持续阴道超声辐射后人胚早孕绒毛细胞超微结构的变化研究

目的探究持续阴道超声辐射后人胚早孕绒毛细胞超微结构的变化。方法选取我院2010年9月至2012年3月期间进行人流的早孕患者80例,将其均分为两组,试验组患者阴道超声照射10min,而对照组患者则照射5min,然后在照射后24-30h进行人流并取绒毛组织进行检测,比较两组患者照射后绒毛组织DNA及其超微结构的变化情况。结果经过检测得到,试验组患者的绒毛组织单链DNA量为（0．19±0．06）μg／μl,双链DNA量为（0．15±0．09）μg／μl,明显低于对照组患者的（0．23±0．07）μg／μl和（0．19±0．07）μg／μl,差异均具有统计学意义（P〈0．05）,试验组患者的绒毛组织超微结构发生异常者40．00％,对照组为10．00％,差异也具有统计学意义（P〈0．05）。结论降低患者进行阴道超声辐射的时间可以减少患者绒毛细胞超微结构的改变。     

人胚细胞的体外培养

目的：为医学研究长期提供培养的人胚细胞。方法：体外培养人胚细胞，观察其生长特性、染色体数目以及冻存和复苏的条件。结果：培养的人胚肺、皮肤、肾、脾及脑组织中，肺和皮肤细胞在冻存前后增长速度较快而稳定，染色体数目为２ｎ＝４６，占８７％￣９１％；肾、脾细胞扩增缓慢；脑组织几乎不能扩增。结论：人胚肺和皮肤细胞可长期培养，可为医学研究提供二倍体细胞实验对象。     

鼻咽癌细胞鸡胚绒毛尿囊膜移植瘤模型的建立

目的研究鼻咽癌鸡胚绒毛尿囊膜移植瘤模型的建立。方法接种梯度递增的鼻咽癌细胞及对照组于鸡胚,对生长出的移植瘤行原位数码摄影,体积测量,组织切片观察。结果鼻咽癌细胞可在鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)形成移植瘤;该移植瘤可模拟鼻咽癌人体内生长模式;鼻咽癌细胞在CAM上适宜成瘤接种细胞数是0.5～1×106。结论成功地建立了鼻咽癌CAM移植瘤模型,为开展鼻咽癌生物学行为研究奠定又一个技术平台。     

人胎盘绒毛膜滋养层细胞的培养

目的 建立纯度较高的适于试验研究的人绒毛膜滋养层细胞。方法 胰蛋白酶-DNase联合消化法培养人绒毛膜滋养层细胞，间接免疫染色进行细胞鉴定。透射电镜观察细胞内部结构。结果 倒置显微镜下，可见细胞呈不规则多角形，核大卵圆形，胞质透明，呈片状铺展生长，角蛋白染色阳性率超过95%，未检测到波形蛋白阳性细胞，表明不含污染细胞。透射电镜观察示所获细胞有典型滋养层细胞结构。结论 该法简便易行，可获得合乎试验要求的人绒毛膜滋养层细胞。     

原代人绒毛滋养层细胞分离培养及其对巨细胞病毒的易感性研究

目的通过分离培养原代人绒毛滋养层细胞(HTCs)并检测其对人巨细胞病毒(HCMV)的易感性,探讨胎儿宫内感染HCMV的可能途径。方法将30例健康孕妇经负压真空吸引手术所得的流产早孕绒毛组织充分剪碎,用0.25%胰蛋白酶和0.2%DNA酶混合消化法制备细胞悬液,细胞悬液经200目不锈钢筛网过滤后用Percoll液密度梯度离心对HTCs进行初步纯化,细胞传代中应用反复胰酶消化法对HTC进行3～5次纯化,通过细胞学形态观察和免疫荧光染色方法对HTCs进行鉴定;用HCMV病毒株体外感染HTCs,应用PCR、Westernblot和免疫荧光方法对HCMV基因及蛋白进行检测,从而确定HTCs对HCMV的易感性。结果 Percoll分离联合胰酶、DNA酶消化法对原代HTCs有较好的分离效果,免疫荧光染色结果表明90%以上细胞表达CK-7相关抗原,HTCs体外感染HCMV 72h后形态学发生明显改变,病毒基因及蛋白均呈阳性表达。结论原代HTCs对HCMV易感,通过HTCs感染胎儿可能是HCMV宫内感染的重要传播途径之一。     

