肾细胞癌患者的血管内皮生长因子和血管内皮抑制素的血清水平研究

肾细胞癌（RCC）是一种血管肿瘤。我们已经广泛认同了肿瘤血管生成在肿瘤生长和转移扩散时的重要性。因此,我们评定了RCC患者和健康对照组血管内皮抑制素和血管内皮生长因子（VEGF）的血清水平,评价了患者存活因素的预兆作用,区分了关于肿瘤分期、分级和大小的组织亚型。     

肌肉注射内皮抑素基因抑制人大肠癌生长的研究

目的探讨内皮抑素基因治疗大肠癌简便有效的途径.方法构建内皮抑素表达载体,建立BALB/C-nu/n裸鼠大肠癌模型,裸鼠分为3组,每组8只,分别通过肌肉注射生理盐水、对照质粒和表达质粒pST-endo,研究内皮抑素对结肠癌生长的影响.结果荷瘤小鼠经肌肉注射内皮抑素质粒DNA后,肿瘤内细胞凋亡率为24.5±7.3,空白质粒和生理盐水肌肉注射组小鼠肿瘤内细胞凋亡率分别是8.9±2.7和10.2±3.6,前者明显高于后两者;肿瘤内微血管密度(21.7±2.8)却大大少于空白质粒(44.6±11.0)和生理盐水(50.8±13.4)注射组;肿瘤体积在各时间段也明显小于对照的后两组.结论肌肉介导的内皮抑素基因转移治疗大肠癌效果确切.     

重组逆转录病毒载体介导人ANGPTL4基因的抗肝癌作用

目的构建重组逆转录病毒载体pMSCV-ANGPTL4,并检测该重组逆转录病毒载体所介导的人ANGPTL4基因的抗肿瘤作用。方法将ANGPTIA cDNA亚克隆至逆转录病毒载体质粒 pMSCV。用脂质体法将重组病毒pMSCV-ANGPTL4转染HepG2细胞。流式细胞术和荧光显微镜检测 HepG2细胞绿色荧光蛋白的表达。RT-PCR法检测ANGPTL4 mRNA的表达。检测HepG2细胞体内外生长情况。结果重组病毒pMSCV-ANGPTL4和空病毒pMSCV的病毒滴度分别为1．4×106和 1．5×106感染性病毒颗粒／ml。表达GFP的HepG2-ANGPTL4细胞组和HepG2-pMSCV细胞组的阳性细胞率分别为68．45％和77．72％。HepG2-ANGPTL4细胞组和HepG2-pMSCV细胞组的平均荧光强度比对照组HepG2细胞分别高31．68倍和64．87倍。HepG2-ANGPTL4细胞组ANGPTL4 mRNA的表达分别是HepG2-pMSCV细胞组和HepG2细胞组的154％和161％。HepG2-ANGPTL4细胞组的体外增殖速度较之HepG2-pMSCV细胞组和HepG2细胞组明显降低(P<0．01)。HepG2-ANGPTL4细胞荷瘤裸鼠肿瘤的平均体积和重量均较HepG2-pMSCV细胞组和HepG2细胞组明显降低(P<0．01)。结论获得稳定转染ANGPTL4基因的人肝癌细胞株HepG2-ANGPTL4。重组逆转录病毒载体所介导的人 ANGPTL4基因转移很可能是一种有效的肝癌基因治疗方式。     

血管生成抑制素基因对裸鼠人肝癌移植瘤的治疗作用

肿瘤血管的快速生成是原发性肝癌生长和转移的前提,肿瘤血管一直作为抗肿瘤的研究对象而倍受关注[1]。本研究旨在观察血管生成抑制素(As)基因对人原发性肝癌裸小鼠皮下移植瘤的治疗作用。一、材料和方法1.质粒和实验动物:真核表达质粒pCDNA3/angio由中国医学科学院昆明医学生物学研究所构建并惠赠。人原发性肝细胞癌SMMC7721细胞株购自武汉大学中国典型培养物保藏中心。BALB/C雄性裸小鼠(购自上海市肿瘤研究所),共20只,5～6周龄,体重(18.1±0.5)g。2.主要试剂和仪器:原位细胞凋亡检测试剂盒:华美公司。放射免疫γ计数器:SN682型,上海…     

