T肽对树突细胞的协同作用及其对肾癌细胞抗肿瘤效应和免疫微环境的影响

目的探究T肽对树突细胞(DC)的协同作用及其对肾癌细胞的抗肿瘤效应和免疫微环境的影响。方法 (1)将人DC的培养皿分为3组:A组人DC的培养皿加入生理盐水100μl,B组人DC的培养皿加入T肽50μg/100μl,C组人DC的培养皿加入脂多糖(LPS)50μg/100μl;使用流式细胞仪检测DC成熟度,并观察DC表面共刺激分子表达。(2)将人DC的培养皿分为两组:D组人DC的培养皿加入生理盐水100μl,F组人DC的培养皿加入T肽50μg/100μl;观察人DC分泌IL-12b的情况。(3)将人肾癌细胞的培养皿分为2组:E组人肾癌细胞的培养皿加入生理盐水100μl,F组人肾癌细胞加入人DC悬液100μl;D组人肾癌细胞加入T肽50μg/100μl和人DC悬液100μl;观察T肽协同DC对肾癌细胞的凋亡率,并且检测趋化因子CCL2、CCL5、CCL20、CCL22和CCL27的表达。结果 T肽促进DC的成熟,促进其表面共刺激分子表达水平上调;T肽可促进DC分泌IL-12b;T肽联合DC组对肿瘤细胞的抑制作用最强,差异有统计学意意义(P0.05);DC组和T肽联合DC组对肾癌细胞免疫微环境的影响明显,而且T肽联合DC组对肾癌细胞免疫微环境的影响最明显(P0.05)。结论 T肽对DC具有协同作用,且可增强DC的抗肿瘤效应和对免疫微环境的影响。     

结核杆菌热休克蛋白质70作为乙型肝炎核心抗原细胞毒性T淋巴细胞表位肽载体的研究

目的探讨结核杆菌热休克蛋白质70（TB．HSP70）作为乙型肝炎病毒（HBV）核心抗原细胞毒性T淋巴细胞（CTL）表位肽载体，诱导HBV特异性免疫应答的可能性。方法体外观察重组TB．HSP70-CTL融合蛋白质和TB．HSP70／CTL复合物诱导慢性乙型肝炎患者外周血淋巴细胞增殖以及HBV特异性细胞毒活性；以Balb／c小鼠为体内研究对象，行流式细胞术分析免疫后小鼠外周血和脾细胞中CD4^＋与CD8^＋T淋巴细胞及自然杀伤（NK）细胞的比率，并观察能否诱导HBV特异性免疫保护作用。结果体内外研究表明TB．HSP70-CTL融合蛋白质和TB．HSP70／CTL复合物能有效地诱导HBV特异性细胞毒活性，体内能激活CD4^＋与CD8^＋T淋巴细胞及NK细胞增殖。在体内，TB．HSP70-CTL融合蛋白质较复合物能更有效地激活免疫应答，其杀伤率为28．9％。CD8^＋T淋巴细胞在脾细胞中比率为43．9％，NK细胞为13．6％。而单纯的TB．HSP70和CTL表位肽并不能有效地引起机体的免疫应答。结论TB．HSP70能够作为乙型肝炎核心抗原CTL表位肽的载体，提高小分子表位肽的免疫原性。     

HLA-DRβ1特异性低T细胞反应肽对类风湿关节炎T细胞激活的影响

目的　观察Ⅱ型胶原 (CⅡ ) 2 63 2 72段多肽氨基酸替换对类风湿关节炎 (RA)患者T细胞激活的影响 ,探讨以HLA DRβ1特异性低T细胞反应肽抑制RAT细胞激活的可能性。 方法　分离 3 9例RA患者外周血单个核细胞 (PBMC) ,与去除T细胞受体结合表位的CⅡ修饰肽共同孵育 ,检测T细胞增生情况及患者血清中的CⅡ抗体浓度 ;分析T细胞激活与CⅡ抗体形成以及与患者临床特点的关系。结果　 5 6%的RA患者的T细胞在加入CⅡ 2 63 2 72原型肽和CⅡ蛋白刺激后有明显增生。在T细胞增生阳性的 2 2例RA病人中 ,68%的患者T细胞对替换第 2 68、2 69、2 70位氨基酸的CⅡ 2 63 2 72修饰肽的反应明显低于CⅡ原型肽 (P <0 0 5 )。T细胞增生与CⅡ抗体水平呈显著正相关 (r =0 5 2 9,P <0 0 1)。短病程RA患者的CⅡ特异性T细胞增生较为显著。结论　RA患者的T细胞对去除T细胞受体结合表位的CⅡ修饰肽呈低反应性 ,CⅡ特异性T细胞激活与CⅡ抗体生成有密切关系。低T细胞反应性CⅡ修饰肽可能对类风湿关节炎的T细胞激活有抑制作用     

