烟雾病免疫相关基因研究

目的通过分析烟雾(moyamoya)病患者外周血液淋巴细胞和正常人外周血液淋巴细胞免疫相关基因表达的差异，探讨烟雾病的发病机制。方法分别采集烟雾病患者和正常人血液标本各22份，提取烟雾病患者和正常人外周血液淋巴细胞的总RNA，将mRNA逆转录为cDNA，用Cy5和Cy3标记作为探针，与含有492个基因的自身免疫和炎症反应基因芯片进行杂交，以Scan Array 4000荧光扫描仪扫描芯片上两种荧光信号，用计算机进行处理和分析。结果烟雾病患者外周血液淋巴细胞和正常人血液淋巴细胞比较，差异表达2倍以上的基因共有32个，其中19个基因表达增加，13个基因表达降低。结论烟雾病发生与患者的免疫相关基因异常有关。     

全基因组芯片结合通路分析筛选心力衰竭患者心肌细胞差异基因

目的 利用人全基因组芯片分析心力衰竭(心衰)患者与正常人心肌细胞差异表达基因,结合已知基因功能分类着重对细胞信号通路进行分析.方法 应用华联公司人全基因组芯片,检测4例心衰患者及4例脑死亡的正常人心肌细胞的基因表达谱,并以实时荧光定量PCR技术对基因芯片检测结果 进行验证.将心衰差异表达量≥1.2倍或≤-1.2倍的基因经BioCarta通路和KEGG通路进行信号通路分析.结果 4例心衰心肌标本与正常对照比较,表达量变化1.2倍以上的基因有2806条;变化2倍以上的有399条基因.经BioCarta通路分析,心衰时涉及11条通路蛋白.经KEGG通路分析,涉及16条通路.结论 心衰时心肌细胞巾有大量的基因呈现差异表达,并激活了多条促进细胞凋亡通路及涉及转录调控的通路.运用基因芯片和生物学通路相结合的方法 ,分析基因表达谱能准确而且有的放矢地研究与心衰病理生理的相关基因.     

cDNA微阵列分析BALB/c小鼠肝脑组织中差异性表达基因的研究

目的分析BALB/c小鼠肝、脑组织差异基因表达谱。方法TRIZOL法提取总RNA,反转录cDNA,采用36K小鼠全基因组寡核苷酸芯片,运用荧光双交换方法分析BALB/c小鼠肝脑组织中mRNA转录本含量。经芯片扫描、图像采集后,运用MAS2.0软件对差异基因进行基因功能分析(GO)和KEGG通路分类。结果基因芯片结果表明与脑组织相比,在肝组织中共发现差异表达基因6 132个,其中包括上调基因2 974个,下调基因3 158个,GO分析上述差异表达基因主要涉及代谢、细胞信号转导、DNA结合与转录、细胞周期、细胞骨架、细胞粘附和发育等。KEGG信号通路分析显示:上调差异基因中71个通路的改变差异具有统计学意义(P0.05),下调差异基因中有80个通路的改变差异具有统计学意义(P0.05)。结论小鼠肝与脑组织基因表达谱的差异涉及多个基因表达调控途径,研究这些基因分子功能有助于深入了解各组织独特的功能表达系统。     

应用基因芯片技术筛选肝细胞癌相关基因

目的:探讨基因表达谱芯片技术在筛查肝细胞癌(HCC)相关基因群表达中的作用。方法:TRIzol法抽提2例HCC及正常肝脏组织总RNA,分离纯化两种组织的mRNA;逆转录合成掺入生物素标记的cDNA合成探针,与基因芯片(涵盖了18400个转录本,代表了14 500个明晰的基因)杂交,扫描芯片荧光信号图像,计算机分析,比较2种组织基因表达谱差异。结果:2例HCC组织与正常肝脏组织相比,有2756条基因(19.01%)共同表达差异,其中共同上调基因1772条和共同下调基因984条,对2756条共同差异表达基因作了初步功能分类,这些基因与HCC的发病机制存在相关性。结论:基因表达谱芯片技术可以筛选出HCC表达异常的相关基因群,有助于认识肝癌的发病机制。     

重型乙型肝炎外周血单核细胞基因表达谱研究

目的 应用基因芯片技术建立慢性重型乙型肝炎外周血单核细胞基因表达谱。方法 应用含8192条人体cDNA的微阵列芯片和来自外周血单核细胞的标记cDNA，分析了10例慢性重型乙型肝炎和10例无症状HBsAg携带者（ASC）基因表达谱。通过应用GenePix 4000B扫描仪和ImaGene3.0分析软件比较Cy5标记的慢性重型肝炎来源cDNA与Cy3标记的ASC来源cDNA的杂交结果，获得个体基因的相对表达比值。结果 在8192个基因中，初筛出249个（3％）表达差异达2倍以上的基因，其中主要是细胞信号和传递，细胞周期和代谢，凋亡及炎症相关类基因（占79％）。结论 这些结果提示了乙型肝炎病毒感染机体致慢性重型肝炎过程中，全面改变了宿主细胞内基因表达，并为进一步对这些差异表达基因的功能研究提供了一个框架。     