刺五加对人胚肺二倍体纤维母细胞生长的影响

目的 :探讨刺五加 (APS)对人胚肺二倍体纤维母细胞 (2 BS)增殖、凋亡的影响。方法 :采用生物活性法观察不同浓度APS在不同时间对 2 BS细胞增殖的抑制作用 ,利用流式细胞仪检测其诱导 2 BS细胞凋亡小体形成百分率及对细胞周期的影响 ,并与甲基强的松龙 (M- pred)比较。结果 :1APS和 M- pred对 2 BS细胞均有增殖抑制作用 ,与无药空白对照组比较差异有统计学意义 (P <0 .0 1) ,但两药作用相比差异无统计学意义 (P >0 .0 5 ) ;2 APS和 M- pred均有诱导 2 BS细胞凋亡作用 ,主要作用于 S期 ,2 BS细胞凋亡小体形成百分率与无药空白对照组比较差异均有统计学意义 (P <0 .0 1) ,但两药作用相比差异无统计学意义 (P >0 .0 5 )。结论 :APS有显著抑制 2 BS细胞增殖并诱导其凋亡的作用、活性与 M- pred相近 ,但由于 APS尚有多种药理作用而无不良副反应 ,所以是治疗肺纤维化较好的药物。     

葛根素和葛根粗提物对H446细胞生长及对PCNA基因表达的影响

目的:比较葛根素(standard of pure puerarin,SP)和葛根粗提物(pueraria crude extract,CP)对小细胞肺癌H446生长的影响.方法:运用MTT法、流式细胞术、细胞免疫化学方法观察SP和CP对H446细胞生长、凋亡、细胞周期分布以及对PCNA基因表达的影响.结果:CP组和SP组细胞凋亡率分别为14.71%和2.61%,差异具有统计学意义(P<0.05);G0/G1期细胞构成比分别为79.20%和72.20%,G2/M期细胞构成比分别为8.94%和10.50%,与对照组相比,差异均具有统计学意义(P<0.05);CP作用于H446细胞后,PCNA蛋白表达量减少,与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05).结论:CP和SP均可抑制H446细胞增殖,且CP强于SP;SP和CP可诱导细胞凋亡,其机制可能与其导致细胞G0/G1期阻滞、PCNA表达下调有关.     

体外培养人胚晶状体上皮细胞生长特性的研究

目的观察体外培养人胚晶状体上皮细胞的生物学特性。方法组织块贴壁法培养人胚晶状体上皮细胞,通过倒置相差显微镜、透射电子显微镜,采用免疫细胞化学法分析人胚晶状体上皮细胞的生长特性。结果体外培养的原代人胚晶状体上皮细胞在组织块贴壁48～72 h后从组织块边缘长出,具有上皮细胞的形态特点,第10天达到融合。第二代人胚晶状体上皮生长曲线近＂S＂形,经过1～2 d的潜伏期后进入对数生长期,需10 d左右达到融合,细胞形态呈六角形或椭圆形、超微结构保持正常,免疫细胞化学SABC法染色结果显示细胞浆内α-晶状体蛋白染色阳性。结论人胚晶状体上皮细胞具有增殖能力,第二代人胚晶状体上皮细胞是进行白内障相关研究的合适实验对象。     

人胚胎多能干细胞研究中的几个问题

目前在人胚胎多能干细胞的研究中存在材料来源不足、培养体系复杂和自发性分化的问题.这3个基本问题限制了人胚胎多能干细胞的基础和临床应用研究.要建立新的胚胎多能干细胞系应利用细胞核移植和细胞质重新编程功能建立新的途径,并探讨其中的机制和可能的关键因子;干细胞培养时主要进行简化培养体系和抑制细胞分化的研究;对干细胞分化进行临床应用研究时,主要将多种方法联合应用来诱导和筛选目的细胞并对其形态和功能进行评价.     