流感病毒血凝素衍生肽对T细胞活化抑制作用的研究

目的研究人类白细胞抗原(HLA)-DRB1结合性流感病毒血凝素(HA)308—317变构肽在HLA—DR4限制性T细胞激活中的作用。方法采用固相法合成HA308—317原型肽及其变构肽。通过计算机模拟及流式细胞术分析HA308—317原型肽及其变构肽与HLA-DR4分子的结合作用；并检测这些多肽对T细胞激活信号CD69表达和白细胞介素(IL)-2分泌的影响及对T细胞增殖的抑制作用。结果HA308—317变构肽能结合细胞表面HLA-DR4分子．对T细胞激活信号CD69表达和IL-2分泌无明显影响．并能抑制HA308—317原型肽诱导的T细胞活化。结论替换HA308—317多肽中识别T细胞受体(TCR)的氨基酸残基形成的HA变构肽可与HLA—DR4分子结合．而且可抑制其原型肽诱导的T细胞活化。     

血管活性肽对心脏细胞肥大与增殖的调节作用

心肌肥厚是高血压病常见的并发症,是心血管疾病的独立危险因素.心脏肥厚包括细胞和细胞外基质的增多.除压力超负荷的机械刺激外,神经体液因子及血管活性物质在致心肌肥厚过程中起重要作用.虽然血管活性肽最先被发现是因为它们对血流动力学的作用,但是越来越多的证据显示血管活性肽对心肌肥厚有正性或负性调节作用.近年来研究发现血管活性多肽是心脏细胞的自分泌/旁分泌因子,在心脏局部对心肌细胞的肥大和成纤维细胞的增殖起重要的调节作用[1].本文拟综述3种对心血管系统有重要生理功能的血管活性多肽--血管紧张素Ⅱ(AngⅡ),内皮素-1(ET-1)、心钠素(ANP)对心肌细胞的肥大和成纤维细胞的增殖的调节作用,并初步探讨其机制.     

钙拮抗剂对高血压患者血管活性肽的影响及其意义

目的:探讨钙拮抗剂对高血压病患者血管活性肽的影响及其意义. 方法:应用放免法同步测定钙拮抗剂治疗前后的高血压病组(n=62)和正常对照组(n=50)的血浆ET、CGRP、NPY、NT的浓度水平. 结果:高血压病组治疗前ET、NPY均明显高于正常对照组;CGRP、NT则低于正常对照组,且NPY与NT、ET与CGRP呈显著负相关,而舒张压与ET、NPY呈正相关.治疗后收缩压、舒张压和ET、NPY均明显下降,而CGRP、NT水平明显升高. 结论:NPY与NT、ET与CGRP的浓度水平对高血压病的病理生理过程具有重要的影响,而钙拮抗剂通过对高血压病患者的血浆血管活性肽的调节作用以达到保护靶器官的目的,且非洛地平的作用强于硫氮酮.     

4T42肽腺病毒载体的构建包装及抗SKBR3乳腺癌细胞的效果

目的构建携带有肿瘤抑素相关T42肽(以下简称T42肽)基因的重组腺病毒载体,并转染HEK293细胞中进行病毒包装,最终感染SKBR3乳腺癌细胞,体外四倍体T42肽(4T42)抗SKBR3乳腺癌细胞的效果。方法利用同尾酶连接技术将T42肽进行两次克隆形成4T42,并将其亚克隆至穿梭质粒pEC3.1(+)-EGFP中,获得重组质粒pEC3.1(+)-EGFP-4T42。体外重组至骨架载体pAd/BLOCK-iTTM-Dest(pAd-BL-Dest),获得重组质粒pAd-EGFP-4T42。将该重组骨架质粒转染HEK293细胞,利用RT-PCR方法和荧光显微镜观察标志蛋白-绿色荧光蛋白的表达情况以判断T42转染成功与否。利用病毒倍比稀释法利用荧光显微镜检测病毒滴度,用重组腺病毒感染SKBR3乳腺癌细胞。采用流式细胞仪检测感染重组腺病毒的SKBR3胞凋亡率,MTT实验检测感染重组腺病毒的MCF细胞的生长情况。结果重组腺病毒载体经酶切鉴定证明构建正确,重组腺病毒获得成功包装,纯化的病毒滴度为4*108 DRP/ml。重组腺病毒rAd-EGFP-4T42感染MCF细胞后较对照组未转染空白组细胞凋亡率高(P<0.05);Ad-EGFP-4T42质粒转染组与对照组相比,明显抑制MCF细胞生长(P<0.05)。结论体外4T42肽具有显著促进SKBR3乳腺癌细胞凋亡和抑制SKBR3乳腺癌细胞生长的作用。     