血管生成抑制素的研究进展

血管生成与肿瘤的生长、侵袭和转移密切相关,目前抑制血管生成作为靶点治疗肿瘤成为抗肿瘤治疗新疗法之一。血管生成抑制素（angiostatin）是纤溶酶原在体内的天然水解产物,能够有效抑制血管内皮细胞的增殖、迁移和管状结构的形成而参与对血管生成过程（angiogenesis）的调节。本文主要介绍近年来关于血管生成抑制素的研究进展以及作为治疗药物的应用前景。     

重组人血管内皮抑制素对血管内皮细胞的作用

目的：探讨重组人血管内皮抑制素（YH-16）对血管内皮细胞（EC）的作用。方法：传代培养ECV304，将不同浓度的YH-16作用于生长旺盛的EC，以MTT法筛选有效浓度。以有效浓度的YH-16作用于EC，在不同时相点光镜下观察EC形态，MTT检测细胞活性，流式细胞术检测细胞周期，实时荧光定量PCR检测VEGF的表达量。结果：YH-16作用后，光镜下可见EC发生弥散性坏死。MTT检测显示吸光度降低，流式细胞术示G2期细胞比例增多，实时荧光定量PCR检测示VEGF表达量明显降低。结论：YH-16可明显抑制EC的生长增殖，可能通过抑制EC分泌VEGF，从而抑制EC增殖、迁移及血管的形成。     

抗血管内皮生长因子抗体对实验性肝癌的生长抑制作用

目的了解抗血管内皮生长因子(VEGF)抗体对人肝癌的生长抑制作用.方法在已建立的人肝癌裸鼠皮下种植瘤的瘤灶旁,注射抗VEGF抗体,观察肿瘤生长情况,用CD31的免疫组化方法检测肿瘤内部的微血管密度(iMVD),用原位末端转移酶标记技术检测凋亡的肿瘤细胞.结果实验结束后1周,实验组和对照组肿瘤大小(长×宽)是(26.46±19.81) mm2和(105.77±17.40) mm2(P<0.001),2周后是(45.20±23.02) mm2和(150.77±77.41) mm2(P<0.05),而此时肿瘤的iMVD是(2 311±120)个/mm2和(3 900±328)个/mm2 (P<0.001); 肿瘤细胞凋亡指数是15.31% 和 6.83%(P<0.005).结论抗VEGF抗体能通过抑制肿瘤微血管的生长,抑制实验性人肝癌的生长,其实质是增加了肿瘤细胞凋亡.     

内皮细胞抑制素-血管内皮细胞生长抑制因子151融合基因对胃癌抑制作用的比较评价

通过基因工程方法对血管生成抑制基因加以改造。制造活性更强、功能更全的治疗基因是抗血管生成基因治疗的全新尝试。有研究显示内皮细胞抑制素．血管内皮细胞生长抑制因子151（ENDOVGE151）融合基因是一条新型强效的治疗基因，本研究旨在明确其是否具有比单基因或联合基因更强的抑瘤活性，现将结果报道如下。     

重组人血管内皮抑制素窗口期联合化疗治疗晚期结直肠癌的临床疗效分析

目的：探究采取重组人血管内皮抑制素窗口期联合化疗治疗晚期结直肠癌的作用和临床效果。方法：将本院70例晚期结直肠癌患者随机分为观察组和对照组,每组各35例。观察组患者采取重组人血管内皮抑制素窗口期联合化疗治疗,对照组采取常规化疗。比较2组疗效,毒副反应及生活质量等情况。结果：观察组客观治疗有效率和疾病控制率均高于对照组（P <0.05）;2组患者毒副反应严重程度均在Ⅰ级～Ⅱ级,差异无统计学意义（P>0.05）;观察组治疗后生活质量评分低于对照组（P <0.05）,机体功能状态评分高于对照组（P <0.05）。结论：重组人血管内皮抑制素窗口期联合化疗治疗晚期结直肠癌有助于快速稳定病情,降低对其他器官组织的损伤,患者机体耐受性较好,可以在治疗中发挥出巨大作用,临床应用价值较高。     

