水通道蛋白－9表达载体的构建及视神经脊髓炎患者血清中抗体的检测

目的：构建一种能稳定表达人水通道蛋白－9（ AQP9）的真核细胞载体,并检测视神经脊髓炎（NMO）患者血清中的AQP9抗体。方法将人AQP9基因克隆入pcDNA3．1＋质粒中构建AQP9－pcDNA3．1＋载体,并转染HEK－293T细胞中。 AQP9蛋白的表达通过RT－PCR和Western blot法验证。通过间接免疫荧光法检测NMO患者血清中的AQP9抗体。结果 AQP9的mRNA相对表达量明显高于空载体,且蛋白表达量在32 kD条带附近明显高于空载和293T细胞。在4例NMO患者血清中均检测到AQP9抗体,1例脑梗死和1例健康人中抗体均为阴性。结论这种转染表达AQP9的细胞模式相对简捷,可用来检测NMO患者中的AQP9抗体,对NMO研究有一定意义。     

稳定表达人水通道蛋白4的胚肾细胞系HEK293/AQP4的建立及应用

[目的]建立一种可临床应用的并能稳定表达水通道蛋白4的胚肾细胞系HEK293/AQP4,用于检测视神经脊髓炎患者血清中的AQP4抗体.[方法]构建有AQP4基因的表达载体,利用脂质体将载体转入HEK293细胞,G418筛选,RT-PCR、间接免疫荧光检测稳定细胞系中水通道蛋白4的表达及分布.细胞间接免疫荧光检测20例NMO患者、20例MS患者、30例健康对照血清中的AQP4抗体,并同鼠脑间接免疫荧光检测法比较.[结果]限制性酶切消化、PCR、测序结果证明载体构建成功.间接免疫荧光证实稳定细胞系中有AQP4表达.且主要分布在细胞膜上.20例NMO患者血清中11例NMO-IgG阳性,18例AQP4抗体阳性,滴度在1:60-1:15 360之间,而MS患者仅检测到1例阳性,健康对照未检测到阳性.[结论]成功构建稳定表达水通道蛋白4的胚肾细胞系HEK293/AQP4,并检测出国人NMO患者血清中存在AQP4抗体,且敏感性高于鼠脑法,可以有效的鉴别视神经脊髓炎和多发性硬化.     

LOX-shRNA慢病毒表达载体的构建与鉴定

目的 构建LOX-shRNA的慢病毒表达载体及其病毒包装鉴定。方法 利用Oligo Designer 3.0,根据人LOX基因序列设计shRNA,并合成包含正、反义靶序列的互补DNA链,退火后插入LOX表达载体中,构建shRNA表达质粒,并转化至E.coli TOP10感受态细胞,抽提质粒后进行测序。将重组质粒转染HEK-293T细胞,应用RT-PCR检测各组LOX基因mRNA的表达水平,筛选出最有效的LOX-shRNA后,通过LipofectAMINETM2000介导转染293T细胞,对慢病毒进行包装并测定慢病毒滴度。结果 利用慢病毒介导将重组质粒LOX-shRNA-3024高效转导入HEK-293T细胞并稳定表达。荧光显微镜显示,转染24h后,HEK-293T细胞即开始发出绿色荧光;72h后,有大量荧光表达,而对照组未转染质粒的HEK-293T细胞不表达,可见慢病毒载体被成功转染。LOX-3024重组慢病毒的滴度为2×10¹⁰TU/ml。结论 成功构建LOX-shRNA慢病毒表达载体,并稳定转染HEK-293T细胞,为研究LOX对人阴道壁成纤维细胞生物学行为的影响提供了实验基础。     

