体外诱导成体大鼠骨骼肌组织来源的干细胞向神经干细胞的转化

目的研究成体Sprague-Dawley(SD)大鼠骨骼肌来源的干细胞(MDSCs)体外诱导向神经干细胞(NSCs)分化的可行性。方法通过酶消化和连续贴壁的方法体外分离成年SD大鼠腓肠肌中的MDSCs。当传代至4-6代时,加入神经干细胞的特殊培养基Neurobasal-A和细胞因子进行诱导分化。用免疫细胞化学、Western blot以及realtime-PCR方法进行鉴定。结果MDSCs在神经干细胞特殊培养基中培养7~10 d后可形成类似神经球的细胞聚集物。运用免疫细胞化学、Western blot以及realtime-PCR检测发现MDSCs的标记蛋白结蛋白(desmin)表达下调,NSCs的特异性抗原神经巢蛋白(Nestin)开始表达。结论在神经干细胞的特殊培养基培养7~10 d后,MDSCs能够向神经干细胞转化。这种现象提示MDSCs有可能作为治疗神经系统疾病尤其是神经退行性疾病的一种新的干细胞来源。     

大鼠腓肠肌肌源细胞的培养与鉴定

目的寻求大鼠肌源细胞体外大量培养及鉴定的方法,为临床直接使用自体肌源细胞注射治疗肌组织损伤疾病奠定实验基础。方法利用胶原酶和胰蛋白酶消化3周龄大鼠腓肠肌,应用选择性培养基抑制非肌源细胞生长,采取改良的差速贴壁法纯化肌源细胞,通过形态观察、免疫组化及RT-PCR进行鉴定。结果使用F-10培养基获得了大量高纯度的大鼠肌源细胞;倒置显微镜下可观察到聚集成团和散在分布的两种形态的肌源细胞;免疫组化显示肌源细胞Desm in阳性率约90%,聚集成团的为CD34＋,大部分单个存在的为CD34-;RT-PCR显示传代细胞中均有Desm in基因的表达。结论此培养方法可在体外获得大量大鼠肌源细胞,有助于基因工程及组织工程等领域的研究。     

肌源干细胞联合移植促进脂肪存活性的实验研究

目的从微观与宏观两方面同时探讨肌源干细胞(muscle-derived stem cells,MDSC)对肌肉内脂肪移植的辅助异化作用。方法实验共分A、B、C三组:A组为实验组:用MDSC细胞悬液与自体脂肪组织联合移植在小鼠的右侧后肢。B组为对照组:用PBS液取代了细胞悬液植入在左侧后肢。C组为健康雄性成年C57小鼠(15～20 g)的胫前肌作为空白对照组。通过大体观察、MRI成像、组织学染色比较各组之间的差异。结果大体观察治疗组小鼠后肢体积明显大于对照组;MRI成像发现MDSC治疗组的脂肪移植物显影显著强于对照组;组织学染色进一步发现MDSC治疗组多数由细胞结构完整,细胞形态良好的脂肪细胞组成。与之相反,对照组组织学染色可见广泛的纤维增生和大量的脂肪液化坏死。毛细血管计数结果显示,MDSC治疗组含有的毛细血管数量约是对照组的3倍。结论 MDSC与自体脂肪组织联合移植可以通过促进毛细血管新生而达到提高肌肉内脂肪移植物的长期存活率。     

新生小鼠肌源性干细胞的生物学特性及表型研究

目的通过体外新生小鼠肌源性干细胞(MDSCs)的培养,观察鼠肌源干细胞的生物学特性及表型。方法采用胶原酶Ⅺ和胰蛋白酶分步消化肌肉,后采用差速贴壁分离技术纯化获得MDSCs。用倒置显微镜观察细胞形态,测定生长曲线,分析MDSCs的增殖能力,采用Sca-1、CD34和Desmin免疫细胞化学染色对细胞进行鉴定,初步确定细胞表型。结果经过两步消化和差速贴壁后,成功培养出高纯度的肌源性干细胞,该细胞呈Sca-1、CD34和Desmin阳性。结论可通过体外原代培养获得高纯度的肌源性干细胞,细胞具有良好的增殖能力,是适用于组织工程和基因治疗研究的一种新型种子细胞。     