血管活性肠肽受体在大鼠肝脏贮脂细胞的表达及其在肝纤维化中的意义

在特异引物引导下，用反转录ＰＣＲ方法扩增出预期长度的大鼠血管活性肠肽受体（ｖａｓｏａｃｔｉｖｅｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｐｅｐｔｉｄｅｒｅｃｅｐｔｏｒＶＩＰ－Ｒ）的ｃＤＮＡ片断（７５０ｂｐ），随后该ｃＤＮＡ片段与３２Ｐ－标记的ＶＩＰ－Ｒ探针进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交，结果证实大鼠肝脏贮脂细胞有ＶＩＰ－Ｒ的ｍＲＮＡ表达。放射受体交联试验表明贮脂细胞上存在ＶＩＰ－Ｒ的蛋白，分子量约４０ＫＤ。不同浓度的ＶＩＰ（０．１５ｎｍ－１５０ｎｍ）作用于培养的大鼠贮脂细胞，能显著抑制细胞Ⅰ型胶原的分泌并呈量效关系（ｒ＝－０．９８９，ｎ＝６，Ｐ＜０．００１）。ＶＩＰ受体拮抗剂［Ｄ－Ｐ－ｃｌ－Ｐｈｅ６，Ｌｅｕ１７］－ＶＩＰ能减弱ＶＩＰ这一作用。这些结果表明：大鼠贮脂细胞上存在ＶＩＰ－Ｒ；ＶＩＰ通过ＶＩＰ－Ｒ影响贮脂细胞的胶原分泌并可能在肝纤维化的发病过程中起一定的调节作用。     

肌注胎盘免疫肽对免疫功能低下患者的N1细胞活性、T淋巴细胞亚群的变化

我院近二年来肌肉注射胎盘免疫肽治疗细胞免疫功能低下患数十例，均作NK细胞活性及T淋巴细胞亚群的检测，资料较完整，有治疗前、后对照的病例共20例．并设正常对照组21例．结果表明肌盘免疫肚能提高NK细胞活性(P<0．05)，并使CD^ 2明显提高(P<0．001)．治疗后达正常对照组水平。     

血管活性肠肽对大鼠贮脂细胞Ⅰ型胶原分泌的影响

我们研究发现在传代培养的大鼠贮脂细胞中，不同浓度的血管活性肠肽（Ｖａｓｏａｃｆｉｖｅｉｎｆｅｓｆｉｎａｌｐｅｐｔｉｄｅ，ＶＩＰ）能显著抑制Ⅰ型胶原分泌并呈量效关系。ＶＩＰ受体拮抗剂能减弱ＶＩＰ这一作用，从而更加肯定ＶＩＰ抑制胶原分泌的作用。本研究提示：大鼠贮脂细胞膜上存在ＶＩＰ受体；ＶＩＰ在肝纤维化和肝硬化时浓度升高可能调节肝脏胶原代谢。     

Modulation of intein activity by its neighboring extein substrates

Inteins comprise a large family of phylogenetically widespread self-splicing protein catalysts that colonize diverse host proteins. The evolutionary and functional relationship between the intein and the split-host protein, the exteins, is largely unknown. To probe an association, we developed an in vivo and in vitro intein assay based on FRET. The FRET assay reports cleavage of the intein from its N-terminal extein. Applying this assay to randomized extein libraries, we show that the nature of the extein substrate bordering the intein can profoundly influence intein activity. Residues proximal to the intein-splicing junction in both N- and C-terminal exteins can accelerate the N-terminal cleavage rate by >4-fold or attenuate cleavage by 1,000-fold, both resulting in compromised self-splicing efficiency. The existence and the magnitude of extein effects require consideration for maximizing the utility of inteins in biotechnological applications, and they predict biases in intein integration sites in nature.     

