非小细胞肺癌患者DNA修复基因XPD多态性与p53基因突变的相关性研究

[目的]研究非小细胞肺癌(NSCLC)患者DNA修复基因XPD多态性与p53基因突变的相关性。[方法]以PCR-RFLP方法分析60例NSCLC患者外周血XPD基因Lys751Gln多态;运用PCR-SCCP银染结合DNA序列分析法检测癌组织p53基因第5、6、7和8外显子突变情况。[结果]19例患者至少携带1个XPD751Gln等位基因;25例发生p53基因突变,突变率为42%;携带至少1个XPD751Gln等位基因的患者中p53基因突变率为52.6%,XPD751野生基因型中突变率为36.6%(P=0.27)。所有p53基因突变患者DNA序列分析结果显示,颠换27个,转换12个;突变类型分析显示,携带至少1个XPD751Gln等位基因的患者颠换发生明显占优势,颠换∶转换为14∶2,XPD751野生基因型颠换∶转换为13∶10(P=0.08)。[结论]NSCLC患者中DNA修复基因XPD多态性与p53基因突变发生无明显相关性。     

65. 9-氨基吖啶和乙基亚硝基脲诱导含LacZ靶基因重包装噬菌体突变机制的研究

为了提高λ噬菌体体外重包装致突变检测系统的特异性和利用该系统用于致突变分子机制的研究,我们引入了LacZ基因作为靶基因和报告基因。乙基亚硝基脲（1-ethyl-1-nitrosourea,ENU）和9-氨基吖啶（9-aminoacriaine,9-AA）直接处理含LacZ基因的λgtll DNA,在体外重新包装为噬菌体,然后转染宿主菌Y1090并在含X-Gal和IPTG的选择培养基上培养。通过计数清亮斑突变体和兰斑野生型的数目计算噬菌体的存活率和突变率;扩增和测定突变噬菌体中LacZ基因的序列,分析了两种化合物的分子致突变机制。结果表明：在ENU和9-AA作用下,噬菌体存活率明显下降,而突变率则相应上升,并呈较好剂量-反应关系;9-AA主要诱发移码突变（71.8％）,A,G,C,T 4种碱基发生移码突变率分别为27.3%,24.2%,24.2％和24.2%;9-AA诱发的单个碱基缺失主要发生在相同的碱基的重复区内（68.6％）,在单个或2个重复碱基位点发生缺失频率较底。9-AA诱发碱基置换主要是碱基巅换（92％）,G：C碱基对比A：T碱基对易于诱发碱基置换（76.7% vs 24.3%);9-AA诱发碱基置换后一般易于同邻近碱基形成相同碱基的重复。ENU诱发的突变主要发生在G：C碱基对上;ENU诱发碱基置换主要是G：C→A：T、G: C→C: G和A: T→T: A巅换。该实验表明含有LacZ靶基因的λgtll DNA致突变检测系统比λDNA致突变检测系统更完善。该系统以噬菌斑的存活率、突变率和分子突变谱作为检测终点,不仅提高了检测系统的特异性和敏感度,而且能进一步研究化合物的致突变分子机制和进行危险度的评价。     

9—氨基吖啶和乙基亚硝基脲诱导含LacZ靶基因重包装噬菌体突变机制的研究

为了提高λ噬菌体体外重包装致突变检测系统的特异性和利用该系统用于致突变分子机制的研究,我们引入了LacZ基因作为靶基因和报告基因。乙基亚硝基脲（l-ethyl-1-nitrosourea,ENU)和9－氨基吖啶（9－aminoacriaine,9-AA)直接处理含LacZ基因的λgell DNA,在体外重新包装为噬菌体,然后转染宿主菌Y1090并在含X－Gal和IPTG的选择培养基上培养。通过计数清亮斑突变体和兰斑野生型的数目计算噬菌体的存活率和突变率;扩增和测定突变噬菌体中LacZ基因的序列,分析了两种化合物的分子致突变机制。结果表明：在ENU和9－AA作用下,噬菌体存活率明显下降,而突变率则相应上升,并呈较好剂量－反应关系;9－AA主要诱发移码突变（71.85),A,G,C,T4种碱基发生移码突变率分别为27.3%,24.2%,24.2%和24.4%;9－AA诱发的单个碱基缺失主要发生在相同的碱基的重复区内（68.6%),在单个或2个重复碱基位点发生缺失频率较底。9－AA诱发碱基置换主要是碱基巅换（92％）,G：C碱基对比A：T碱基对易于诱发碱基置换（76.7%vs24.3%);9－AA诱发碱基置换后一铁于同邻近碱基形成相同碱基的重复。ENU诱发的突变主要发生在G：C碱基对上,ENU诱发碱基置换主要是G：C→A：T、G：C→C：G和A：T→T：A巅换。该实验表明含有LacZ靶基因的λgtll DNA致突变检测系统比λDNA致突变检测系统更完善。该系统以噬菌斑的存活率、突变率和分子突变谱作为检测终点,不仅提高了检测系统的特异性和敏感度,而且能进一步研究化合物的致突变分子机制和进行危险度的评价。     