胎儿肌肉来源细胞的分离及其成肌分化研究

目的 观察胎儿肌肉来源细胞(flMDC)体外成肌分化能力以及在mdx鼠体内再生抗肌营养不良蛋白.方法 使用舍10％新生牛血清的DMEM/F12培养液,采用预贴壁方法从胎儿肌肉组织中分离fMDC.采用免疫染色鉴定肌肉特异标志的表达.肌内注射fMDC到6.5 Gy照射3d后的mdx小鼠股直肌,1个月后采用免疫荧光染色法和RT-PCR方法检测人抗肌营养不良蛋白和基因的表达.结果 采用预贴壁方法可从胎儿肌肉组织中分离到贴壁生长、梭型的flMDC.可在fMDC的一些长纤维细胞包浆中检测到MHC的表达,在一些细胞胞核中检测到成肌素的表达.可在注射fMDC的mdx小鼠肌肉中检测到人抗肌营养不良蛋白和基因的表达.结论 fMDC中存在MHC和成肌素的阳性表达,注射fMDC到照射过的mdx小鼠体内可以再生抗肌营养不良蛋白表达.     

成年大鼠肌源性干细胞的培养和鉴定

目的探讨成年大鼠肌源性干细胞分离及纯化方法。方法采用消化法分离肌源性干细胞,然后用密度梯度离心法和差速贴壁法纯化干细胞;结蛋白(desmin)、CD34、CD45、Sca1免疫细胞化学染色对细胞进行鉴定。结果成功培养出高纯度的肌源性干细胞,免疫细胞化学染色结果为desmin( ),CD34( ),CD45(-),Sca1( )。结论可通过体外原代培养获得高纯度肌源性干细胞,为组织工程的临床应用提供种子细胞。     

Expansive effects of aorta-gonad-mesonephros-derived stromal cells on hematopoietic stem cells from embryonic stem cells

Background Hematopoietic stem cells (HSCs) give rise to all blood and immune cells and are used in clinical transplantation protocols to treat a wide variety of refractory diseases, but the amplification of HSCs has been difficult to achieve in vitro. In the present study, the expansive effects of aorta-gonad-mesonephros (AGM) region derived stromal cells on HSCs were explored, attempting to improve the efficiency of HSC transplantation in clinical practice.Methods The murine stromal cells were isolated from the AGM region of 12 days postcoitum (dpc) murine embryos and bone marrow（BM）of 6 weeks old mice, respectively. After identification with flow cytometry and immunocytochemistry, the stromal cells were co-cultured with ESCs-derived, cytokines-induced HSCs. The maintenance and expansion of ESCs-derived HSCs were evaluated by detecting the population of CD34+ and CD34+Sca-1+cells with flow cytometry and the blast colony-forming cells (BL-CFCs), high proliferative potential colony-forming cells (HPP-CFCs) by using semi-solid medium colonial culture. Finally, the homing and hematopoietic reconstruction abilities of HSCs were evaluated using a murine model of HSC transplantation in vivo.Results AGM and BM-derived stromal cells were morphologically and phenotypically similar, and had the features of stromal cells. When co-cultured with AGM or BM stromal cells, more primitive progenitor cells (HPP-CFCs ) could be detected in ESCs derived hematopoietic precursor cells, but BL-CFC’s expansion could be detected only when co-cultured with AGM-derived stromal cells. The population of CD34+ hematopoietic stem/progenitor cells were expanded 3 times,but no significant expansion in the population of CD34+Sca-1+ cells was noted when co-cultured with BM stromal cells. While both CD34+ hematopoietic stem/progenitor cells and CD34+Sca-1+ cells were expanded 4 to 5 times respectively when co-cultured with AGM stromal cells. AGM region-derived stromal cells, like BM-derived stromal cells, could promote hematopoietic reconstruction and HSCs’ homing to BM in vivo.Conclusions AGM-derived stromal cells in comparison with the BM-derived stromal cells could not only support the expansion of HSCs but also maintain the self-renewal and multi-lineage differentiation more effectively. They are promising in HSC transplantation. Chin Med J 2005; 118(23):1979-1986     

人骨髓间充质干细胞向骨骼肌定向分化的研究

目的 研究人骨髓间充质干细胞在裸鼠损伤腿部向骨骼肌定向分化。方法 在裸鼠腿部注入无水酒精造成肌肉损伤，取培养人骨髓间充质干细胞用荧光染料Dil标记后注入损伤处，术后6d及12d取损伤部肌肉进行形态观察和免疫荧光标记。结果 在术后6d可见Dil标记细胞向骨骼肌分化，Myoglobin阳性表达。术后12d后可见新生骨骼肌出现典型横纹，细胞核MyoD1阳性表达。结论 在裸鼠损伤肌肉的微环境中，人骨髓间充质干细胞可向骨骼肌定向分化，并伴有Myoglobin及MyoD1阳性表达。     