同时携带人血管内皮生长因子和血管生成素基因的内皮祖细胞血管再生研究

目的用腺相关病毒（adeno-associated virus,AAV）载体将人血管内皮生长因子165 （vascular endothelial growth factors,VEGF165）和血管生成素-1（angiopoietin-1,Angl）基因同时转入骨髓源性内皮祖细胞（endothelial progenitor cells,EPCs）中,观察外源基因的表达并评价其促血管再生的能力。方法用同时携带人VEGF165和Angl基因的AAV载体AAV2-hAngl/VEGF165转染体外培养的兔骨髓源EPCs,用RT-PCR和细胞免疫化学法检测外源基因的表达。实验用新西兰大白兔24只,制作成右下肢缺血模型,随机分成3组：PBS、EPC和EPC/AV组。造模后第10天,向缺血肌组织中分别注射PBS、EPCs和AAV2-hAngl/VEGF165转染的EPCs,用免疫组织化学法评价其血管再生效应。结果EPCs可高效地被AAV2-hAngl/VEGF165转染而表达Angl和VEGF165。细胞移植4周后,EPC/AV组存活的EPCs密度（283±137）/mm^-2明显高于EPC组（191±88）/mm^-2;EPC/AV组的毛细血管密度（856±212）/mm^-2明显高于EPC组（564±177/mm^-2）和PBS组（308±112）/mm^-2;α-SMA阳性血管密度（6.9±3.0）/mm^-2明显高于PBS组（3.6±1.8）/mm^-2,P〈0.05。结论AAV载体可同时将人VEGF165和Angl基因转入EPCs中,转染后的EPCs具有更强的促血管再生能力。     

双靶向溶瘤腺病毒携带内皮抑素基因对肝癌的抑制作用

目的 构建双调控溶瘤腺病毒,携带小鼠内皮抑素基因(mE),研究其对裸鼠肝癌移植瘤的抗瘤活性.方法 以人端粒酶逆转录酶启动子(hTERT)和缺氧调控元件序列(HRE)调控腺病毒E1a和E1b基因,基因组插入mE基因,构建双调控溶瘤腺病毒CNHK500-mE;在裸鼠模型中观察CNHK500-mE对肝癌移植瘤模型的疗效.结果 CNHK500能够在hTERT阳性的肝癌细胞中增殖[24 h:(16.67±4.04)％;48 h:(65.33 ±7.02)％;P＜0.01],并介导mE高效表达;与空白对照组( 1895.80±323.37) mm3比较,CNHK500-mE和Ad-mE的抑瘤率分别为50.95％[(929.80±211.10) mm3,P＜0.01]和29.99％[(1327.23 ±319.36) mm3,p＜0.05];CNHK500-mE对癌组织间质血管的抑制作用明显强于Ad -mE(P ＜0.05).结论 将mE与溶瘤腺病毒结合,发挥病毒增殖的溶瘤作用和基因产物的血管抑制作用,表现出明显的协同抗瘤作用.     

原发性肝癌基因治疗目的基因筛选的初步研究

目的 通过动物实验初步筛选对肝癌有明确疗效的目的基因。方法 应用携带对肿瘤有明确疗效的目的基因白细胞介素－２（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－２,ＩＬ－２）,白细胞介素－１２（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１２,ＩＬ－１２）,共刺激因子Ｂ７－１（ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ,Ｂ７－１,Ｂ７－１）,单纯疱疹病毒胸苷激素（ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ－１ ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ,ＨＳＶ－ＴＫ）,抑癌基因Ｐ５３     

人内皮抑素基因转染对Hep3B肝癌细胞裸鼠移植瘤的抑制作用

目的研究腺相关病毒转染人内皮抑素基因对肝癌细胞体内致瘤作用的影响。方法用含人内皮抑素基因的重组腺相关病毒(rAAV2/ES)体外转染人肝癌细胞Hep3B,以空病毒(AAV2)转染作阴性对照,RT-PCR方法检测ES在mRNA水平的表达。将转染细胞接种裸鼠,通过ELISA方法检测裸鼠血液中人内皮抑素的的浓度。观察内皮抑素对移植瘤的生长抑制作用。结果RT-PCR结果显示腺相关病毒可介导内皮抑素基因高效转染Hep3B细胞;rAAV2/ES转染细胞接种裸鼠后内皮抑素的表达随时间逐渐升高,在第4周达到最高浓度(115·79±8·70)ng/ml;rAAV2/ES转染组8只裸鼠中6只成瘤,成瘤时间为(26·80±6·42)d,明显长于对照组(17·17±4·17)d(P<0·05);对裸鼠移植瘤检测显示瘤体重量和瘤内微血管密度(MVD)分别为(0·36±0·22)g、(3·50±1·05)个/视野,明显低于对照组(1·54±0·48)g、(12·67±1·97)个/视野(P<0·01)。结论腺相关病毒介导人内皮抑素基因转染可有效抑制Hep3B细胞在裸鼠体内的生长。     

