代肝细胞进行分离。比较3种方法所获得的肝细胞的产率、存活率、纯度及胶原酶的用量。结果组织块法、胶原酶原位灌流法、改良二步胶原酶灌流法所获得大鼠原代肝细胞的产量分别(0.21±0.11)、(1.87±0.51)、(1.94±0.55)×108/只大鼠;存活率分别为(54.34±8.21)%、(85.18±4.90)%、(90.34±4.46)%;肝细胞纯度分别为(68.80±10.30)%、(85.12±2.87)%、(91.84±30.3)%;胶原酶用量分别为(17.38±2.13)、(78.75±20.83)、(31.2±12.46)mg/只大鼠。结论相比于组织块法和胶原酶原位灌流法,胶原酶二步灌流法为一种经济、高效的原代大鼠肝细胞分离方法。     

胃粘液细胞癌中72KDⅣ型胶原酶的表达与其浸润的关系

采用免疫组织化学方法研究２２例胃粘液细胞癌中７２ＫＤⅣ型胶原酶的表达及Ⅳ型胶原在胃癌组织的分布，结合电镜进行胃粘液细胞癌三种类型癌细胞的观察。结果显示该酶在胃粘液细胞癌第Ⅱ型细胞中有强烈的表达，Ⅰ、Ⅲ型细胞表达较弱，癌细胞周围Ⅳ型胶原呈阴性。揭示Ⅳ型胶原酶的表达与癌细胞的分化状态有关。癌细胞分泌Ⅳ型胶原酶降解基底膜Ⅳ型胶原，从而便于其向间质浸润。     

新生SD大鼠心肌细胞原代培养方法的比较

目的建立并比较新生SD大鼠心肌细胞的原代培养方法。方法采用胰酶法和胰酶+Ⅱ型胶原酶法分别消化心肌组织,两次90 min差速贴壁纯化心肌细胞,倒置显微镜下观察细胞形态变化,分别采用台盼蓝和免疫荧光染色评估心肌细胞的存活率和纯度。结果与胰酶法相比,胰酶+Ⅱ型胶原酶法可以获得形态良好且结构完整的心肌细胞;胰酶+Ⅱ型胶原酶法分离心肌细胞的获得率[（1.21±0.03）×10⁶ vs（0.65±0.02）×10⁶,P<0.01]和心肌细胞存活率[（93.37±0.40）%vs （86.40±0.36）%,P<0.01]明显高于胰酶法;两种方法获得的心肌细胞纯度均达到95%以上,但是胰酶+Ⅱ型胶原酶法获得心肌细胞所耗时间明显多于胰酶法[（14.00±0.40）h vs （4.59±0.10）h,P<0.01]。结论胰酶+Ⅱ型胶原酶法比胰酶法分离心肌细胞耗时长,但胰酶+Ⅱ型胶原酶法分离的心肌细胞获得率高、存活率高、细胞结构完整,是一种简单易行且高效的培养方法。     

肾上腺皮质细胞的体外培养方法和初步应用

用不同浓度的胶原酶和胰蛋白酶在不同作用时间下进行肾上腺皮质细胞的分离,得出最适条件为0.0625％胰蛋白酶消化30min和Img/ml胶原酶消化60min。其中胶原酶的细胞得率、细胞存活率及存活时间均略高于胰蛋白酶。oortrosyn Z刺激皮质细胞分泌皮质酮的最适终末浓度为125pg/ml。在此浓度刺激下,4月龄大鼠与20月龄大鼠皮质细胞的皮质酮分泌有极显著差异,说明随着月龄的增加。大鼠的肾上腺皮质功能有所减退。     

大鼠肾小球系膜细胞的培养与鉴定

培养及鉴定大鼠肾小球系膜细胞。方法首先提取大鼠肾小球并用Ⅳ型胶原酶消化处理,然后体外培养大鼠肾小球,对生长的细胞定期行光镜及免疫化学色等鉴定。结果培养的肾小球３ｄ后可见细胞生长,１４ｄ时镜下细胞多呈星状或纺锤状们有不规则的突起。     

糖尿病大鼠胰腺β细胞SUR mRNA转录水平与2型糖尿病的关系

目的:探讨胰腺β细胞磺脲类药物受体(sulfonylurea receptor,SUR)和糖尿病的关系。方法:SD大鼠60只,150-250 g,雄性,平均分成2组。2型糖尿病模型组:用小剂量链脲菌素(25 mg/kg)尾静脉注射,再用高热量饲料喂养,形成2型糖尿病大鼠模型;正常对照组:普通饲料喂养。分别在第4、8、12、24周做糖耐量和胰岛素释放试验。具体方法:大鼠禁食6 h后,腹腔注射1.11 mol/L葡萄糖液,葡萄糖剂量为2 g/kg,尾静脉取血分别测定注射前(0)、注射后30、60、120 min血糖和胰岛素。胰腺β细     