肌源性干细胞治疗压力性尿失禁的实验研究

目的 探讨肌源性干细胞(muscle-derived stem cells,MDSCs)移植至压力性尿失禁(stress urinary incontinence,SUI)大鼠近端尿道后体内形态、分布以及尿动力学变化,为压力性尿失禁的干细胞移植治疗提供理论基础.方法 采用坐骨神经离断法建立压力性尿失禁模型,改良差速贴壁技术分离MDSCs,pEGFP-N1转染作标记,注射至SUI大鼠近端尿道.尿动力学仪检测MDSCs移植后1、2周的漏尿点压力(leak point pressure,LPP)和最大膀胱容量.显微镜观察MDSCs移植后1、3、7、10、14 d荧光细胞的形态和分布.结果 MDSCs移植后第7、14天,SUI大鼠的LPP均显著提高,移植后2周LPP显著高于移植后1周.在MDSCs移植后第1、3天,细胞保持小圆形和短梭形,局限于注射部位;第7天,一部分移植的MDSCs开始分化,分布范围扩大;第10天,一部分MDSCs分化为平滑肌细胞,部分死亡;第14天,一部分细胞分化为肌纤维,而其余细胞发生变性、死亡.结论 MDSCs移植后能存活并分化而整合至尿道括约肌,尿道括约肌功能得到改善,提示MDSCs移植可能是治疗压力性尿失禁的有效方法.     

体外诱导人胚胎干细胞定向分化为神经干细胞

目的:探讨体外定向诱导人胚胎干细胞(human embryonic stem cells,hESCs)生成高纯度神经干细胞(neural stem cells,NSCs)的方法.方法:模拟体内神经细胞分化发育的不同阶段及微环境,分三阶段诱导hESCs定向生成NSCs.形态学观察结合免疫荧光细胞化学、流式细胞术和RT-PCR检测胚胎干细胞标志和神经干细胞标志;NSCs分化实验对所诱导的NSCs的分化潜能进行检测.结果:体外培养的hESCs在胚胎成纤维细胞饲养层上连续传代培养50代,仍保持SSEA-4,TRA-1-81阳性,表达Nanog基因,流式细胞术检测SSEA-4阳性表达率为83.44%;经三步法最终可诱导形成纯度高达90%以上的nestin阳性细胞,表达nestin基因,流式细胞术检测nestin阳性表达率为89.38%;诱导生成的细胞反复传代,仍表现为nestin阳性,并可进一步分化为神经元、星形神经胶质细胞和少突胶质细胞.结论:模拟体内神经分化过程的三步诱导法,可诱导hESCs生成较高纯度的NSCs,并能较好维持其干细胞特性和具有进一步分化的能力.     

Reprogramming of adult human neural stem cells into induced pluripotent stem cells

Background Since an effective method for generating induced pluripotent stem cells (iPSCs) from human neural stem cells (hNSCs) can offer us a promising tool for studying brain diseases,here we reporte...     

肝干细胞研究进展

肝干细胞是具有自我更新能力和分化为成熟肝细胞与胆管上皮细胞的双向分化潜能的原始细胞.肝干细胞不仅参与了肝脏的稳态维持、损伤修复和肝再生,而且在肝脏疾病的细胞治疗、人工生物肝及肝导向基因治疗中有着巨大的应用潜能.本文对几种主要类型的肝干细胞及它们的来源、分子标志物等进行了综述.     