MAGE-A3基因过量表达对人肝癌细胞株SMMC7721的作用

目的 观察MAGE-A3基因过量表达对人肝癌细胞株增殖及侵袭能力的影响.方法 采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)从肝癌组织中制备出含NheI和KpnI酶切位点的MAGE-A3目的 基因,克隆到pcDNA3.1(-)真核表达载体,并通过酶切鉴定、测序验证.经脂质体法正义瞬时转染肝癌细胞株SMMC7721,通过RT-PCR、Western blot分别检测MAGE-A3 mRNA和蛋白表达产量.以噻唑蓝(MTT)比色法、Boy-den小室实验观察MAGE-A3基因过量表达对人肝癌细胞增殖及侵袭的影响.结果成功扩增出目的 基因;得到重组质粒pcDNA3.1-MAGE-A3,经过酶切鉴定与测序,结果正确;RT-PCR和Western blot检测显示,MAGE-A3基因mRNA及蛋白产物的表达水平明显高于未转染组和空载体组(3组MAGE-A3 mRNA量分别为7838、2847、1557,蛋白量分别为30938、24 088、29 654);转染组细胞数量增多,穿透Matrigel膜的细胞数显著增加,与未转染组和空载体组比较差异有统计学意义(P<0.05).结论 成功构建pcDNA3.1-MAGE-A3真核表达载体,转染人肝癌细胞株SMMC7721后可促进细胞增殖和侵袭能力,提示MAGE-A3基因在肝癌复发和转移中起到重要作用.     

腺病毒驱动KDR启动子介导CD/TK融合基因系统对肝癌细胞的靶向杀伤作用

目的 研究腺病毒介导的KDR启动子驱动CD/TK双自杀基因系统（AdKDR- CDglyTK）对肝癌细胞选择性杀伤作用。方法 将质粒pAdEasy-KDR-CDglyTK在293细胞内包装、扩增后，体外感染表达KDR的BEL-7402细胞株和对照组不表达KDR的LS174T细胞株，并给予不同浓度的前药5-FC和/或GCV，观察该体系对不同细胞株的杀伤效应及其旁观者效应。结果 所得病毒滴度为2.5×10^12pfu/ml。两种细胞的感染率相似，其感染率随腺病毒滴度的递增而增加。RT-PCR方法 检测发现：感染AdKDR-CDglyTK的BEL-7402有目的 基因CDglyTK的表达，感染AdKDR- CDglyTK的LS174T细胞无目的 基因表达。表达KDR的BEL-7402细胞对前药具有较高的敏感性，不表达KDR的LS174T细胞对前药不敏感（F=750.03，P〈0.001）。融合基因的疗效优于任一单自杀基因（F=275.89，P〈0.05）。将感染腺病毒的细胞与未感染细胞以不同比例混合培养，观察到该体系明显的旁观者效应。结论 KDR基因启动子可调控双自杀基因系统选择性杀伤表达KDR的肝癌细胞。     

原发性肝细胞癌组织中kruppel样因子6基因mRNA突变的测定

目的　探讨kruppel样因子 (KLF) 6基因与原发性肝细胞肝癌发生、发展的关系。方法分别用逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)技术和聚合酶链单链构象多态分析 (PCR SSCP)技术、DNA序列测定方法 ,检测 2 7例肝细胞癌患者的癌组织与癌旁组织、5例肝转移癌患者的正常肝组织中KLF6基因mRNA的表达及突变情况。结果　正常肝组织及癌旁组织中 ,只有 1例KLF6mRNA无表达 ,阳性率 97% (31/ 32 ) ;肝细胞癌组织中 ,有 4例无表达 ,阳性率 85 % (2 3/ 2 7) ,两者表达率间差异无显著性(χ2 =2 5 8,P >0 0 5 )。 2 7例肝细胞癌组织中 ,6例出现DNA片段异常泳动带 ,突变率为 2 2 % (6 / 2 7) ;14例出现信息个体 ,其中 5例 (5 / 14 ,36 % )为杂合子缺失 ,这 5例中有 3例出现DNA片段异常泳动带 ,突变比例为 3/ 5。在 2 7例癌旁组织中 1例检测出突变 ,但在检测出突变的肝癌组织的配对癌旁组织中无一例检测出突变。结论　肝细胞肿瘤存在KLF6基因突变 ,突变的起源是体细胞性的     