Mef2c真核表达载体的构建及其在HEK293T细胞中的表达

目的构建小鼠Mef2c基因真核表达质粒并转染HEK293T细胞。方法采用RT-PCR方法从小鼠心脏组织的总cDNA中扩增出小鼠的Mef2c的基因,采用基因重组技术将Mef2c的cDNA片段插入真核表达载体peD—NA3．1（＋）,构建小鼠Mef2c真核表达质粒,脂质体转染HEK293T细胞进行表达。结果酶切和测序结果证实Mef2c真核表达质粒构建成功,经脂质体转染293T细胞后,Western blot检测证明Mef2c蛋白在真核细胞中成功表达。结论成功构建真核表达质粒pcDNA3．1（＋）．Mef2c,为进一步研究小鼠Mef2c在心肌分化过程中的作用及其调控机制奠定了实验基础。     

GFP基因真核表达质粒的构建及其在人胚肾293细胞中的表达

目的 克隆绿色荧光蛋白（GFP）基因并构建真核表达载体，观察其在人胚肾293（下称293细胞）细胞中的表达和分布，为制备自行设计的以λ噬菌体为载体的人类免疫缺陷病毒（HIV）核酸疫苗的阳性对照奠定基础。方法 以克隆好的pUC18／GFP为模板，根据Genbank中GFP的核苷酸序列设计引物，并在引物的5′端分别引入BamHⅠ及XhoⅠ酶切位点，特异性扩增GFP基因。TA克隆后经双酶切、测序等鉴定重组质粒，再经双酶切、连接构建含GFP编码基因的真核表达载体，酶切鉴定分析后，将该重组质粒通过脂质体介导，转染293细胞。荧光显微镜观察GFP在细胞内的表达和分布。结果重组质粒经Barn HⅠ、XhoⅠ双酶切成5．4kb与0．7kb的片断，表明表达载体pcDNA3．1（＋）中插入了GFP基因片断，测序结果表明编码框正确，并在293细胞中获得了表达，分布均匀。结论 pcDNA3．1（＋）／GFP真核表达载体已成功构建，并可在293细胞中表达。     

VEGF121和BMP2双基因共表达重组腺病毒载体的构建及其在HEK293中的表达

目的构建人血管内皮生长因子121（VEGF121）与人骨形态发生蛋白2（BMP2）双基因共表达腺病毒载体Adv-BMP2-IRES-VEGF121,并观察其在人胚肾细胞株（HEK293）中的表达情况。方法对腺病毒质粒pShuttle-CMV-BMP2的目的基因BMP2进行PCR扩增。腺病毒质粒pShuttle-CMV-VEGF121-IRES-hrGFP-1经Kpn I/Xba I酶切后,将BMP2片段定向导入pShuttle-CMV-VEGF121-IRES,构建pShuttle-CMV-V EGF121-IRES-BMP2,并注入大肠杆菌DH5a中扩增,提取质粒。通过酶切分析、PCR检测和序列分析进行鉴定。将构建所得的质粒转染HEK293,采用RT-PCR法检测HEK293中的BMP2、VEGF121 mRNA,Western blot法检测其蛋白。结果成功构建了Adv-BMP2-IRES-VEGF121。酶切分析及DNA序列测定证实重组质粒构建正确。质粒转染后的HEK293 BMP2和VEGF121表达阳性。结论成功构建了Adv-BMP2-IRES-VEGF121,其转染HEK293后,VEGF121、BMP2在HEK293中共表达阳性。     

人TSH受体胞外段高效表达质粒的构建、表达及蛋白纯化

利用基因重组方法 ,构建hTSHRecd基因片段原核表达系统 (E .coliM15 )。hTSHRecd蛋白表达量大 ,纯化得到毫克级高纯度的hTSHRecd蛋白 ,可与TSHR自身抗体及TSH特异性结合 ,具有免疫活性及一定生物活性     

Aldolase A-HBsAg interaction and its effect on ultraviolet radiation induced apoptosis in 293FT cells

Background and Aim: Hepatitis B virus (HBV) infection poses great challenges to humans, claiming one million lives annually worldwide. Solid data have related HBV to hepatocellular carcinoma. Methods: In the present research, we verified the interaction between surface protein (HBs) encoded by HBV and aldolase A (ALDA) using yeast two‐hybrid, mammalian two‐hybrid, co‐immunoprecipitation, GST pull‐down and laser scanning confocal. Results: Anti‐ALDA antibody precipitated Gal4‐HBs fusion protein in the presence of HBs. Anti‐HBs antibody precipitated p65ΔN‐ALDA only in the presence of ALDA. Small HBs could be pulled down by GST‐ALDA. Cells transfected with pCMV‐AD‐ALDA showed a protection from ultraviolet radiation‐induced apoptosis (21.3% ± 1.3% for ALDA, 35.4% ± 2.1% for control, P < 0.05). Conclusions: An interaction does exist between ALDA and HBs. The S region within HBs is sufficient for binding ALDA. In addition, ALDA conferred protection to ultraviolet radiation‐induced apoptosis, and this effect was enhanced by the interaction between HBs and ALDA.     

