多重逆转录聚合酶链反应检测流感病毒

目的：建立特异敏感的热速检测流感病毒的分子生物学方法。方法：用多重逆转录聚合酶链反应连接多重聚合酶链反应扩增甲1、甲3和乙型流感病毒的HA基因的HA1片段。根据扩增产物的大小检测流感病毒。结果：以流感病毒的HA基因为模板设计的三对引物能特异性地扩增出942bp、1117bp和751bp的核酸片段，它们分别和甲1、甲3和乙型流感病毒有稳定对应关系。根据扩增产物的大小可以检测流感病毒。用这个方法能检测病毒浓度为0．1TCID50的样品。还可以直接从疑似流感病人的含漱液中检测到乙型流感病毒。结论：多重逆转录聚合酶链反应连接多重聚合酶链反应是检测流感病毒的特异敏感的方法，此法还能直接从疑似流感病人的含漱液中检测到乙型流感病毒。     

用两种聚合酶链反应方法检测流感病毒

目的：建立特异敏感的快速检测流感病毒的分子生物学方法。方法：用多重逆转录聚合酶链反应和半巢式多重聚合酶链反应扩增甲1、甲3和乙型流感病毒的HA基因的HA1片段。根据扩增产物的大小检测流感病毒。结果：以流感病毒的H基因为模板设计的3对引物能特异性地扩增出942bp,1117bp和751bp的核酸片段，它们分别和甲1，甲3和乙型流感病毒有稳定对应的关系。根据扩增产物的大小可以检测流感病毒。用这个方法能检测病毒浓度为0．1TCID50的样品。结论：多重逆转录聚合酶链反应和半巢式多重聚合酶链反应是检测流感病毒的特异敏感的方法。     

多重逆转录聚合酶链反应检测主要上呼吸道病毒

目的：建立用多重逆转录聚合酶链反应（mRT-PCR）检测甲1型、甲3型、乙型流感病毒以及呼吸道全胞病毒（RSV）A型、B型等主要上呼吸道病毒的方法，以快速检测上呼吸道感染主要病毒及对甲型、甲亚型、乙型流感病毒在上海地区人群感染、流行情况设计。方法：采用经MDCK细胞接种培养的甲3型、乙型流感病毒和Hep-2细胞接种培养的RSV A型、B型标准毒株病毒液，以及甲1型、甲3型、乙型流感病毒和RSV A型、B型混合毒株病毒液，使用5组引物，分别为HA1-5al和Hal-3al（甲1型流感病毒）、HA3-5al和HA3-3al和HA3-3al（甲3型流感病毒）、NP-5b1和NP-3bl（乙型流感病毒）、RSVAF和RSVAR(RSVA型)、RSVBF和RSVBR(RSVB型)，经mRT-PCR，琼脂糖凝胶电泳，于紫外灯下观察上述病毒特异核苷酸条带。结果：甲1型、甲3型、乙型流感病毒，RSVA型、B型分别在431，210，390，334，183bp处出现清晰的5条DNA条带。结论：应用5组引物，mRT-PCR可用于快速检测临床上呼吸道感染标本中的流感病毒和RSV，并可对其进行分型，对上呼吸道病毒感染性疾病的诊断和流感的监测方面是非常重要的。     

微流芯片检测流感病毒多重逆转录聚合酶链反应产物的实验研究

[目的 ]　建立应用微流芯片检测甲 1型、甲 3型、乙型流感病毒多重逆转录聚合酶链反应 (mRT -PCR)产物的方法 ,在mRT -PCR扩增核酸的基础上自动化灵敏的定量检测扩增产物 ,快速检测甲亚型、乙型流感病毒 ,帮助临床快速诊断和鉴别诊断其他呼吸道病毒感染 ,以及明确流感病毒在人群中感染、流行情况。　 [方法 ]　采用经MDCK细胞分离培养的甲 1型、甲 3型、乙型流感病毒毒株病毒液 ,使用 3组特异引物经mRT -PCR扩增核酸 ,扩增产物分别采用毛细管电泳技术经Caliper10 0 0微流芯片分析仪自动化检测和经 2 %琼脂糖凝胶电泳法检测。　[结果 ]　设计三组引物对相应甲 1型、甲 3型、乙型流感病毒靶基因的mRT -PCR扩增产物片段分别为 43 0bp、2 10bp、3 91bp ,本实验mRT -PCR扩增产物经 2 %琼脂糖凝胶电泳 ,与Marker比照 ,DNA条带基本在此位点附近 ;产物采用毛细管电泳法经Caliper10 0 0微流芯片分析仪后 ,分别于 413bp、2 0 3bp、3 79bp处出现陡峭的峰 ,如图所示。　[结论 ]　应用微流芯片采用毛细管电泳法可对流感病毒mRT -PCR产物进行定位及相对定量 ,有助于快速诊断流感病毒感染 ,有助于对流感的监测。     

