DNA疫苗治疗小鼠耐多药结核病的研究

目的研究结核分枝杆菌DNA 疫苗治疗小鼠耐多药结核病的效果。方法用结核分枝杆菌耐利福平和异烟肼临床分离株HB361尾静脉注射60只雌性BALB/c小鼠后,将小鼠随机均匀地分为6组,感染后第3d开始,分别用生理盐水（A组）、pVAX1载体（B组）、利福平（C组）、HSP65 DNA疫苗（D组）、Ag85A DNA 疫苗（E组）、Ag85A/ESAT6嵌合DNA疫苗（F组）治疗60d,DNA疫苗每隔15d肌肉注射1次,共5次。治疗结束后3周,分别取肺和脾观察病理改变、称取重量、做菌落计数。结果治疗结束后3周,与对照组比较,D组、E组和F组肺脏病变有不同程度减轻,病变局限,2/3区域可见正常的肺泡结构,肺泡轮廓相对清晰,细胞分布均匀。与A组相比,D组、E组和F组肺脏菌落数分别减少了0.34、0.50 和0.26 logs;脾脏菌落数依次减少了0.37、0.46 和0.28 logs（P<0.05,P<0.01）。结论Ag85A DNA 疫苗治疗小鼠耐多药结核病效果优于HSP65 DNA和Ag85A/ESAT6嵌合DNA疫苗。     

Ag85A/B嵌合DNA疫苗治疗小鼠敏感结核病疗效的实验研究

目的研究结核分枝杆菌Ag85A/B嵌合DNA疫苗治疗小鼠敏感结核病的效果。方法用结核分枝杆菌标准株H37Rv尾静脉注射50只雌性BALB/c小鼠后,将小鼠随机均匀地分为5组,感染后第3 d开始,分别用生理盐水(A组)、pVAX1载体(B组)、利福平(C组)、草分枝杆菌F.U.36注射液(D组)、Ag85A/B嵌合DNA疫苗(E组)治疗,每2周肌肉注射1次DNA疫苗,共3次。在治疗结束后2周,杀鼠,取小鼠肺和脾观察病理改变、称取重量、做菌落计数。结果与A组比较,D组、E组肺脏病变有不同程度减轻,病变局限,3/5区域肺泡结构完整,清晰,细胞分布均匀。与A组相比,C、D、E组肺脏菌落数依次减少2.11 log、0.76 log、0.81 log;肝脏菌落数依次减少2.11 log、0.74 log、1.11 logs(P0.01)。结论 Ag85A/B嵌合DNA对小鼠敏感结核病具有较好的治疗效果。     

结核分枝杆菌Ag85A/ESAT-6嵌合型质粒DNA疫苗和抗结核药物联合治疗小鼠耐药结核病的效果研究

目的研究结核分枝杆菌Ag85A/ESAT-6嵌合型质粒DNA疫苗和抗结核药物联合治疗小鼠耐药结核病的效果。方法用结核分枝杆菌高耐利福平低耐异烟肼临床分离株HB240尾静脉注射BALB/c小鼠1个月后,将小鼠随机分成2组,第1组用利福平(RFP)、异烟肼(INH)治疗12周,第2组用RFP、INH和结核分枝杆菌Ag85A/ESAT-6嵌合型质粒DNA疫苗(免疫5次)联合治疗12周;治疗结束后4和8周,分别取肺、肝和脾观察病理改变、称取质量、作菌落计数。结果治疗结束后4和8周,第2组小鼠体质量均超过第1组,但无显著性差异(P>0.05)。治疗结束后4周,第2组肺、脾脏指数(0.017,0.011)均略低于第1组(0.020,0.012)(P>0.05);治疗结束后8周,第2组肺、肝脏指数(0.021,0.047)均略低于第1组(0.022,0.048)(P>0.05);而第2组脾脏指数(0.008)显著低于第1组(0.012)(P<0.05)。治疗结束后4周,第2组有4例脾脏未见明显病变,第1组仅1例脾脏未见明显病变;治疗结束后8周,第2组有1例肺门淋巴结肿大,而第1组有3例;第2组有5例脾脏未见明显病变,第1组仅2例脾脏未见明显病变。治疗结束后4周,第2组肺菌落计数和脾菌落计数比第1组显著减少,分别减少70%和80%。结论DNA疫苗和抗结核药物联合治疗小鼠耐药结核病疗效高于单纯化疗。     