从热休克因子1基因敲除小鼠心肌组织中筛选应激反应中受热休克因子1调控的靶基因

采用cDNA芯片（上海博星公司，含15000个基因）分析了热休克因子1（HSF）基因敲除小鼠经热休克反应（42℃ 15min，恢复3h)后心肌组织中基因表达谱的改变，结果共筛选到差异表达基因1142个，其中在HSF^-／-小鼠心肌中表达下调的基因为501个，已命名基因为173个；在HSF^-/-小鼠心肌中表达上调的基因为641个，已命名基因为235个。对基因启动子区转录因子结合位点的分析发现，在HSF^-/-小鼠心肌中表达下调2．5倍的基因中，有Klf4和Sdrfl等5个基因启动子区含有完整的热休克元件（heat shock element,HSE);在HSF^-/-小鼠心肌中表达上调2．5倍的基因中，有Neul、Fgl2等6个基因启动子区含有完整的热休克元件，上述结果表明热休克因子1直接调控了这些基因的表达。本研究还采用生物信息学技术成功克隆了人XLHSRF1基因（GenBank ID:AY221994)及其大鼠同源基因。本实验在国际上首次从热休克因子1基因敲除小鼠心肌组织中筛选到应激反应中受热休克因子1调控的多个靶基因，为从基因水平进一步揭示热休克因子1在调节应激反应中的作用提供了新的信息。     

应用基因芯片技术筛选肝硬化相关基因

目的:探讨基因表达谱芯片技术在筛查肝硬化相关基因群表达中的作用.方法:按TRIzol法抽提肝硬化及正常肝脏组织总RNA,分离纯化两种组织的mRNA.经逆转录合成掺入生物素标记的cDNA合成探针,与基因芯片(涵盖18 400个转录本,代表14 500个明晰的基因)杂交,扫描芯片荧光信号图像,计算机分析,比较二种组织基因表达谱差异.结果:2例肝硬化组织与正常肝脏组织相比,有1424条基因(9.82%)共同表达差异,其中共同上调基因980条和共同下调基因444条.对1424条共同差异表达基因作了初步功能分类,这些基因与肝硬化的发病机制存在相关性.结论:基因表达谱芯片技术可以筛选出肝硬化表达异常的相关基因群,对其进一步研究有助于认识肝硬化的发病机制.     

肥厚型心肌病可变剪接图谱分析

目的绘制人心脏组织mRNA可变剪接图谱,探究肥厚型心肌病(HCM)中可变剪接的变化情况。方法收集HCM患者和正常人心肌组织,提取RNA并进行链特异性RNA深度测序,检测可变剪接变化,并通过功能富集分析初步了解HCM中受可变剪接调控的信号通路。实时荧光定量PCR检测可变剪接导致的不同转录本的表达变化,并在心肌肥厚动物模型中验证。结果在人类心肌组织中共发现11604个基因的94990个可变剪接事件,其中124个基因的可变剪接在HCM心肌组织中发生显著改变;GO和KEGG通路富集分析,显示可变剪接主要影响肌丝滑动、心肌收缩、肥厚型心肌病、扩张型心肌病、钙离子信号通路等功能或通路。RNA测序和定量PCR均显示虽然CAMK2δ表达总量不变,但是它的两个外显子互斥转录本,CAMK2δ3和CAMK2δ9,表达量发生了相反的改变;小鼠肥厚心肌模型也验证了这一发现。结论本研究首次绘制了人类心脏可变剪接图谱,明确HCM中多个基因发生可变剪接改变,发现即使基因表达总量没有变化,但基因不同转录本却可能通过可变剪接发生显著改变。提示可变剪接在HCM心肌肥厚中可能发挥重要作用,可变剪接图谱分析有助于更好地识别疾病相关的基因和通路。     