全反式维甲酸促进多能干细胞向间充质干细胞样细胞分化

目的探索全反式维甲酸(RA)和SB431542对胚胎干细胞(ES)及诱导多能干细胞(i PS)分化为间充质干细胞(MSC)样细胞的影响。方法将培养的鼠ES和i PS根据不同的分化条件分为对照组、SB431542组及RA不同浓度组,对照组为达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)完全培养基,SB431542组为DMEM完全培养基中含10μmol·L-1SB431542,RA不同浓度组的DMEM中分别含0.05、0.10、0.20、0.40 nmol·L-1RA。分化培养4 d后观察细胞形态,流式细胞术检测细胞表面标志物CD105和干细胞抗原1(Sca-1)的表达,以CD105+细胞和Sca-1+细胞的比例确定i PS和ES向MSC分化的程度。结果小鼠ES和i PS在ESGRO-2i培养基里生长较好。ES分化4 d后,对照组和SB431542组ES和i PS分化成内皮样细胞,在含有不同浓度RA的培养基中ES和i PS可有效分化为纤维状细胞。ES分化4 d后,SB431542组Sca-1+细胞比例显著高于对照组(P<0.05),CD105+细胞比例与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。在RA 0.05、0.10、0.20、0.40 nmol·L-1RA组中,ES分化的CD105+细胞比例显著高于对照组和SB431542组(P<0.05),Sca-1+细胞比例显著高于对照组(P<0.05),但与SB431542组比较显著降低(P<0.05);0.20 nmol·L-1RA组的CD105+和Sca-1+细胞比例显著高于0.05、0.10、0.40 nmol·L-1RA组(P<0.05)。i PS分化4 d后,SB431542组CD105+细胞和Sca-1+细胞比例显著高于对照组(P<0.05)。0.05、0.10、0.20、0.40 nmol·L-1RA组中,i PS分化的CD105+细胞比例显著高于对照组和SB431542组(P<0.05),Sca-1+细胞比例显著高于对照组(P<0.05),但与SB431542组比较均显著降低(P<0.05);0.20 nmol·L-1RA组Sca-1+细胞比例显著高于0.05、0.10、0.40 nmol·L-1RA组(P<0.05),0.20 nmol·L-1RA组CD105+细胞比例显著高于0.05、0.10 nmol·L-1RA组(P<0.05),但与0.40 nmol·L-1RA组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论利用RA可以促进ES和i PS向MSC样细胞分化,分化方法较为简单,分化周期较短,为多能干细胞向MSC样细胞的分化提供了一定的方法基础。     

脂肪基质干细胞跨胚层分化为神经干细胞的实验研究

目的：探讨脂肪基质干细胞向神经干细胞跨胚层分化的可行性,进而为神经系统损伤修复寻找理想的种子细胞．方法：无菌条件下取大鼠腹股沟脂肪组织,消化离心后低糖含血清培养基培养,待细胞生长至亚融合状态改用神经干细胞培养基诱导,用免疫荧光对诱导的细胞进行鉴定．结果：大鼠脂肪基质干细胞在相应培养条件下快速分裂增殖为大而圆并含粗大胞质颗粒的细胞,后者形成细胞球（或称“神经球”）,该细胞球表达特殊的神经干细胞Nestin抗原;若进一步将这些细胞球分离成单细胞并重新以克隆密度培养,单个的细胞又很快形成新的神经球．神经干细胞球进一步分化,可见到有的细胞胞体增大并出芽,逐渐发育成为较成熟的长突起细胞,长突起相互连接、交织成网并建立有神经纤维样联系,表达Nse或Gfap抗原．结论：大鼠脂肪基质干细胞在一定条件下可以向神经干细胞跨胚层分化．该种来源的神经干细胞可能成为中枢神经系统损伤修复的理想种子细胞．     

人类胚胎干细胞向造血细胞的自发分化

目的 研究人类胚胎干细胞自发向造血分化过程中造血干细胞和成熟血细胞标志出现时间,这将为胚胎干细胞定向诱导分化提供依据.方法 将我所建立的人类胚胎干细胞系(chESC3)自发分化形成拟胚体,RT-PCR方法检测不同时间点造血相关基因KDR、Bmil、Scl、gata2等的表达、流式细胞术检测6、8、10、12 d造血干细胞标志CD34表达,并通过造血集落培养方法检测这些时间点造血集落形成能力,最后将拟胚体制备石蜡切片,免疫细胞化学检测10、12、15、18 dCD45阳性阳性细胞数.结果 造血干细胞早期基因KDR、Bmil在hESCs中有表达,同时该基因随着拟胚体培养时间的延长,在第4～6天开始上调表达;造血干细胞标志性基因Scl,gata2在6～8 d开始表达,并且维持高表达到12 d.流式细胞术检测不同时间点hEBs中CD34阳性细胞数,发现其随时间的延长有增多的趋势,6、8、10、12 d分别为(1.4±0.4)%、(3.4±1.3)%、(5.5±2.2)%、(5.1%±1.7)%;6、8、10、12 d的拟胚体细胞进行集落培养检测形成的集落数在每105个拟胚体细胞中分别为0、7±2、37±11、89±29,P<0.01;集落细胞表达CD45,瑞士吉姆撒染色,可以检测到分叶核粒细胞;免疫细胞化学法对10、12、15、18 d拟胚体进行切片染色,发现在这4 d中可以明显观察到CD45阳性细胞的出现,并随时间的延长而数量增多,分别为:0、40.5±15.09、178.6±55.89、253.0±52.04,P<0.05.结论 在自发向造血细胞分化的过程中经历了 3个阶段:hESCs向胚层特异性细胞分化(前6～8 d);造血干祖细胞扩增期(第8～12天);成熟血细胞大量出现期(15 d以后).     