稳定表达人水通道蛋白4的胚肾细胞系HEK293/AQP4的建立及应用

 【目的】 建立一种可临床应用的并能稳定表达水通道蛋白4的胚肾细胞系HEK293/AQP4,用于检测视神经脊髓炎患者血清中的AQP4抗体｡ 【方法】 构建有AQP4基因的表达载体,利用脂质体将载体转入HEK293细胞,G418筛选,RT-PCR､间接免疫荧光检测稳定细胞系中水通道蛋白4的表达及分布｡细胞间接免疫荧光检测20例NMO患者､20例MS患者､30例健康对照血清中的AQP4抗体,并同鼠脑间接免疫荧光检测法比较｡ 【结果】 限制性酶切消化､PCR､测序结果证明载体构建成功｡间接免疫荧光证实稳定细胞系中有AQP4表达,且主要分布在细胞膜上｡20 例NMO患者血清中11例NMO-IgG阳性,18例AQP4抗体阳性,滴度在1 ∶ 60 - 1 ∶ 15 360之间,而MS患者仅检测到1例阳性,健康对照未检测到阳性｡ 【结论】 成功构建稳定表达水通道蛋白4的胚肾细胞系HEK293/AQP4 ,并检测出国人NMO患者血清中存在AQP4抗体,且敏感性高于鼠脑法,可以有效的鉴别视神经脊髓炎和多发性硬化｡ 关键词: 视神经脊髓炎; NMO-IgG; 水通道蛋白4( AQP4); HEK293     

大鼠PEDF44mer慢病毒载体的构建及鉴定

目的 构建大鼠色素上皮衍生因子（PEDF）44mer基因的慢病毒表达载体并检测其表达.方法 化学合成PEDF 44mer-6his,亚克隆入GV206载体,测序鉴定.挑取阳性克隆转染293T细胞,实时荧光定量PCR法测定病毒滴度.将已构建的病毒转染293T细胞,RT-PCR和Western blot法检测44mer-6his表达.结果 阳性克隆测序与设计的44mer基因序列完全一致,44mer慢病毒构建成功.实时荧光定量 PCR法检测病毒滴度为2.00E＋9 TU/ml.44mer慢病毒转染293T细胞后,RT-PCR检测到44mer表达.Western blot显示44mer-6his融合蛋白表达阳性.结论 成功设计构建了PEDF 44mer慢病毒,为进一步研究44mer在缺血性心肌病中的作用和机制奠定基础.     

AQP4真核表达载体的构建和AQP4-M23蛋白在中国仓鼠肺细胞系V79中的表达

目的：构建水通道蛋白4（AQP4）真核表达载体pmCherry-N1-hAQP4-M23,检测AQP4-M23蛋白在中国仓鼠肺细胞系V79中的表达。方法：采用PCR方法扩增hAQP4-M23基因,经双酶切后与真核表达载体pmCherry-N1连接,构建pmCherry-N1-hAQP4-M23重组表达质粒。采用脂质体将其转染至V79细胞中,将细胞随机分为对照组（未转染重组质粒的V79细胞）和转染组（转染重组质粒的V79细胞）。利用RT-PCR法和荧光显微镜检测2组细胞中hAQP4-M23基因的表达;取视神经脊髓炎（NMO）患者血清中抗AQP4抗体,与2组细胞结合,采用免疫荧光和水通透性法检测2组细胞中hAQP4-M23的活性。结果：成功构建AQP4真核表达载体;荧光显微镜观察,转染组细胞膜清晰表达红色荧光;免疫荧光检测,转染组细胞膜呈现绿色荧光,表明转染组细胞膜AQP4-M23蛋白可与NMO患者血清成分结合;与对照组比较,转染组细胞中hAQP4-M23活性升高（P<0.05）。结论：成功构建表达AQP4基因的真核表达载体,并在V79细胞系中成功表达hAQP4-M23蛋白。     

人TRBP基因在HEK-293细胞中的表达

目的：构建携带人TRBP（TAR RNA结合蛋白）基因的真核表达载体,并将其在HEK-293细胞中表达.方法：用RT-PCR的方法扩增获得TRBP全长cDNA,然后克隆入pFLAG-CMV4真核表达载体.脂质体法瞬时转染HEK-293细胞,间接免疫荧光和Western Blot检测目的蛋白表达.结果：成功获得了全长的TRBP cDNA,构建了含人的TRBP cDNA的真核表达载体.转染HEK-293细胞后提取蛋白,经电泳观察到在Mr46000存在与目的蛋白分子质量相符的条带,该条带可被抗TRBP多克隆抗体及抗FLAGmAb特异性识别.结论：TRBP哺乳动物表达系统的建立,为进一步研究TRBP的生物学效应奠定了基础.     