结核分枝杆菌Ag85A／ESAT-6嵌合基因DNA疫苗与抗痨药物联合治疗小鼠结核病

目的 研究结核分枝杆菌Ag85A/ESAT-6嵌合基因DNA疫苗及其与抗痨药物联合治疗小鼠结核病的效果.方法 用结核分枝杆菌临床分离的利福平和异烟肼敏感株HB240-1尾静脉注射17～19g的6～8周龄雌性BALB/c小鼠后,将小鼠随机均匀地分为5组,感染后第3d开始,分别用pVAX1空载体(A组)、利福平和异烟肼(B组)、利福平、异烟肼和Ag85A/ESAT-6嵌合基因DNA疫苗(C组)、Ag85A/ESAT-6嵌合基因DNA疫苗(D组)、HSP65基因DNA疫苗(E组)治疗40d,每组10只小鼠.治疗结束后2w,分别取肺、肝和脾观察病理改变、称取重量、做菌落计数.结果 小鼠感染5w后,肺内菌量可达到1.8×106 CFU,脾内菌量达到1.7×106CFU.治疗结束后2w,B组和C组肺、脾脏器重量指数显著低于D组和E组,D组和E组脾脏器重量指数低于A组,但差别不显著.A组肺脏病变程度最重,病变范围80%～100%,干酪样坏死灶为弥漫性;D组和E组肺脏病变范围50%,干酪样坏死灶为片状;B组和C组肺脏病变程度较轻,病变范围较小,干酪样坏死灶为点状.A组脾脏9只重度肿大;B组和C组脾脏未见明显病变;D组和E组脾脏各有4只重度肿大.与A组相比,E组、D组、B组和C组肺脏菌落数分别减少了45%、50%、98.9%、99%;脾脏菌落数依次减少了50%、55%、99.2%、98.4%.与pVAX1空载体治疗组相比,各治疗组均有不同程度的疗效,Ag85A/ESAT-6嵌合基因疫苗组与HSP65基因疫苗组疗效相当.结论 Ag85A/ESAT-6嵌合基因DNA疫苗组联合化疗的疗效明显强于Ag85A/ESAT6嵌合基因DNA疫苗单独应用.     

结核分枝杆菌Ag85A／ESAT-6嵌合型质粒DNA疫苗和抗结核药物联合治疗小鼠耐药结核病的效果研究

目的研究结核分枝杆菌Ag85A／ESAT-6嵌合型质粒DNA疫苗和抗结核药物联合治疗小鼠耐药结核病的效果。方法用结核分枝杆菌高耐利福平低耐异烟肼临床分离株HB240尾静脉注射BALB／c小鼠1个月后，将小鼠随机分成2组，第1组用利福平（RFP）、异烟肼（INH）治疗12周，第2组用RFP、INH和结核分枝杆菌Ag85A／ESAT-6嵌合型质粒DNA疫苗（免疫5次）联合治疗12周；治疗结束后4和8周，分别取肺、肝和脾观察病理改变、称取质量、作菌落计数。结果治疗结束后4和8周，第2组小鼠体质量均超过第1组，但无显著性差异（P〉0．05）。治疗结束后4周，第2组肺、脾脏指数（0．017，0．011）均略低于第1组（0，020，0，012）（P〉0．05）；治疗结束后8周，第2组肺、肝脏指数（O．021，0．047）均略低于第1组（0．022，0．048）（P〉0．05）；而第2组脾脏指数（0．008）显著低于第1组（0．012）（P〈0．05）。治疗结束后4周，第2组有4例脾脏未见明显病变，第1组仅1例脾脏未见明显病变；治疗结束后8周，第2组有1例肺门淋巴结肿大，而第1组有3例；第2组有5例脾脏未见明显病变，第1组仅2例脾脏未见明显病变。治疗结束后4周，第2组肺菌落计数和脾菌落计数比第1组显著减少，分别减少70％和80％。结论DNA疫苗和抗结核药物联合治疗小鼠耐药结核病疗效高于单纯化疗。     