Ⅰ型胶原酶消化组织块法体外培养人牙髓细胞

目的 建立利用Ⅰ型胶原酶消化组织块体外培养人牙髓细胞方法。方法 通过组织块Ⅰ型胶原酶消化法进行人牙髓细胞体外培养，免疫细胞化学法鉴定细胞组织来源，进行细胞传代，酶组织化学法对体外复层生长的人牙髓细胞爬片进行碱性磷酸酶组织化学染色，并检测其矿化能力。结果 采用Ⅰ型胶原酶消化组织块法体外培养的原代牙髓细胞，在第15～20d出现汇合，第4～6代牙髓细胞在连续培养后具有复层生长特性，并具有显著的碱性磷酸酶活性．阳性染色强弱部位呈区域性分布，连续培养的牙髓细胞可形成矿化结节。结论 Ⅰ型胶原酶消化组织块法可以很好地进行人牙髓细胞体外培养，可以用酶组织化学法研究牙髓细胞的生物学特性。     

大鼠心室肌细胞的分离及其钙电流的观察

目的：探讨大鼠心肌细胞酶急性分离的方法，并观察大鼠心室肌细胞膜钙电流。方法：采用Lngendorff灌流装置，用含胶原酶P(0．12g/L)的台式液，经主动脉逆行灌流心脏，分离心肌细胞；采用膜片钳全细胞记录的方法，观察记录大鼠心室肌细胞膜L型钙电流。结果：心肌细胞的存活率约70％-80％，形态呈长杆状，横纹清晰，膜良好。膜片钳全细胞记录出电压依赖性内向电流，其激活电位-30mV，最大激活电位0mV，反转电位50mV，并且此内向电流可被钙通道阻滞剂维拉帕米抑制。结论：用此法可分离出高存活率的心肌细胞，并具有正常的电生理特性。     

胶原酶注入小鼠尾状核建立脑出血模型

目的用脑内注射胶原酶方法建立小鼠脑出血模型。方法在动物脑立体定位仪下将肝素化Ⅶ型胶原酶0.15μL(0.5 U/μL)注射到昆明小鼠右侧尾状核内;分别在术后8、12、24、72 h对小鼠运动功能进行检测,通过在各时间点测量血肿直径来观察出血高峰的时间,并对出血部位脑组织进行光镜观察来验证模型制作是否成功。结果术后小鼠即表现左侧肢体偏瘫症状,至12~24 h症状最重。形态学观察证实右侧尾状核区血肿形成,且出血高峰的时间与肢体偏瘫症状发展过程基本一致。不同个体间血肿体积和部位基本一致。结论应用Ⅶ型胶原酶脑内注射的方法建立的小鼠脑出血模型,是一种方法简单,效果可靠,易于大批量制作的动物模型。     

采用Ⅶ型胶原酶制作大鼠脑出血模型的技巧

目的：研究Ⅶ型胶原酶脑内注入法构建大鼠脑出血模型的制作技巧。方法：运用立体定向技术及本文改进了的方法,向大鼠尾状核内缓慢注入Ⅶ型胶原酶,制作大鼠脑出血模型,通过观察其行为学变化,初步评价该模型建立的可行性和稳定性。结果：对150只SD大鼠进行脑出血造模,2只死亡,9例不成功,成功率为92.7％。结论：Ⅶ型胶原酶注射可建立理想稳定的脑出血模型,且操作简单,有较大推广价值。     

人胆囊上皮细胞的分离、培养及鉴定

目的　探索人胆囊上皮细胞的较佳分离方法和合适的生长条件 ,为研究胆囊的生理功能和相关疾病打下基础。方法采用IV型胶原酶及钝性擦刮法分离细胞 ,IV型胶原包被培养皿 ,DMEM/HamF12培养基联合培养。结果　每个胆囊可分离得到( 5～ 10 )× 10 7个胆囊上皮细胞 ,接种 1周内生长旺盛 ,第 3、4天达到峰值 ,呈现扁平多角形成片贴壁状态。结论　IV型胶原酶消化法可成功分离人胆囊上皮细胞 ,DMEM/HamF12培养基可提供较为满意的生长条件。