多重逆转录-聚合酶链反应对甲1与甲3型流行性感冒病毒神经氨酸酶亚型的快速鉴定

为建立流行性感冒 (流感 )病毒甲1、甲3 型神经氨酸酶 (NA)N1与N2 亚型的快速鉴别方法 ,通过对大量NA基因序列的比较 ,分别在N1与N2 亚型的保守区域设计特异性引物 ,采用多重逆转录 聚合酶链反应 (MRT PCR)进行NA基因扩增 ,并评价了其灵敏度和特异性。结果表明 :MRT PCR能特异性扩增甲1、甲3 型流感病毒NAN1与N2 亚型基因 ,灵敏度为 0 1TCID50 ,可从临床患者含漱液中直接检测到N1、N2 基因。MRT PCR方法不仅可作为甲型流感病毒NA亚型的快速鉴定方法 ,而且可以作为人类甲型流感病毒基因快速诊断方法的补充 ,应用于流感爆发疫情的应急诊断。     

应用PCR-RFLP技术进行乙型流感病毒鉴别的实验研究

目的:应用聚合酶链反应(PCR)连接的限制性片段长度多态性(RELP)技术进行乙型流感病毒及其巴拿马株与维多利亚株两大谱系的鉴别。方法:根据GenBank中登录乙型流感病毒血凝素(HA)区域的核苷酸序列,应用软件进行序列比对,根据HA基因的保守区设计、筛选引物,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增流感病毒HA基因,用限制性内切酶H indⅢ酶切扩增产物并进行琼脂糖凝胶电泳,同时对检测方法进行特异性和灵敏性实验。结果:该方法对乙型流感病毒有特异性,与甲1和甲3型流感病毒无交叉反应。维多利亚株和巴拿马株HA基因均能被特异性引物所扩增,扩增产物经H indⅢ酶切后,乙型流感病毒巴拿马株在电泳谱上出现603 bp与242 bp的两个可见片段,而维多利亚株因无H indⅢ酶切位点,仍呈872 bp的一个片段。该方法检测敏感度可达0.1 TC ID50。结论:该方法是一种灵敏度高、特异性强的乙型流感病毒维多利亚株与巴拿马株鉴别的方法。     

多重逆转录-聚合酶链反应对甲1与甲3型流行性感冒病毒神经氨酸酶亚型的快速鉴定

为建立流行性感冒(流感)病毒甲1、甲3型神经氨酸酶(NA)N1与N2亚型的快速鉴别方法,通过对大量NA基因序列的比较,分别在N1与N2亚型的保守区域设计特异性引物,采用多重逆转录-聚合酶链反应(MRT-PCR)进行NA基因扩增,并评价了其灵敏度和特异性.结果表明MRT-PCR能特异性扩增甲1、甲3型流感病毒NA N1与N2亚型基因,灵敏度为0.1TCID50,可从临床患者含漱液中直接检测到N1、N2基因.MRT-PCR方法不仅可作为甲型流感病毒NA亚型的快速鉴定方法,而且可以作为人类甲型流感病毒基因快速诊断方法的补充,应用于流感爆发疫情的应急诊断.     