CNE、SPC—A1和MCF—7人类肿瘤细胞Ku80基因同源性研究

目的：研究人鼻咽鳞癌(CNE)、肺腺癌(SPC—A1)和乳腺腺癌(MCF—7)细胞Ku80基因功能区的保守性，探讨该基因突变与肿瘤放射和化学治疗疗效的关系。方法：采用聚合酶链式反应和克隆技术测定3种肿瘤细胞内与DNA损伤修复有关的Ku80基因序列，分析他们的功能区保守性变化，模拟和比较突变产物亲疏水性差异。结果：人CNE、SPC—A1和MCF—7肿瘤细胞Ku80基因同源性分别为99．95％、99．5％和99．7％，包括碱基转换和颠换突变。部分突变碱基导致产物氨基酸替代并影响他们的亲疏水结构。SPC-A1细胞发生150aa Ile→Vao、470aa Asp→Gly、553aa Phe→Ile替代和570aaGln→0缺失；MCF-7细胞发生209aa Lys→Glu、 23laa Leu→Arg和297aa→Ser替代；而CNE细胞功能区高度保守。结论：SPC-A1和MCF-7细胞Ku80p功能区存在氨基酸替代，影响其结构和活性变化，与肿瘤细胞DNA双链断裂损伤修复能力和肿瘤放化疗疗效直接相关。     

肝硬化及肝癌p53基因突变的实验研究

目的 :研究肝硬化及肝癌p53基因的突变情况。方法 :选择 80例肝硬化、肝癌标本 ,分别以PCR SSCP法 ,双链DNA序列测定法研究其p53基因外显子的突变情况及突变位点。结果 :62例肝癌标本p53总突变率为 19 4 % ,其中 ,早、中、晚期突变率分别为 10 5%、15 0 %、35 0 % ;18例肝硬化标本p53总突变率为 5 6% ;第 7外显子的突变发生在 2 4 9位密码子第 3号碱基上 ,为G :C→T :A的颠换突变 ;第 8外显子的突变发生在 2 73位密码子第 1号碱基上 ,为C :G→T :A的转换突变。结论 :p53基因突变发生在肝细胞发生形态学改变之初 ,随着肝癌的进展逐渐积累 ,突变率呈上升趋势 ,故p53基因突变很可能是启动癌变过程的重要因素之一。     

韧带样型纤维瘤病Wnt通路中APC/β-catenin基因异常

背景与目的：APC和β—catenin基因作为Wnt通路上重要的成员．其异常在肿瘤的发生、发展过程中起着重要作用。本研究分析了韧带样型纤维瘤病中APC和β-eatenin基因突变．探讨Wnt通路中Ape／β-atenin基因异常在肿瘤发生中的作用。方法：采用PCR—DHPLC—Sequence的方法分析韧带样型纤维瘤病中APC和β-catenin基因的突变．免疫组织化学EnVision^＋两步法检测β-catenin、cyelinDl和cmyc蛋白的表达。结果：APC基因发生碱基置换突变，均为体系突变．突变率为26．1%（18／69），突变不产生截短APC蛋白。β-catenin基因发生碱基转换．突变率为18．8％（13／69），导致第3外显子的eodon41处苏氨酸磷酸化位点转变为丙氨酸。β-atenin蛋白异常表达阳性率为47．8％（33／69）．在APC、β-eatenin基因突变阳性和阴性病例间．其异常表达阳性率没有显著差异。β-catenin异常表达阳性病例的c-myc蛋白阳性率（69．7％，23／33）显著高于阴性病例的c-myc阳性率（22．2％．8／36）．两者之间有正相关关系（Pearson＇s r=0．477）．而cyelinD1的表达没有显示出这种相关性和差异。结论：韧带样型纤维瘤病中APC、β-catenin基因存在体系突变．β-eatenin蛋白存在异常表达。可能引起c-myc表达增加。韧带样型纤维瘤病中Wnt通路存在异常．可能在肿瘤发生中起重要作用。     