人晶状体上皮细胞BHMT基因过表达慢病毒载体的构建及鉴定

目的:构建甜菜碱高半胱氨酸甲基转移酶(BHMT)基因过表达慢病毒载体,并检测其在人晶状体上皮细胞中的表达效果。方法:采用聚合酶链反应(PCR)扩增制备目的基因片段,构建BHMT慢病毒过表达载体,转染至293T细胞。运用免疫荧光法行病毒滴度检测,并利用荧光显微镜观察细胞中绿色荧光蛋白的表达,运用RT-PCR、Western blot检测鉴定BHMT mRNA蛋白的表达水平。将构建成功的慢病毒载体BHMT-GV358感染人晶状体上皮细胞,观察目的基因表达。结果:重组慢病毒转染293T细胞后可观察到荧光,在稳定转染的细胞中BHMT及蛋白的表达水平较未转染细胞显著增高(P<0.05),体外转染人晶状体上皮细胞,荧光显微镜下可见BHMT表达。结论:成功构建过表达BHMT的慢病毒载体,并有效感染人晶状体上皮细胞,为进一步研究BHMT在白内障发生发展中的作用提供生物学基础。     

胰腺癌新基因S100P与绿色荧光蛋白融合基因慢病毒载体的构建

目的:构建胰腺癌新基因SLOOP与绿色荧光蛋白(GFP)融合基因慢病毒载体.方法:实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)方法扩增获得SlOOP的全外显子片段.使之克隆到带GFP荧光报告基因慢病毒表达载体质粒中,慢病毒包装质粒和穿棱质粒共转染293T细胞,包装成功后收集上清,浓缩,鉴定.取浓缩纯化后的病毒上清感染293T细胞和宿主胰腺癌细胞.荧光显微镜观察293T细胞的荧光表达,RT-PCR鉴定胰腺癌细胞中SLOOP的表达水平.结果:电泳鉴定结果与目的基因表达条带完全吻合,克隆测序结果与NCBI收录的S LOOP基因序列完全一致.重组慢病毒质粒可高效转染293T细胞.荧光显微镜下可观察到大量绿色荧光.共转染后293T细胞上清可高效感染293T细胞,感染后宿主细胞中S LOOP高表达.结论:成功构建了S LOOP与GFP融合基因慢病毒表达载体,为进一步研究SLOOP基因的相关功能提供了适合的稳定转染载体.     

针对人β-catenin基因shRNA真核表达载体的构建与鉴定

目的:构建针对人β-catenin基因mRNA的shRNA真核表达载体,并转染HEK-293细胞,观察其对β-catenin的抑制效应。方法:化学合成用于产生针对β-catenin shRNA的对应DNA片段,将合成的寡核苷酸链退火形成双链,克隆入pSUPER真核表达载体,对重组质粒进行酶切分析和测序鉴定,筛选阳性克隆。通过脂质体介导,把重组质粒转染HEK-293细胞,RT-PCR、蛋白质印迹法检测其对β-catenin mRNA和蛋白的干涉效果,MTT比色法检测β-catenin基因表达抑制的细胞和对照组细胞的增殖。结果:RT-PCR和蛋白质印迹法检测结果显示转染组β-catenin基因的表达水平下调,MTT检测显示β-catenin表达抑制的细胞光密度值下降,细胞增殖受到了抑制（P<0.01）。结论:成功构建了针对人β-catenin基因的shRNA载体,转染HEK-293细胞后可抑制β-catenin基因的表达。     

Construction of Eukaryotic Expression Plasmid of Human PRX3 and Its Expression in HEK-293FT Cells

To construct the eukaryotic expression plasmid of human PRX3 and measure its expression in the HEK-293FT cells, the full-length coding region of human PRX3 was cloned by PCR and inserted into the eukaryotic expression vector pcDNA4-Xpress (A). HEK-293FT cells were transiently transfected with the recombinant plasmid. Western blot and immuofluorescence were used to detect the expression of the fusion protein. In the experiment, restriction analysis identified the construction of the recombinant plasmid and the inserted sequence was identical with that published on GenBank. Western blot and immunofluorescence confirmed the expression of the recombinant protein in transfected HEK-293FT cells. It was concluded that the eukaryotic expression plasmid of human PRX3 was constructed successfully and the recombinant could he expressed efficiently in HEK-293FT cells, which provides a sound basis for the further study on human PRX3.     