荧光定量逆转录-聚合酶链反应方法快速检测甲1型流行性感冒病毒核酸

目的建立特异、快速、敏感的TaqMan荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法,用于检测甲1型流行性感冒(流感)病毒核酸.方法在甲1型流感病毒血凝素基因的保守区设计引物和TaqMan探针,对其进行筛选,同时对荧光定量RT-PCR反应条件和反应体系进行优化,验证该方法的特异性、敏感性、重复性,并对疑似流感患者含漱液标本进行检测.结果该方法对甲1型流感病毒的检测具有高度的特异性,对甲3型流感病毒、乙型流感病毒、禽流感病毒H5、严重急性呼吸道综合征病毒、麻疹病毒及其它呼吸道病毒均无交叉反应,检测的灵敏度达0.1TCID50.采用该方法从临床疑似患者含漱液中对甲1型流感病毒核酸的检出,比采用狗肾传代细胞进行病毒分离更为敏感.从病毒核酸提取至检测完成仅需3h左右,操作简便,重复性好,且大大减少了常规RT-PCR检测产物的污染机会.结论新建立的TaqMan荧光定量RT-PCR是一种快速检测甲1型流感病毒的特异、敏感的方法,非常适合于疑似流感爆发疫情的应急诊断和鉴别诊断.     

甲3型流行性感冒病毒基因的快速检测

为建立流行性感冒(流感)的快速诊断技术,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测甲3型流感病毒的血凝素(HA)基因.对甲3型流感病毒的HA基因保守区域设计相关引物并进行PCR扩增,比较了它的特异性与灵敏度.结果显示该引物只能扩增甲3型流感病毒的特异性片段,而对其它型别的流感病毒以及麻疹、风疹、流行性腮腺炎病毒无交叉反应.检测的灵敏度1次PCR可达10TCID50/50ml以下,2次PCR反应可达0.1TCID50/50ml以下.采用该方法从临床患者含漱液标本中的检出率,比采用狗肾传代细胞(MDCK)分离病毒的阳性率更高,可达到迅速、正确诊断甲3型流感的实用目的.     

限制性酶切片段长度多态性分析用于乙型流行性感冒病毒巴拿马株与维多利亚株的快速鉴定

利用限制性酶切片段长度多态性分析(RFLP)鉴别乙型流行性感冒(流感)病毒的巴拿马株与维多利亚株,对乙型流感病毒血凝素(HA)基因采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增后,用HindⅢ做酶切反应并进行琼脂糖凝胶电泳.结果显示:乙型流感病毒维多利亚株或巴拿马株HA基因均能被特异性引物所扩增,且与甲1与甲3型流感病毒无交叉反应.该片段经HindⅢ酶切后,乙型流感病毒巴拿马株在电泳谱上出现603bp与242bp的2个片段,而乙型流感病毒维多利亚株在该片段无HindⅢ酶切位点,仍呈872bp的一个片段.表明该方法不仅可作为常规血清学方法的补充,对乙型流感病毒维多利亚株与巴拿马株作出正确判定,而且可快速敏感地从临床标本中直接对两类乙型流感毒株进行鉴别.     

分子生物学方法在儿童流行性感冒监测中的应用

目的：建立一种能够快速，特异，有效地直接从临床标本中检测流行感冒（流感）病毒并进行病毒型和亚型鉴别的方法，同时了解近年来北京地区A3型流感病毒因凝素重链（HA1）区基因的变异特点。方法：根据编码A、B型流感病毒膜蛋白M基因的核苷酸序列设计两对引物，用于同一逆转录（RT）－PCR反应中（多重RT－PCR），根据A、B型毒株扩增产物的大小（分别为506bp和261bp）鉴别A、B型流感病毒，另根据编码A1和A3型流感病毒糖蛋白HA基因的核苷酸序列设计两对引物，与B型M基因基因引物用同一RT－PCR反应中，可区分A1、A3或B型病毒HA基因和B型病毒M基因又设计了3对引物作为外侧引物，进行巢式－PCR反应。根据第二次PCR的扩增产物在1．2％的琼脂糖凝胶电泳中的大小即可确定型别。经PCR扩增1996－2002年间分离的北京地区A3型流感病毒株HA1区基因，测序并进行序列分析，结果：用上述多重RT－PCR鉴定流感病毒分离株156株，与血凝抑制试验阳性符合率为100％，用多重巢式－PCR检测92份已经病毒分离确定为流感的儿科临床呼吸道标本，与病毒分离和血凝抑制试验阳性符合率分别为76．9％（A1型）、57．1％（A3型）、86．5％（B型），对5株1996－2002年间A3间分离株HA1区基因序列分析结果显示，不同年份的分离株HA1区基因具有较高的核苷酸和氨基酸同源性，而且年份越近的毒株之间同生越测。为流感监测提供更加快速的新方法，北京地区A3型流感毒分离株HA1区基因持续不断地发生点突变，糖基化位点不断增多，可能是导致其抗原漂移的原因。     