细胞色素P450 3A4基因多态性及与肝癌易感性研究

目的 探讨细胞色素P450 3A4(CYP3A4)基因的多态性与肝癌的关系。方法 应用聚合酶链反应（PCR）、变性梯度凝胶电泳（DGGE）、单链构象多态（SSCP）和DNA测序技术，对84例肝癌患者和144例健康对照的CYP3A4基因的多态性进行了研究。结果 通过对CYP3A4基因10个外显子的检测，发现2例肝癌患者的第7外显子第15742位核苷酸发生了A→G转换，使得第183位氨基酸残基由天冬酰胺转变为丝氨酸；发现第10内含子存在一单核苷酸多态，表现第20338位核苷酸发生了G→A转换。病例组G／G、G／A和A／A基因型频率分别为59.52％,36.90%和3.58%；对照组则为59.72%，33.33%和6.95％。两组比较没有统计学差异。结论 CYP3A4基因可能高度保守，虽有突变，但属罕见。     

人突变p27基因对大肠癌细胞SW480生长的影响

目的：观察人突变p27基因（p27mt）对人大肠癌细胞生长的影响，探讨p27mt基因在大肠癌基因治疗中的作用机制。方法：以携带突变p27基因复制缺陷型腺病毒（Ad—p27mt）为载体，转染大肠癌细胞SW480；用Western blot方法检测p27mt蛋白的表达；细胞计数法检测p27mt对SW480细胞生长的抑制作用；用流式细胞仪检测细胞周期：用DNA片段分析法检测细胞凋亡。结果：通过免疫印迹分析Ad—p27mt转染SW480细胞后，p27在细胞中出现了蛋白高表达。PI染色流式细胞仪检测77．96％的细胞阻滞于G0/G1期，而Ad—LacZ组及空白对照组分别为27．57％和25．29％；生长曲线显示Ad—p27mt对细胞生长就有明显的抑制作用；DNA片段分析示p27mt基因可诱导细胞的凋亡。结论：p27mt对细胞周期有明显的阻滞作用，主要阻滞于G0／G1期；p27mt基因对细胞的生长抑制机制与诱导细胞凋亡和细胞周期的阻滞有关。     

肝硬化及肝癌p53基因突变的实验研究

目的：研究肝硬化及肝癌p53基因的突变情况。方法：选择80例肝硬化、肝癌标本,分别以PCR－SSCP法,双链DNA序列测定法研究其p53基因外显子的突变情况及突变位点。结果：62例肝癌标本p53总突变率为19．4％,其中,早、中、晚期突变率分别为10．5％、15．0％、35．0％;18例肝硬化标本p53总突变率为5．6％;第7外显子的突变发生在249位密码子第3号碱基上,为G：C→T：A的转换突变。结论：p53基因突变发生在肝细胞发生形态学改变之初,随着肝癌的进展逐渐积累,突变率呈上升趋势,故p53基因突变很可能是启动癌变过程的重要因素之一。     

p53基因在人食管诱发癌中的突变

目的：了解抑癌基因p53在人食管癌及其癌旁组织中的突变和致癌作用。方法：采用PCR-SSCP和DNA序列分析等方法对24例人食管鳞状细胞癌术后标本和21例移植到重度完全性免疫缺陷(severe：comlbined immunocleficient，SCID)小鼠并用或不用N-戊基-N-甲基亚硝基胺(N-amyrl-N-methylnitrosamine，AMN)处理的人食管正常组织标本，进行了p53基因外显子4～8的突变研究分析。结果：在食管癌组织及癌旁组织均检测出p53基因突变，其中食管癌组织标本中有18个突变，癌旁组织标本中有10个(10／17，58．8％)突变，主要的突变为G-A转换。在14例用AMN处理的人食管正常组织标本中出现6个(42．9％)突变；其中密码子283的突变为G-A转换。在人食管癌及其癌旁组织中p53基因的突变概率差异无统计学意义。结论：环境因素或内源性AMN可能是河南林县食管癌高发的主要原因之一。     