稳定表达人TLR5及NF-κB响应报告分子的HEK-293细胞系的建立

目的 构建人Toll样受体-5(hTLR5)和NF-κB信号通路响应的荧光素酶(luciferase)-绿色荧光蛋白(GFP)报告分子的慢病毒质粒,获得稳定表达hTLR5及NF-κB响应报告分子的HEK-293细胞系.方法 通过PCR及全基因合成方法获得hTLR5和5×NF-κB结合位点序列,分别构建pWSLV-hTLR5-puro和pWSLV-5×NF-κB-nanluc-GFP慢病毒质粒;将2个慢病毒质粒分别与包装质粒共转染HEK-293T细胞进行慢病毒包装,将获得的慢病毒上清经浓缩后共感染HEK-293细胞,经嘌呤霉素筛选和流式细胞分选后得到表达hTLR5及NF-κB响应报告分子的HEK-293细胞.经传代后,采用Western印迹法和免疫荧光法鉴定hTLR5表达情况,荧光显微镜下观察并采用荧光素酶定量法检测不同浓度细菌鞭毛蛋白(flagellin)对NF-κB信号通路的激活情况.结果 质粒酶切鉴定及DNA测序结果表明插入目的片段与预期相符,重组慢病毒质粒构建正确;HEK293-N-T细胞高表达hTRL5,且hTLR5能正确定位到细胞膜表面;鞭毛蛋白能显著激活HEK293-N-T细胞的NF-κB信号通路,且具有剂量依赖关系.结论 正确构建了hTLR5和NF-κB信号通路响应的荧光素酶-GFP报告分子的慢病毒质粒,并成功建立了稳定表达hTLR5及NF-κB响应报告分子的HEK-293细胞系.     

含hITF启动子的荧光素酶报告质粒的构建及活性检测

目的构建含有人肠三叶因子(intestinal trefoil factor,hITF)启动子的荧光素酶表达载体,并检测启动子活性。方法采用PCR技术从LS-174T细胞基因组DNA中扩增出长约2.5kb的含hITF基因启动子片段(-2331/+53),而后在此基础上构建了10个不同长度的启动子序列至pGL-3basic荧光素酶表达载体,然后将这些重组质粒转染HEK-293细胞并在48h后检测其荧光素酶活性。结果插入的hITF启动子片段测序结果显示正确,-500/+53,-400/+53和-300/+53片段活性介于0.023～0.026之间,-200/+53,-100/+53和-50/+53活性介于0.0032～0.0042之间,明确了最小活性功能域位于-300/+53区域,-300/-200区域对hITF转录起始起关键性作用。结论成功构建了含hITF启动子的萤火虫荧光素酶报告基因质粒,鉴定出人肠三叶因子(hITF)启动子活性位于-300/-200区域。     

表达AQP4不同亚型的细胞系检测AQP4抗体敏感性的研究

【目的】 研究表达不同亚型的AQP4细胞系检测中国人群视神经脊髓炎患者血清中AQP4抗体的敏感性? 【方法】 根据纳入标准共获取血清205例,其中包括视神经脊髓炎40例,长节段性脊髓炎39例,复发性视神经炎39例,多发性硬化47例,另设40例健康对照?使用稳定表达水通道蛋白4的四种细胞系HEK293/pcDNA3.1(+)-M23-AQP4?HEK293/pcDNA3.1(+)-M1-AQP4、HEK293/pEGFP-N3-M23-AQP4?HEK293/pEGFP-N3-M1-AQP4通过细胞间接免疫荧光法分别检测以上血清中的AQP4抗体?【结果】 NMO-IgG普遍存在于视神经脊髓炎疾病谱中?AQP4抗体同AQP4两种亚型结合敏感性比较发现,M23-AQP4的敏感性高于M1-AQP4?同时绿色荧光蛋白作为标签蛋白,可能干扰抗体同AQP4的结合?【结论】M23-AQP4作为靶抗原检测血清中AQP4抗体优于M1-AQP4, 临床中采用细胞间接免疫荧光法对抗体进行检测时应首选表达M23-AQP4亚型的细胞系进行检测?     