传统BCG初免IL-12联合Ag85A DNA疫苗加强序贯免疫小鼠效果观察

目的 探讨BCG初次免疫,IL-12联合结核分枝杆菌Ag85A DNA疫苗加强免疫对小鼠的免疫效果。方法 实验小鼠随机分为7组,即PBS阴性对照组、BCG组、pcAg85A组、BCG初免pcAg85A加强免疫组、BCG初免pcAg85A联合IL-12加强免疫组、BCG初免IL-12加强免疫组、以及BCG初免pcDNA3.1加强免疫组。按BCG初免,细胞因子IL-12联合结核分枝杆菌Ag85A DNA加强的免疫程序进行免疫实验,在末次免疫后的4、6、8周通过检测小鼠血清总IgG抗体、特异性淋巴细胞增殖,细胞因子的水平,观测对小鼠的免疫效果。结果 采用BCG初免,细胞因子IL-12联合结核分枝杆菌Ag85A DNA疫苗加强的免疫策略组的小鼠与其它免疫方式组相比,IgG明显升高(P<0.05)、特异性淋巴细胞明显增殖,加强免疫后IFN-γ水平、IL-2水平、IL-4水平BCG/ Ag85A+IL-12组在3个时间段分别为128.2±20.4、190.2±16.51、244.2±39.14;146.2±17.29、271.6±16.36、419.3±28.12;68.6±6.62、96.6±5.5、117.4±10.71均高于其它各组(P<0.05)。结论 采用BCG初免,细胞因子IL-12联合结核分枝杆菌Ag85A DNA疫苗加强的免疫能明显增强机体体液和细胞免疫,为进一步在动物体内进行保护性效应试验的研究提供了依据。     

ag85a-卡介苗重组疫苗的构建、免疫原性及抗结核作用的初步研究

目的构建结核分枝杆菌ag85a-卡介苗重组疫苗,研究其免疫原性及抗结核作用,以期获得结核病预防性或治疗性疫苗。方法通过基因工程重组技术将结核分枝杆菌保护性抗原Ag85A的编码基因与穿梭质粒载体pYUB295重组,采用电穿孔技术导入卡介苗中,应用PCR扩增、PAGE电泳鉴定重组卡介苗。通过ELISA法检测其免疫小鼠血清中特异性抗体,用MTS法分析其脾淋巴细胞增殖指数。通过观察ag85a-卡介苗重组疫苗对结核分枝杆菌感染实验动物半数死亡时间、一定时间内的死亡率、大体病变、T细胞及B细胞免疫功能等指标评价ag85a-卡介苗重组疫苗对结核分枝杆菌感染的预防效果。结果PCR扩增、限制性内切酶酶切、DNA测序鉴定、PAGE电泳表明成功地构建了ag85a基因pYUB295重组质粒,Ag85A蛋白在卡介苗中分泌表达。重组卡介苗免疫原性试验表明：ag85a-卡介苗重组疫苗免疫组小鼠有Ag85A特异性抗体产生,45天时达到最高水平。脾淋巴细胞增殖试验表明刺激指数均达2．0以上,ag85a-卡介苗重组疫苗免疫组小鼠脾淋巴细胞的刺激指数与对照组无明显区别。预防试验表明：ag85a-卡介苗重组疫苗组、卡介苗组与生理盐水对照组比都能延长结核分枝杆菌感染小鼠的半数死亡时间,降低2个月内的死亡率。结核分支杆菌攻击后2个月,处死小鼠时,小鼠脏器大体病变、脏器培养、抗体检测结果及淋巴细胞增殖实验表明：各组间无显著差别。结论正确构建了ag85a-卡介苗重组疫苗,ag85a-卡介苗重组疫苗与卡介苗对结核分枝杆菌感染的预防作用基本相同。     