宫颈癌组织中人乳头瘤病毒16E6基因突变分析

背景与目的：高危型人乳头瘤病毒（humanpa pillomavirus,HPV）以16型最为常见,HPV16E6是宫颈癌主要的致癌基因之一,特定的E6突变是宫颈癌发生的主要因素之一。本研究主要观察兰州地区宫颈癌组织中是否存在E6突变,并探讨了突变与宫颈癌发生的关系。方法：以23例宫颈癌手术切除标本及5例正常宫颈组织的DNA作为模板,PCR扩增HPV-16E6基因201-523位,PCR产物直接测序．分析其HPV16E6基因的突变规律。结果：PCR扩增结果表明5例正常宫颈组织中HPV16E6阳性率为0％（0／5）,宫颈癌组织中HPV16E6阳性率为82．61％（19／23）,对18例样本PCR产物的测序和序列分析结果表明,6例（33．33％）E6基因与原型相同,12例（66．67％）E6基因发生突变,其中11例（61．11％）发生了350G突变。同时,在1例样本（5．56％）发现了249G突变。结论：兰州地区宫颈癌组织中存在着非常高的HPV感染率,且多数HP116E6发生了突变。     

p53基因在鼻咽癌中的热点突变

采用ＤＮＡ测序和免疫组织化学技术对２３例鼻咽癌标本ｐ５３基因第７、８外显子的突变和该基因突变后的表达情况进行了检测，发现６５．２％（１５／２３例）的标本存在ｐ５３基因突变，且突变点均位于第２７３密码子第２个碱基，均为Ｇ：Ｃ→Ａ：Ｔ颠换，所编码的精氨酸为组氨酸所取代。免疫组化结果显示，除上述１５例突变标本外，另有１例存在ｐ５３过量表达。研究提示：鼻咽癌中ｐ５３基因突变率较高，该基因的突变和表达可能在鼻咽癌的发病中起着重要的作用；ｐ５３基因突变以第２７３密码子为突变热点，可能是由于患者接触了环境中目前尚未确知的某种特殊致癌物所致，或该点突变为鼻咽癌发病过程中的必要因素。     

肺癌发病机理的遗传学及分子学现象观察

对主要癌基因和肿瘤抑制基因的研究表明NSCLC与SCLC在遗传损伤方面有特征性区别,并可以此结合临床加以鉴别。所有肺癌中半数以上具有p53肿瘤抑制基因突变,但并不表明突变与存活之间有关联。约20％NSCLC病人的肿瘤及肿瘤细胞系中发生ras家族癌基因的突变,相反45例SCLC病人的肿瘤及肿瘤细胞系ras基因无一例突变。回顾调查存活的NSCLC病人,发现K-ras基因突变是决定患者预后的一个不利因素。吸烟肿瘤病人K-ras基因突变比非吸烟者更常见,而对接触放射性元素镭的职业性肺癌并未检测出K-ras突变。肺癌的p53和K-ras基因突变几乎都是G→T颠换,而其他癌症则是G→A颠换。从密切随访     

致癌物引起猴贤细胞的遗传不稳定

致癌物引起猴贤细胞的遗传不稳定张小山，余应年（浙江医科大学病理生理学教研室及医学分子生物学实验室杭州３１００３１）本实验室应用穿梭质粒ｐＺ１８９确认环境致突变物／致癌物可以在哺乳类细胞引起非定标性突变的发生，这提示致突变物／致癌物诱发的突变除了通过对...     