浙江省1999--2010年乙型流感病毒血凝素 和神经氨酸酶基因变化特征分析

目的 分析1999-2010年浙江省乙型流感病毒主要抗原基因血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的分子变异特征.方法 采集浙江省流感暴发疫情和哨点监测医院的流感样患者呼吸道标本,荧光定量RT-PCR快速检测和病毒分离,选取乙型流感病毒分离代表株进行HA和NA基因测序,采用生物信息学软件分析变异和进化.结果 共分析浙江省乙型流感病毒分离株34株,其中Victoria系20株,Yamagata系14株;1999-2010年间Victoria系毒株的HA1基因变异率4.5%,Yamagata系毒株为3.4%;2004年后分离的Victoria系毒株均为基因重配株,HA属于Victoria 系,而NA属于Yamagata系;2010年新型甲型HINI流感流行高峰过后,浙江省仍以乙型流感病毒流行为主,分离株与2009-2010年流感疫苗株B/Brisbane/60/2008接近,与往年乙型流感毒株相比HA和NA发生多个氨基酸位点变异.结论 1999-2010年浙江省乙型流感病毒流行株发生明显变异,基因重配和抗原漂移是病毒发生变异的主要机制.

Abstract：

Objective To Characterize the genetic diversity of hemagglutinin(HA)and neuraminidase(NA)of influenza B viruses isolated in Zhejiang province during 1999-2010.Methods Respiratory specimens were collected from patients with flu-like syndrome during the influenza outbreaks or from the hospitals which carrying out influenza surveillance project in Zhejiang province.Samples were detected by real-time RT-PCR and isolated for influenza virus.HA1 and NA genes of influenza B virus isolates were amplified and sequenced.Phylogenetic comparison and genetic diversity analysis were performed using the bioinformation software.Results A total of 34 influenza B viruses were evolved in this study including Victoria-like and Yamagata-like strains according to the results of the HI test.The mutation rate of Victoria-like HA1 gene was 4.5% and Yamagata-like HA1 gene was 3.4%,respectively.The Victoria-like influenza B isolates had appeared to be all re-assortants having a Victoria lincage HA and Yamagata lineage NA since 2004.The predominant type of influenza virus isolates in 2010 was also influenza B virus after the H1N1 flu pandemic in Zhejiang province.The isolated strains were antigenicaily and genetically similar to B/Brisbane/60/2008--the vaccine strain proposed for 2009-2010.Many difierences of HA1 and NA amino acids existed in the current isolates when compared to previous influenza B strains.Conclusion Significant diversity was generated among influcnza B virus isolated from 1999 to 2010 in Zhejiang province.Genetic re-assortment and antigenic drift seemed the main evolutionary mechanism on influenza B virus.     

2017年云南省流感病毒监测及甲型H1N1流感病毒血凝素基因特征分析

目的 了解2017年云南省流感病毒的流行情况和甲型H1N1流感病毒的血凝素（HA）基因分子特征。方法 对2017年云南省流感监测哨点医院采集的21 672份标本使用real - time RT - PCR方法检测流感病毒,核酸阳性标本使用MDCK细胞进行病毒分离,采用血凝素凝集试验及抑制试验进行病毒抗原性分析。选取12株抗原性变异较大的甲型H1N1流感毒株进行基因测序,使用MEGA软件分析其HA基因特征。结果 2017年共检出流感核酸阳性标本2 372份,分离出流感毒株1 180株,全年共有2个流行高峰,H3亚型和甲型H1N1亚型交替成为优势株,BY亚型和BV亚型共同流行。毒株分离高峰与ILI%高峰基本一致。甲型H1N1流感病毒ＨＡ基因无明显变异,疫苗株仍具有保护作用。结论 继续加强监测力度,提高监测敏感性并做到及时预警,控制流感流行风险。     