脂肪干细胞局部注射改善淋巴水肿的实验研究

目的 研究脂肪干细胞 (adipose derived stem cells, ADSCs)体内减轻炎性反应治疗淋巴水肿的可行性及作用机制,为淋巴水肿疾病的干细胞治疗探索新的思路。方法 提取小鼠皮下脂肪干细胞,体外培养、扩张至3~5代。建立淋巴水肿鼠尾模型,手术阻断鼠尾深、浅淋巴回流,造模当天,于皮下注射ADSCs或磷酸盐缓冲液(phosphate buffered solution,PBS),ADSCs组共20只小鼠,PBS对照组共30只小鼠。术后3周,分别用HE染色、Whole mount-BODIPY染色、Masson染色、免疫荧光染色检测鼠尾皮下组织/脂肪厚度、纤维化程度、淋巴管形态,干预后8周,FITC-Dextran检测淋巴回流。结果 ADSCs组淋巴水肿缓解,鼠尾体积在术后4周内较对照组减小;皮下脂肪厚度降低约40%;皮下组织的纤维化缓解,Masson染色结果显示胶原纤维所占面积比例下降约20%;高倍镜视野下的淋巴管数量未发生变化,但是横截面积减小约60%;FITC-Dextran检测淋巴回流发现,ADSCs组荧光染料通过手术切口明显多于PBS对照组。结论 ADSCs局部注射后,可缓解淋巴水肿。     

肝癌患者脂肪干细胞重编程为诱导多潜能干细胞

目的重编程肝癌患者来源的脂肪干细胞为诱导多潜能干细胞。方法包装携带Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc基因的反转录病毒,将病毒感染脂肪干细胞并培养诱导后的细胞,采用碱性磷酸酶染色、定量PCR和原位免疫荧光实验鉴定诱导的克隆样细胞。结果诱导的克隆样细胞表达碱性磷酸酶,定量PCR证实克隆样细胞表达胚胎干细胞多能性基因,免疫荧光实验证实其表达Oct4和Sox2。结论肝癌患者来源的脂肪干细胞可高效重编程为诱导多潜能干细胞,且脂肪干细胞可作为培养诱导多潜能干细胞的滋养细胞,为提高成体细胞重编程效率和建立基于诱导多潜能干细胞的肝癌模型研究提供了平台。     

miR-122在胚胎干细胞/间充质干细胞诱导成肝细胞进程中的作用

miR-122是一种肝脏特异性microRNA,在肝脏发育过程中扮演重要作用.本文主要介绍miR-122在胚胎干细胞诱导成肝细胞进程中的作用,miR-122并不促进胚胎干细胞向定型内胚层细胞方向分化,然而促进定型内胚层细胞/肝前体细胞向肝细胞分化和成熟,此作用与肝富集转录因子、上皮间质转化等密切关联.     

昆明小鼠胚胎干细胞定向分化为神经干细胞的实验研究

目的 探讨体外分离培养、诱导胚胎干细胞(ESC)分化为神经干细胞(NSC)的方法.方法 自孕3.5d的昆明小鼠获得附植前的早期胚胎,在小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)饲养层上培养获得ESC克隆. 进行Oct-4免疫细胞化学鉴定、碱性磷酸酶(AKP)染色鉴定及体外分化能力的鉴定.在无人重组白血病抑制因子(hLIF)存在的条件下将ESC悬浮培养4d,形成拟胚体(EB),再经全反式维甲酸(RA)诱导4d,在神经干细胞筛选培养基中扩增,采用免疫细胞化学方法检测NSC特异性标志物Nestin的表达.结果 所分离得到的ESC的AKP染色阳性,Oct-4表达阳性,符合ESC的一般特性.ESC经RA初步诱导,NSC选择性培养基筛选培养7d后,形成大量神经球样结构,所形成的神经球样结构呈Nestin抗原阳性.结论 体外分离得到的昆明小鼠ESC经RA诱导后,再经选择性培养基筛选培养可获得大量NSC,有望为神经系统损伤及神经变性疾病提供新的治疗途径.