人胚神经干细胞的冻存与复苏

目的：研究神经干细胞浆存复苏后的成活率及再培养生长情况。方法：利用无血清培养基短期体外培养胚胎来源的神经干细胞后，以冻存液（体积分数为70％DMEM／F12，体积分数为20％胎牛血清，10％DMSO）进行冻存，于1周，4周，8周，12周，16周，20周，24周分别复苏，计活细胞比例并进行再培养。结果：复苏后神经干细胞的成活比例分别为68％、65％、65％、62％、61％、60％、60％，再培养生长良好。结论：本实验对神经干细胞成功地进行了冻存，复苏和再培养，对临床择期进行神经干细胞移植手术和建立“神经干细胞库”具有重要的意义。     

组织型纤溶酶原激活剂在人胚胎表皮角质形成细胞分化中的作用

目的 探讨组织型纤溶酶原激活剂（tPA)参与人表皮角质形成细胞（KC）分化调控的作用。方法 采用免疫细胞化学（ICC）及原位杂交（ISH）技术定性、定量检测早、中、晚期人胚胎表皮KC中tPA蛋白及mRNA的表达。结果 （1）tPA在人胚胎期表皮KC中表达量明显高于出生后期。胚胎期的表达高峰在胚胎中期。胚胎晚期其蛋白水平开始降低。而tPAmRNA表达则维持在相对较高水平。（2）tPA在人胚胎期主要存在于分化程度高的表皮浅层KC内。（3）tPA聚集于KC胞膜下方。结论 tPA参与表皮KC分化的调控。     

埃本膦酸钠对肺癌H446细胞体外粘附、移动和侵袭的影响

目的 :研究埃本膦酸钠 (BM 2 1 0 95 5 )对人小细胞肺癌细胞系H4 4 6在体外的粘附、移动及侵袭能力的影响。方法 :经BM 2 1 0 95 5体外诱导的H4 4 6细胞 ,应用SRB比色法测定其在重构基膜Matrigel胶上的粘附 ,使用Millicell PCF培养系统计数测定细胞的移动力和侵袭力。　结果 :BM2 1 0 95 5诱导的H4 4 6细胞在 2 4 0min粘附实验中的粘附率下降 32 .1 1 % (P <0 .0 5 ) ,而其移动和侵袭能力在 4～ 72h内均有显著下降 (P <0 .0 5 )。　结论 :BM 2 1 0 95 5可抑制人小细胞肺癌H4 4 6的体外粘附、移动和侵袭作用     

缺氧对人小细胞肺癌H446细胞基因组DNA甲基化水平的影响

目的研究缺氧对人小细胞肺癌H446细胞基因组DNA甲基化水平的影响。方法体外培养人小细胞肺癌细胞H446,置于缺氧(3%O2)条件下培养,分别于0、12、24、48、72 h后提取细胞基因组DNA,用甲基化敏感性随机引物PCR(MS-AP-PCR)方法检测基因组DNA甲基化状态。结果在缺氧状态下,H446细胞经酶解后的扩增谱带明显增多,且荧光强度较强,以24 h后明显,表明H446细胞基因组DNA甲基化水平在缺氧24 h后即发生明显升高,主要表现为多位点的异常甲基化。结论缺氧可能是造成肿瘤细胞内甲基化失衡的重要原因之一。     