启东肝癌高发区乙肝病毒流行株全基因分析

目的：通过对江苏启东地区乙型肝炎病毒（HBV）全基因序列的分析，探讨该地区肝癌高发的分子病毒学病因。方法：以蛋白酶K消化后，酚／氯仿抽提7例肝炎和7例肝癌患者血清中DNA。应用聚合酶链反应（PCR），扩增血清中HBV基因全长，克隆至T载体后行全自动测序。以PHYLIP软件构建的系统进化树判断HBV的基因型；以Clastal W软件对序列进行突变分析。结果：14例标本中有12例为C基因型，2例为B基因型。肝癌和肝炎组中HBV基因型类别分布无差异。有5例HBV发生了PreS2的缺失突变，其中肝癌标本4例（57．1％），肝炎标本仅1例（14．3％）。HBV基因组中常见的点突变为PreS1区的nt．3116及核心启动子区的nt．1762／1764，发生率高达78．6％（11／14）。与肝炎组相比，肝癌中点突变发生率显著增高的位点为前C区nt．1899G→A的突变（P=0．01）及核心启动子区nt．1653C→T的突变（P=0．05）。结论：启东地区HBV以C基因型为主；启东HBV基因组中可能存在着与肝癌相关的点突变和缺失突变。     

哺乳类细胞参与MNNG诱导的非定标性突变发生基因的分离和功能研究

目的:遗传不稳定是存在于人类遗传性疾病及肿瘤中的一种重要现象,也可由环境致癌性理化因子诱发,但其发生的具体机制尚不清楚。本实验室已证实了烷化剂N - 甲基- N’- 硝基- N - 亚硝基胍(MNNG) 可以诱发出vero 细胞的遗传不稳定状态,表现为延迟发生的非损伤部位DNA 突变率增加(非定标突变) ,且突变谱明显不同于由MNNG直接攻击引起的定标性突变。转录抑制剂放线菌素D 可抑制这种突变的形成,提示它的发生依存于基因表达的改变。本研究目的是分离筛选参与以非定标性突变为特征的遗传不稳定发生的相关基因。方法:利用反义核酸技术,对本实验室用差异显示方法分离得到的EST 片段进行功能分析。首先改建了两个真核表达载体的抗性,利用抗性选择使之进入细胞后不会干乱利用穿梭质粒Z189 进行非定标性突变率检测的实验系统。利用此载体构建含反向插入片段的真核细胞表达重组体并转染细胞,以获得反义RNA 阻断其相应基因的表达,再检测非定标性突变率的变化。结果:筛选得到两个EST 片段(片段9 ,片段10) ,它们相关基因的表达被阻断后,非定标突变率均发生了显著的改变。9 号片段相关基因的表达阻断后,非定标性突变率显著增高,vero 细胞组、含空载体的vero2pM2amp2细胞组及含正反向插入片段的表达质粒的细胞vero2pM2amp29 ,自发突变率均较接近,分别为1. 6 ×10 - 4 ;4. 9 ×10 - 4 ;4. 7 ×10 - 4及4. 0 ×10 - 4 ,而MNNG处理后突变率均显著增高,分别为23. 6 ×10 - 4 ;36. 1 ×10 - 4 ;25. 0 ×10 - 4及67. 0 ×10 - 4 ,与自发突变率相比P < 0. 01 ,而其中vero2pM2amp29 - 细胞系在MNNG处理后pZ189 复制的突变率较其它各组的非定标性突变率进一步增高, P < 0. 05 ,在含反向插入片段的表达质粒的细胞vero2pM2amp210 - 中,10 号片段的相关基因表达阻断后,非定标性突变率下降至自发突变水平。vero 细胞组、含空载体的vero2pM2amp - 细胞组及vero2pM2amp210 - 细胞组,自发突变率较接近,分别为17. 2 ×10 - 4 ;4. 6 ×10 - 4及5. 2 ×10 - 4 ,在MNNG处理后,突变率分别为17. 2 ×10 - 4 ;16. 1 ×10 - 4及2. 5 ×10 - 4 ,vero2pM2amp - 10 细胞组的非定标突变率与其它组比较P < 0. 01。结论:反义核酸技术筛选到两个分离片段的相关基因与哺乳类细胞非定标性突变发生有关,其中9 号片段的相关基因可能参与维持细胞遗传稳定性,抑制非定标性突变的发生,而10 号片段的相关基因则可参与引起烷化剂处理后细胞非定标性突变的产生。     