结核分枝杆菌DNA疫苗对小鼠结核病免疫治疗作用的实验研究

目的探讨结核分枝杆菌DNA疫苗pcD85B、pcDMPT64以及小鼠白细胞介素12(IL-12)真核表达质粒psIL12对结核分枝杆菌感染的疗效与机制。方法将结核分枝杆菌H37Rv感染的C57BL/J6小鼠100只随机分成生理盐水对照组、pcDNA3.1对照组,psIL12治疗组,pcD85B、pcDMPT64、pcD85B+pcDMPT64、pcD85B+psIL12DNA疫苗治疗组。感染4周后分别给予生理盐水、空质粒、psIL-12及DNA疫苗,第1次治疗后2个月处死小鼠,检测器官荷菌量、脾淋巴细胞特异性γ干扰素(IFN-γ)、白细胞介素4(IL4)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的分泌水平,并于第1次治疗后2个月、5个月观察小鼠肺、脾组织病理改变情况。结果pcD85B治疗组肺组织荷菌量(lg-1CFU/g)为6.99±0.40,比生理盐水对照组(8.15±0.37)、pCDNA3.1对照组(8.19±0.29)显著降低(P<0.01);脾组织荷菌量(lg-1CFU/g,x±s)为5.17±0.33,比生理盐水对照组(5.76±0.16)及空质粒对照组(5.88±0.21)显著降低(P<0.05)。psIL12治疗组的肺(7.41±0.50)、脾(5.31±0.21)荷菌量比对照组显著降低(P<0.05);pcD85B+psIL12治疗组肺、脾荷菌量与pcD85B组比较差别无统计学意义。pcD85B组脾淋巴细胞IFN-γ、TNFα水平比对照组显著升高(P<0.05),各组间IL4水平差异无统计学意义。生理盐水对照组、pCDNA3.1对照组肺组织     

结核分枝杆菌Ag85A DNA疫苗抗结核作用的研究

结核病是由Mtb引起的一种呼吸道传染病,全球结核病疫情仍然十分严峻,而卡介苗预防结核病的效果并不理想,研究新型结核病疫苗已成为国内外结核病研究的热点之一。将本课题组自1998年至今研究Mtb Ag85A DNA疫苗的免疫原性、治疗效果进行综合与概述,结果表明Mtb Ag85A DNA疫苗可诱导小鼠体液免疫和Th1型细胞免疫应答,可减少小鼠组织中的Mtb尤其是耐多药Mtb的数目,该疫苗与常规化疗联合不仅可提高机体免疫力,并可有效地杀灭或抑制Mtb,从而提高化疗效果。     

MBL免疫治疗结核病小鼠的实验研究

目的 观察甘露聚糖结合凝集素(mannan-binding lectin,MBL)对结核分枝杆菌感染小鼠的免疫治疗作用.方法 将BALB/c小鼠18只随机分成MBL免疫治疗组、微卡治疗组和结核菌感染对照组,每组6只.小鼠感染结核分枝杆菌后第14、21、28 d各组腹腔内分别注射MBL、微卡和生理盐水.治疗结束后第3周处死小鼠,观测各组小鼠体质量以及肺、脾脏湿重,观察肺脏病理改变,取肺、脾组织进行结核菌培养和菌落计数.结果 治疗后第3周,治疗组小鼠体质量和脾脏质量高于对照组,肺脏质量低于对照组,且肺部病变较轻.MBL减轻结核病小鼠体质量下降,减少结核病小鼠肺和脾脏结核菌数量.结论 MBL对结核病小鼠具有一定的免疫治疗作用.     