Heat shock protein 70 binds caspase-activated DNase and enhances its activity in TCR-stimulated T cells

DNA fragmentation is a hallmark of cells undergoing apoptosis and is mediated mainly by the caspase-activated DNase (CAD or DNA-fragmentation factor 40 [DFF40]), which is activated when released from its inhibitor protein (ICAD or DFF45) upon apoptosis signals. Here we analyzed the effect of heat shock protein 70 (Hsp70) on CAD activity in T-cell receptor (TCR)-induced apoptosis using a T-cell line (TAg-Jurkat). Overexpression of Hsp70 significantly augmented the apoptotic cell death as well as DNA fragmentation in CD3/CD28- or staurosporine-stimulated cells. Following stimulation of cells with CD3/CD28 or staurosporine, Hsp70 was coprecipitated with free CAD, but not with CAD associated with ICAD. Furthermore, the purified Hsp70 dose-dependently augmented DNA-fragmentation activity of caspase-3-activated CAD in a cell-free system. Peptide-binding domain-deleted Hsp70 could neither bind nor augment its activity, while adenosine triphosphate (ATP)-binding domain-deleted Hsp70 or the peptide-binding domain itself bound CAD and augmented its activity. These results indicate that the the binding of Hsp70 to the activated CAD via the peptide-binding domain augments its activity. Although CAD lost its activity in an hour after being released from ICAD in vitro, its activity was retained after an hour of incubation in the presence of Hsp70, suggesting that Hsp70 may be involved in stabilization of CAD activity. Finally, CAD that had been coprecipitated with Hsp70 from the cell lysate of staurosporine-activated 293T cells induced chromatin DNA fragmentation and its activity was not inhibited by ICAD. These results suggest that Hsp70 binds free CAD in TCR-stimulated T cells to stabilize and augment its activity.     

人脂联素基因真核表达载体的构建及在HEK293细胞中的表达

目的构建人脂联素（APM1）基因真核表达载体，并检测其在HEK293细胞中的表达水平。方法用PCR法从测序正确的pGEM-T-APM1质粒上，扩增出两端带有Sfi Ⅰ酶切位点的人脂联素基因，再将扩增出的片段亚克隆到T载体上，用sfi Ⅰ酶切T载体和pCDEF空载体，将酶切后的片段进行连接、转化、筛选、鉴定、测序。将成功构建的pCDEF—APM1质粒转染HEK293细胞，ELISA检测培养上清中脂联素的水平。结果构建的pCDEF-APM1质粒能有效转染HEK293细胞，并在培养上清中检测到较高水平的脂联素蛋白。结论成功地构建了人脂联素基因的真核表达载体，并在HEK293细胞中获得高效表达。     

FAT10真核质粒的构建、转染及其蛋白的表达

目的构建类泛素基因FAT10的真核表达质粒,观察其蛋白在转染人胚肾细胞系293T中的表达。方法采用RT-PCR法扩增FAT10全长基因片段后,克隆至pMD18-T载体进行测序分析,将FAT10克隆至pcDNA5-FRT表达载体并行酶切鉴定;用脂质体LipofectamineTM2000分别介导空质粒（空载组）及重组质粒（FAT10质粒组）转染293T细胞,以脂质体混合PBS（PBS组）及未加入脂质体（未转染组）作为对照。转染48 h后,收集细胞。采用Western blot法检测293T细胞中的FAT10蛋白。结果 pMD18-FAT10重组质粒经双酶切获得498 bp片段,对PCR产物及498 bp片段进行测序,结果与GenBank报道序列完全一致。FAT10质粒组、未转染组、空载体组和PBS组FAT10蛋白表达量分别为1.556±0.072、0.334±0.051、0.425±0.095、0.382±0.063,FAT10质粒组与未转染组、空载体组和PBS组比较,P均〈0.05。结论成功构建了FAT10的真核表达质粒pcDNA5-FRT-FAT10,FAT10蛋白在293T细胞中高表达。