DNA修复基因XPD 312 Asn和751Lys多态性与非吸烟女性肺癌的关系

目的 着色性干皮病互补基因D(xeroderma pigmentosum group D,XPD)是一种重要的DNA损伤修复基因,其常见的多态是位于751密码子的A→C颠换和312密码子G→A转换。本研究旨在探讨XPD基因751位点和312位点单核苷酸多态性与非吸烟女性肺癌易感性的关系。方法 采用病例-对照研究方法,纳入非吸烟女性肺癌患者222人和对照222人。以聚合酶链反应-限制性片段长度多态性方法分析XPD基因Lys751Gln和Asp312Asn多态基因型。结果 携带至少1个751Gln等位基因者和携带至少1个312Asn等位基因者患肺癌的风险均显著增高,调整OR分别为3.36(95%CI为2.29-4.90)和1.83(95%CI为1.16-2.91)。结论 XPD基因Lys751Gln和Asp312Asn多态是非吸烟女性肺癌的遗传易感因素。     

人黑色素瘤细胞系中MTS_1/p16CDK_4基因的突变

目的　探讨MTS1/p16CDK4基因在人肿瘤细胞中的突变及意义。　方法　采用PCRSSCP方法和基因序列测定技术对人黑色素瘤细胞系Bowes、Hela细胞和正常人肺细胞HFL中p16基因exon2进行检测和分析。　结果　Bowes细胞和Hela细胞中p16基因exon2扩增的单链DNA在聚丙烯酰胺凝胶中泳动加快,表明其DNA顺序存在单链构象改变。核酸序列测定证实第341号核苷酸发生T→C的颠换。　结论　p16基因的突变导致其编码蛋白质异常,引起细胞异常增殖。p16基因的突变是肿瘤发生和发展的重要原因。应用DNA重组技术构建的突变型p16基因重组质粒可作为基因探针用于检测p16基因的缺失     

p16／CDKN2对膀胱癌细胞生长的抑制

目的：细胞遗传学和分子遗传学的分析证明，已发现的肿瘤抑制基因象Ｒｂ基因和ｐ５３基因的缺失或突变与膀胱癌的发生有关。最近，一种新的肿瘤抑制基因ｐ１６／ＣＤＫＮ２已我隆定位于染色９ｐ２１。在一些肿瘤标本及其部分肿瘤垢培养细胞上，常检测到该基因的缺失。故研究该基因的改变与膀胱癌发生之间的关系，将有助于揭示膀胱癌的发生机制方法：我们以磷酸钙沉淀技术将野生型ｐ１６／ＣＤＫＮ２序列有突变或缺失的膀胱癌细胞系Ｒ     

NP9基因的克隆及对细胞周期素D1转录活性的影响

背景与目的：NP9基因是我们在鼻咽癌中克隆到的一个新的表达下调的基因(GenBank登录号：BF718797),为了进一步研究该基因的功能,我们构建了人NP9基因编码区序列的真核表达质粒,并研究其表达对细胞周期素D1(cyclinD D1)的影响。方法：通过核苷酸同源序列比较(BlastN)得到NP9 EST的同源cDNA,RT-PCR扩增其编码区序列并构建真核表达重组质粒pRe／CMV2-NP9,脂质体转染后G418筛选出稳定、高效转录NP9基因的细胞克隆;再通过脂质体转染cyclinD D1 promoter Luc和NF-kB—Luc质粒到稳定表达NP9基因的细胞克隆,测定荧光素酶的活性以确定NP9基因对cyclinD D1和NF-kB转录活性的影响;同时亚克隆：NP9基因编码序列到载体pEGFP—C1中,脂质体转染细胞以确定NP9蛋白在细胞中的定位。结果：融合的绿色荧光蛋白出现于细胞核。G418抗性克隆中,RT-PCR扩增证实部分克隆表达NP9基因,且强弱不同。表达NP9基因的细胞克隆在瞬间转染cyclinD D1 promoter Luc和NF-kB-Luc 48h后,荧光素酶的活性较其对照组分别下降46％和63％。结论：NP9蛋白在细胞核内表达;NP9基因通过抑制核转录因子NF-kB的转录活性下调cyclinD D1的表达。