四重RT—PCR快速检测2013新型H7N9禽流感病毒

目的建立能快速准确检测发热病人咽拭子样本中2013新型H7N9禽流感病毒的四重RT—PCR方法。方法针对甲型流感病毒的M基因设计通用引物,针对2013新型H7N9禽流感病毒的HA和NA基因设计特异性引物,选择人源看家基因beta—aetin设计质控引物,通过优化实验条件建立一步法四重RT—PCR反应体系。与商品化实时荧光RT—PCR试剂盒进行方法比对。结果成功建立四重一步法RT—PCR筛查2013新型H7N9禽流感病毒的检测技术。结论该方法简便、实用、成本低廉,适用于2013新型H7N9禽流感病毒的快速检测。     

应用多重TaqMan MGB探针实时聚合酶链反应检测A型和B型流感病毒的研究

目的 应用多重real-time PCR方法检测A型和B型流感病毒,探讨其在快速诊断流感病毒感染中的优越性.方法 根据A型和B型流感病毒M基因的相对保守序列,设计两套特异性引物和TaqMan MGB探针,进行多重real-time PCR检测A型和B型流感病毒.将该方法与病毒分离、免疫层析、传统RT-PCR进行比较,并对多重real-time PCR的特异性进行评估.并应用multiplex real-time PCR方法和常规的病毒分离方法对广东省流感样病例334份咽拭标本进行检测,比较其灵敏性和特异性.结果 多重real-time PCR反应可以检测到A、B型流感病毒的最低病毒量分别为10-1和10-3TCID50/反应.该方法在对流感病毒株以及其他呼吸道病毒株样品的检测中,未发现假阳性和假阴性现象,特异性为100%.该方法对334份临床标本进行检测,结果与经典检测方法(病毒分离鉴定结合血清学检测)的符合率达100%,且灵敏度明显高于病毒分离.结论 该研究建立的多重TaqMan MGB real-time PCR是一种快速、灵敏性和特异性高的流感病毒检测方法,对于流感的早期诊断及指导临床有重要意义.     

2005～2006年宁波市流行性感冒病毒的流行与优势株转换分析

目的：分析2005—2006年宁波市流行性感冒病毒的流行与流感病毒优势株的转换情况。方法：常年监测宁波市流感病毒的流行情况，选取不同时间的各种型别流感毒株进行血凝素基因HA1区核苷酸序列测定，并推导出其氨基酸序列进行基因进化特性分析。结果：2005年1—9月份宁波市的甲型流感以H3N2亚型为流行优势株，而乙型流感在2005年初以Yamagata系占优势。到2005年9月份以后至2006年底甲型流感的H1N1亚型替代了H3N2亚型占据优势株地位，乙型流感也以Victoria系成了优势株。结论：在2005年流感病毒甲、乙型的流行株均发生了亚型或种系的优势转换。流行株的基因特征及抗原性发生了明显的变异，并造成了一定规模的暴发流行。     

Diagnosis and epidemiological surveillance of influenza and respiratory syncytial virus infections: interest of multiplex PCR

OBJECTIVE: Respiratory infections require a rapid etiological diagnosis for efficient management of cases. We evaluated multiplex PCR used for the diagnosis and the epidemiological surveillance of influenza and respiratory syncytial virus (RSV) infections. PATIENTS AND METHODS: Our study included 278 patients (mean age: 37.2+/-22.9 years) with flu or flu-like syndromes, consulting physicians affiliated with the GROG Poitou-Charentes or hospitalized in the Poitiers teaching hospital. A multiplex PCR detecting A(H3), A(H1) and B influenza viruses, and RSV A and B, was performed with both a direct examination by immunofluorescence and cell-culture. RESULTS: We diagnosed a viral infection in 139 (50.0%) patients: 99 cases of influenza A(H3), 2 cases of influenza A(H1), 28 cases of influenza B and 11 cases of RSV infections. The diagnosis yield in GROG patients (52.3%) was significantly higher than that observed in hospitalized patients (34.5%) (P=0.04). All techniques were correlated in 61% of cases. The multiplex PCR yielded 22.3% more positive samples compared to the conventional techniques. All positive samples by conventional techniques were also positive by multiplex PCR. We observed a perfect correlation between viral types and subtypes determined by PCR and cell-culture. CONCLUSION: Multiplex PCR is a sensitive technique allowing an efficient and rapid diagnosis of respiratory infections due to influenza and RSV.