人PD-L1真核表达载体的构建及其在HEK293细胞系中的稳定转染

目的构建含有人PD-L1基因的真核表达载体,并通过稳定转染获得稳定表达PD-L1分子的HEK293细胞系。方法从人心脏cDNA文库中扩增出PD-L1基因,通过双酶切（Xho1和EcoR1）装入真核表达载体pIRES2-EGFP中,脂质体法转染HEK293细胞,通过G418筛选,建立稳定高表达PD-L1分子的HEK293细胞系,通过流式细胞术、RT-PCR及Westernblot分析PD-L1的表达。结果构建了真核表达载体pIRES2-EGFP/PD-L1,建立了稳定转染PD-L1目的基因的HEK293细胞系。结论成功构建了PD-L1真核表达载体并获得了稳定转染该分子的HEK293细胞系。     

人趋化因子受体CCR6的克隆、表达及其功能分析

目的构建人趋化因子受体6（CCR6）cDNA序列的真核表达载体．并在HEK293细胞中表达．为研究CCR6生物学功能和筛选CCR6拮抗剂奠定基础。方法采用RT-PCR方法从人扁桃体克隆CCR6受体的DNA片段．并将该片段插入真核表达质粒pcDNA3．1（＋）中,构建重组真核表达质粒pcDNA3、1（＋）-CCR6;将该质粒pcDNA3、1（＋）-CCR6转染HEK293细胞．用流式细胞术检测转染pcDNA3．1（＋）-CCR6质粒的HEK293细胞;采用体外趋化实验、钙流实验,验证转染pcDNA3.1（-）．CCR6质粒的HEK293细胞表面表达的CCR6的生物学活性。结果经RT-PCR获得了编码人CCR6受体的DNA片段．构建了重组真核表达质粒pcDNA3．1（＋）-CCR6：转染HEK293细胞．经流式细胞仪检测、趋化实验、钙流实验证实．表达CCR6的HEK293细胞具有趋化因子受体CCR6的生物学活性。结论重组人趋化因子受体CCR6克隆成功．并在HEK293细胞中获得了表达．为研究CCR6的生物学功能及筛选CCR6拮抗剂奠定了基础。     

人MCHR2真核表达载体的构建及稳定转染细胞系的建立

目的:构建人MCHR2真核表达载体,转染HEK293细胞,建立稳定转染细胞系. 方法:采用PCR方法,以人胎脑cDNA文库为模板扩增人MCHR2基因的全长cDNA编码区序列,DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pcDNA3.1( ),经酶切和PCR鉴定后,脂质体转染法转染HEK293细胞,通过G418选择培养,建立稳定转染细胞系,RT-PCR,Western Blot及免疫荧光法检测MCHR2的表达. 结果:成功构建了pcDNA3.1-MCHR2真核表达载体并已稳定转入HEK293细胞,建立了稳定转染细胞系,成功地表达目的基因. 结论:稳定转染细胞系的建立和基因表达为进一步研究MCHR2的功能提供了良好的实验基础.     

人DC-STAMP真核表达载体的构建及鉴定

目的构建和鉴定人DC-STAMP基因的真核表达载体,并分析在293T细胞中的表达情况。方法通过反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术从人破骨细胞体外扩增DC-STAMP的cDNA片段,连接入真核表达载体pEGFP-N1-FLAG后转入293T细胞中,Western blot进行表达鉴定。结果成功扩增出人DC-STAMP全长,构建了重组质粒pEGFP-DC-STAMP-FLAG,并在其转染的293T细胞检测到融合蛋白的表达。结论成功构建了DC-STAMP融合基因表达载体pEGFP-DC-STAMP-FLAG。