Ag85B与MPT64 DNA疫苗联合免疫对鼠结核分枝杆菌感染的保护作用

目的　研究Ag85B与MPT6 4DNA疫苗联合免疫对鼠结核分枝杆菌感染的免疫保护效果。方法　C5 7BL/ 6小鼠 5 4只 ,采用随机数字表法随机分为 6组 ,分别用磷酸盐缓冲液 (PBS)、pcDNA3 1( )、卡介苗 (BCG)、pcDNA/Ag85B、pcDNA/MPT6 4、pcDNA/Ag85B pcDNA/MPT6 4经肌肉注射法免疫小鼠 ,0、3、6周各 1次 ,即PBS组、pcDNA3 1组、BCG组、pcDNA/Ag85B组、pcDNA/MPT6 4组及pcDNA/Ag85B pcDNA/MPT6 4组。BCG组只在 0周予皮内注射卡介苗 1次。末次免疫后第 5周用 1×10 6CFU的H3 7Rv经尾静脉实施攻击 ,攻击后 6周处死部分小鼠 ,用酶联免疫吸附测定 (ELISA)法检测血清总IgG、纯化蛋白衍生物 (PPD)特异性脾淋巴细胞干扰素γ(IFN γ)和白细胞介素 4 (IL 4 )分泌水平 ,四甲基偶氮唑盐 (MTT)法测定特异性脾淋巴细胞增殖 ;作脾、肺组织荷菌量和病理学检查 ,并观察小鼠存活时间。结果　PBS组肺和脾器官荷菌量分别为lg-1(7 85 4± 0 0 0 3)CFU/g和lg-1(7 190±0 0 16 )CFU/g、pcDNA3.1组分别为lg-1(7 70 0± 0 0 16 )CFU/g和lg-1(7 0 72± 0 0 6 8)CFU/g、BCG组分别为lg-1(6 4 4 9± 0 0 0 2 )CFU/g和lg-1(5 4 36± 0 0 4 2 )CFU/g、pcDNA/Ag85B组分别为lg-1(7 370± 0 0 0 2 )CFU/g和lg-1(6 4 2 96± 0 0 0 9)C     

结核分支杆菌Ag85 B分泌蛋白基因疫苗的构建和免疫原性的研究

目的：构建编码结核分支杆菌（MTB）Ag85B分泌蛋白的重组真核表达质粒,并研究其免疫原性。方法：采用聚合酶链反应（PCR）方法从结构分支杆菌H37Ra基因组DNA中扩增出Ag85B分泌蛋白基因,用HindⅢ和EcoRⅠ消化后,与同样酶消化的pcDNA3连接,转化大肠杆菌JM109,阳性克隆用酶切鉴定;重组表达质粒肌注免疫小鼠4周后,分别用dot blotting和ELISA方法检测抗体的产生和滴度,结果：酶切监定重组表达质粒pTB30s构建成功,dot blotting检测免疫小鼠血清抗Ag85B特异性抗体阳性,ELISA检测抗体几何平均滴度为1：120。结论：应进一步研究pTB30s刺激机体的细胞免疫应答,以用于结核病（TB）的防治研究。     