重组腺相关病毒介导的MDA-7基因对人肝癌细胞的选择性凋亡诱导效应

目的 探讨PEG启动子调控腺相关病人毒介导的黑色素瘤分化相关基因MDA-7对肝癌细胞的选择性凋亡诱导效应.方法 以重组腺相关病人毒rAAV-PEG-MDA-7表达系统感染人肝癌细胞株HepG2细胞和正常人肝细胞株LO2细胞,Westerm Blot检测转染细胞内MDA-7蛋白,MTT法检测细胞增殖抑制率,流式细胞术分析细胞周期、Annexin-Ⅴ、线粒体跨膜电位(△Ψm),RT-PCR检测bcl-2基因mRNA.结果 重组腺相关病毒rAAV-PEG-MDA7可特异性转染HepG2细胞,MDA7蛋白在HepG2细胞中高效表达,并呈时间依赖性;重组腺相关病毒rAAV-PEC-MDA-7可抑制HepG2细胞增殖并诱导其凋亡,细胞周期分析处于G0/G1期细胞百分比明显增多,处于G2/M期的细胞减少,并且可见到较明显的凋亡峰的形成,从24 h开始Annexin-Ⅴ阳性细胞比例增多,△Ψm降低,抗凋亡基因bcl-2 mRNA表达降低.而重组腺相关病毒rAAV-PEG-MDA-7对LO2细胞无类似效应.结论 构建出的重组腺相关病毒rAAV-PEG-MDA-7表达系统可选择性抑制肝癌细胞增殖和诱导其凋亡,其诱导凋亡机制受到bcl-2家族经线粒体途径的调节.     

携带可调控人前脑啡肽原基因逆转录病毒载体的构建及鉴定

目的构建四环素调控的含人前脑啡肽原基因(hPPE)逆转录病毒载体。方法用PCR方法扩增目的基因hPPE,定向克隆入逆转录病毒四环素反应质粒(pRevTRE)中,酶切反应、PCR 及DNA测序鉴定重组逆转录病毒载体pRevTRE/hPPE;在脂质体介导下分别将pRevTRE/hPPE和逆转录病毒四环素调节质粒(pRevTet-on)转入包装细胞PT67,经相应的抗生素稳定筛选得到抗性细胞克隆。RT-PCR鉴定得到阳性产病毒细胞系PT67/Tet-on和PT67/TREhPPE。用NIH3T3细胞测定病毒滴度。结果经限制性酶切分析、RT-PCR及DNA序列分析证实pRevTRE/hPPE中含有hPPE基因。转染有pRevTet-on的FT67细胞病毒滴度为2.6×105 CFU/ml,转染有pRevTRE/hPPE的PT67细胞病毒滴度为3.2×105 CFU/ml。结论成功构建了含有受四环素调控hPPE基因的逆转录病毒载体,建立了能产较高滴度逆转录病毒的包装细胞系,为可调控细胞移植镇痛的研究奠定了实验基础。     

体内基因转移建立多药耐药性人膀胱癌裸鼠荷瘤模型

目的 建立人膀胱癌多药耐药性裸鼠荷瘤模型。方法 应用逆转录病毒上清液裸鼠皮下移植瘤内及瘤周注射法转移ｍｄｒ１基因,腹腔注射化疗药物观察肿瘤模型的耐药性,免疫组化检测肿瘤细胞Ｐ－糖蛋白（Ｐ－ＧＰ）的表达,ＲＴ－ＰＣＲ检测肿瘤内ｍｄｒ１ ｍＲＮＡ的表达量。结果 携带ｍｄｒ１基因的逆转录病毒上清液注射后肿瘤模型产生多药耐药性,经过滤和离心浓缩的病毒上清液６０％细胞表达Ｐ－ＧＰ,是病毒原液基因转移率的２倍