不同造血微环境对诱导人胚胎干细胞向造血细胞分化的影响

目的:通过观察人卵黄囊基质细胞、人胎肝基质细胞和人胎骨髓基质细胞对人胚胎干细胞向造血细胞分化诱导效率,探讨不同造血微环境对造血发生的影响.方法:本实验诱导人胚胎干细胞分化为造血细胞的方法采用两步法:先用细胞因子培养形成5 d的拟胚体,然后再模拟体内造血发生的微环境,分别用人卵黄囊基质细胞、人胎肝基质细胞和人胎骨髓基质细胞诱导拟胚体10 d,通过流式细胞术检测细胞的flk,CD34和CD45表面抗原表达情况,观察3种基质细胞对人胚胎干细胞向造血细胞分化的影响.结果:5 d拟胚体与卵黄囊基质细胞接触培养10 d生成的细胞表达flk,CD34,CD45百分率分别1.80%±0.56%,1.30%±0.14%,1.05%±0.63%;与胎肝基质细胞接触培养10 d生成的细胞表达为flk,CD34,CD45百分率分别为34.0%±25.45%,38.4%±24.8%,72.6%±25.7%;与骨髓基质细胞接触培养10 d生成的细胞表达flk,CD34,CD45百分率分别为2.50%±1.48%,3.20%±0.56%,1.65%±0.21%;5 d拟胚体自发分化10 d生成的细胞表达flk,CD34,CD45百分率分别为0.30%±0.07%,0.65%±0.07%,0.15%±0.07%.与自发分化10 d比较,3种基质细胞与5 d拟胚体接触培养,均能够促进拟胚体向造血细胞的分化,且胎肝基质细胞诱导的效率显著优于其他两种基质细胞(P＜0.05).结论:与卵黄囊基质细胞和骨髓基质细胞比较,胎肝基质细胞更有利于诱导人胚胎干细胞向造血细胞的分化.     

人胚神经干细胞体外免疫原性测定

目的:探讨人胚神经干细胞体外免疫原性情况.方法:取孕14周流产人胚侧脑室下区细胞,进行分离、培养、鉴定.提取人胚神经干细胞和正常人外周血单核细胞中的RNA,采用RT-PCR法反转录,扩增,电泳,观察目的条带.根据外周血单核细胞培养分4组:阴性对照组以外周血单核细胞单独培养,实验组为B、C组分别以103ml-1、105ml-1神经干细胞加入外周血单核细胞中共培养,阳性对照组将植物血凝素以0.1 mg/L加入外周血单核细胞中共培养.用MTT比色法测定刺激后外周血单核细胞增殖能力.结果:RNA反转录后电泳条带显示神经干细胞表达HLA-A、HLA-DRA,MTT比色法细胞活力测定显示:B组、C组D(490 nm)分别为0.4450±0.0265、0.5675±0.0781,C组与阳性对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05),B组、C组与阴性对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05).结论:人胚侧脑室下区的神经干细胞在体外有一定的免疫原性,可促进外周血单核细胞增殖,移植时需注意免疫排斥问题.     

表皮生长因子对大鼠胚胎神经干细胞增殖分化的影响

目的：建立神经干细胞分离、培养的技术方法,探讨表皮生长因子(EGF)对大鼠胚胎神经干细胞增殖、分化的影响。方法：从大鼠胚胎大脑组织中分离、培养神经干细胞,并用EGF和血清诱导其分化,采用免疫细胞化学方法鉴定神经干细胞增殖和分化的神经样细胞。结果：大鼠胚胎神经干细胞在无细胞因子和血清的培养基中无新生细胞形成,但能在EGF和血清的诱导下产生nestin和BrdU阳性细胞,细胞贴壁后分化为神经元和星形胶质样细胞。结论：EGF和血清能促进神经干细胞增殖,并诱导其向神经元样和星形胶质样细胞分化。     

不同发育阶段人胚胎原始生殖细胞的定位及体外培养

目的:对不同发育阶段的人胚胎原始生殖细胞(PGC)进行定位并比较其体外培养的差异.方法:取4～7周发育阶段的人胚胎,应用组织化学法检测PGC内碱性磷酸酶(AP)以对其定位.体外分离人胚胎生殖嵴和肠系膜组织进行培养,第1次传代后,用AP标记,计数不同发育阶段AP阳性的PGC和体外培养的阳性克隆并进行比较.结果:在卵黄囊、原肠、背侧肠系膜和生殖嵴处有AP强阳性细胞,阳性信号位于胞质内.阳性细胞散在分布,在生殖嵴处聚集成团.不同发育阶段的胚胎组织培养均有阳性克隆出现.统计学分析结果表明,4～7周人胚胎内AP阳性的PGC数目及细胞内信号强度无明显差异(P>0.05);由胚胎组织培养获得的AP阳性克隆数也无显著差异.结论:人PGC位于卵黄囊、原肠、背侧肠系膜和生殖嵴处.4～7周发育阶段,胚胎内PGC数目和体外培养的克隆数无明显变化.