结核分支杆菌MPT64质粒DNA的免疫原性和保护效力

目的　研究结核分支杆菌 (Mycobacterium tuberculosis,MTB)MPT64质粒DNA的免疫原性和保护效力。方法 分别用生理盐水 (A)、载体质粒 (B)、卡介苗 (C)和MPT64重组质粒 (D)免疫小鼠,通过ELISA方法检测小鼠血清中抗MPT64抗体,免疫 8周后以MTB腹腔内攻击小鼠,攻击 4或 9周后,分别取肺、肝和脾脏观察病理改变、称取重量、作菌落计数及脾淋巴细胞转化试验。结果 D组1 0只小鼠中只有 4只血清中检测出抗MPT64抗体。MTB攻击 4周后,D组鼠脾淋巴细胞转化率显著高于其它 3组,A、B、D组肺、肝和脾重量明显高于C组,A组脾菌落数较其它 3组明显增多,其余脏器菌落数各组无明显区别,A、B组可见肺部严重病变,C组未见明显病变,D组存在个体差异。MTB攻击 9周后,A、B组鼠脾淋巴细胞转化率较C组显著降低,D组显著增高,各组肺、肝和脾重量无显著差别,C组肝菌落数明显低于其它 3组,其余脏器各组间无显著差别,各组鼠肺表面均可见不同程度的病变。所有鼠肝、脾均未见明显病变。结论 MTBMPT64DNA疫苗经肌肉注射免疫小鼠能诱发特异的体液和细胞免疫应答,对小鼠抗MTB感染具有一定的免疫保护效力,但比卡介苗差。     

结核杆菌Ag85A及ESAT-6双价抗原融合表达载体的构建及其在大肠杆菌中的高效表达

目的　为结核病新型疫苗研究提供靶基因和靶抗原。方法　采用PCR扩增的方法获得结核杆菌两种免疫保护性抗原Ag85A及ESAT - 6的基因 ,将其定向克隆入真核及原核穿梭表达型载体 pBK -CMV构建含嵌合目的基因的重组质粒 ,转化大肠杆菌后用IPTG进行诱导表达 ,并通过SDS -PAGE和Western -blotting对表达蛋白进行初步分析。结果　 1)从结核杆菌H37Rv株基因组DNA中扩增出Ag85A及ESAT - 6基因。 2 )成功构建了结核杆菌Ag85A及ESAT - 6双价抗原融合表达质粒 pBK - 85A -E6。 3)重组质粒 pBK - 85A -E6经IPTG诱导后能在大肠杆菌中稳定表达 38kDa的融合蛋白。 结论　成功构建了结核杆菌Ag85A及ESAT - 6双价抗原融合表达载体 ,并在大肠杆菌中实现了稳定表达 ,为进一步研究其在结核病基因工程疫苗研制中的应用奠定了基础。     

二甲基三十六烷基铵.卡介苗多糖核酸在结核亚单位疫苗中的佐剂效应

目的 探讨二甲基三十六烷基铵(DDA)、卡介苗多糖核酸(BCG-PSN)作为结核病融合蛋白疫苗佐剂的免疫效应.方法 采用热酚法制备BCG-PSN,与DDA联合作为融合蛋白AMM(Ag85B-MPT64190-198-Mth8/4)佐剂免疫小鼠,设卡介苗、生理盐水、弗氏不完全佐剂(IFA)及单独应用DDA或BCG-PSN一种佐剂的各组作为对照.应用ELISA和酶联免疫斑点法检测免疫小鼠的体液与细胞免疫反应.结果 分离培养疫苗免疫小鼠的脾脏淋巴细胞,用特异性抗原AgSSB刺激后,AMM+DDA+BCG-PSN疫苗组、AMM+DDA组和卡介苗组小鼠每1×106个脾淋巴细胞分泌γ-干扰素的细胞数分别为222±79、259±85和230±64,均明显高于AMM+PBS组(40±4)、AMM+IFA组(10 ±3)、AMM+BCG-PSN组(132±18)和生理盐水组(8±4),差异有统计学意义(t值为2.923～7.118,均P<0.05);与单用DDA组比较,添加DDA和BCG-PSN两种佐剂的疫苗组小鼠血清抗体滴度Ig2a/IgG1较高(0.125和0.025),但γ-干扰素分泌水平没有增高.结论 AMM+DDA+BCG-PSN结核病亚单位疫苗能够引起较强的Th1细胞免疫为主的免疫反应,DDA+BCG-PSN(尤其是DDA)具有增强结核病亚单位疫苗Th1细胞免疫应答的佐剂效应.