野生型K-ras2诱导结肠癌细胞基因表达谱改变的特征分析

目的：应用基因芯片技术,检测野生型K-ras2基因在结肠癌Caco2细胞中表达诱发的基因谱改变,进一步阐明野生型K-ras2基因可能的分子生物学功能.方法：抽取正常人的静脉血,提取RNA,反转录成cDNA,以此为模板,采用PCR方法克隆K-ras2野生型全编码cDNA序列.以常规的分子生物学技术将获得的K-ras2 cDNA克隆到T Easy载体中进行核苷酸序列的测定,构建真核表达载体pCI-neo-K-ras2,以脂质体转染结肠癌细胞系Caco2,提取mRNA逆转录为cDNA与转染空白表达载体pCI-neo的Caco2细胞进行cDNA芯片分析.结果：构建的表达载体经过限制性内切酶分析和DNA序列测定证实准确无误,提取高质量的RNA逆转录为cDNA进行DNA芯片技术分析.在135个差异表达基因中发现有24个基因表达水平显著上调,121个基因表达水平显著下调.差异表达基因与细胞增殖、分化、凋亡和信号传导等有关.结论：应用基因表达谱芯片技术成功筛选了野生型K-ras2转染结肠癌细胞后差异表达基因,反映出野生型K-ras2对细胞增殖、代谢、转录调控等过程的负性调控状态,为进一步阐明野生型K-ras2可能的生物学功能提供了新的线索.     

基于RNA-Seq技术的先天性巨结肠转录组学

目的筛选先天性巨结肠(hirschsprung disease,HSCR)患者病变肠组织和正常肠组织的差异表达基因.方法选取2例全结肠型HSCR、1例长段型HSCR患者,从福尔马林固定后石蜡包埋样本中提取RNA,采用去除核糖体的方法构建cDNA文库后,应用RNA-Seq全面分析3对肠组织样本的转录组,筛选出病变组织和正常组织的差异表达基因.应用GO(gene ontology)方法分析差异表达基因的功能聚类,应用KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)信号通路富集性方法分析差异表达基因相关的信号通路.结果 3对标本的总RNA提取质量合格,RNA-Seq测序数据质量合格,测序数据与人类基因组参考基因对比匹配率合格,样品间基因表达相关性合格.3对病变组织和正常组织共有1382个差异表达基因,包括899个表达一致上调的基因、483个表达一致下调的基因.1382个差异表达基因被分为383个功能聚类.KEGG分析表明这些差异表达基因参与胆汁分泌、蛋白质消化与吸收、脂肪消化与吸收、维生素A代谢、类固醇激素生物合成、淀粉和蔗糖代谢等信号通路.结论本研究首次利用RNA-Seq技术对先天性巨结肠病变组织和正常组织中的差异表达基因进行了全面分析,可为推动疾病发病机制的研究提供新思路.     

脂多糖诱导实验性急性水肿性胰腺炎演变为急性坏死性胰腺炎的基因表达谱变化

背景：既往对急性坏死性胰腺炎（ANP）的研究一般仅限于个别炎症相关基因的阐明,其发展过程中的基因表达谱变化尚未明确。目的：应用基因芯片技术分析脂多糖（LPS）诱导小鼠实验性急性水肿性胰腺炎（AEP）演变为ANP的基因表达谱变化,探讨该过程的基因变化机制。方法：分别以腹腔内注射雨蛙肽和雨蛙肽＋LPS诱导小鼠AEP和ANP模型,组织病理学检查鉴定建模是否成功。以Affymetrix小鼠寡核苷酸芯片检测AEP组和ANP组血白细胞基因表达谱,筛选差异表达基因。结果：ANP组/AEP组表达显著上调的基因包括转录因子、信号转导、炎症反应、黏附分子、急性反应蛋白、蛋白酶、细胞凋亡、氧自由基代谢等基因;表达显著下调的基因包括信号转导、黏附分子、细胞凋亡、防御反应、转录因子、代谢酶等基因。结论：AEP演变为ANP的基因变化模式可能为LPS等炎症信号激活酪氨酸蛋白激酶（TPK）信号通路和G蛋白介导的信号转导途径,活化C/EBPβ、Klf5等转录因子,从而促发Tnf、Il1b、Icam1等相关基因表达。     

应用基因芯片技术研究甲状腺乳头状癌的基因表达

目的　应用基因芯片技术研究甲状腺乳头状癌 (PTC)和正常成人甲状腺组织基因的差异表达。方法　分别用Cy5和Cy3两种不同的荧光染料通过逆转录反应将PTC组和对照组甲状腺组织的mRNA分别标记成探针 ,并与载有一组靶基因的基因表达谱芯片进行杂交。通过扫描荧光强度 ,计算机软件分析 ,寻找两组差异表达基因 ,并用RT PCR、免疫组化对其中两条基因进行验证。结果　共有 65条差异表达基因 ,其中表达增加的有 48条 (2 .0倍以上 ) ,表达降低的有 17条 (0 .5倍以下 )。RT PCR、免疫组化结果与芯片扫描结果一致。结论　基因芯片是筛选PTC与正常成人甲状腺组织差异表达基因的有效方法。通过筛选所得差异基因提示 ,PTC的发病涉及细胞外基质、细胞因子、受体信号转导等多个方面。     

基因表达谱芯片技术筛选HBV DNA多聚酶RNase H反式调节基因

目的:应用基因表达谱芯片(基因芯片)技术,检测乙型肝炎病毒DNA聚合酶RNase H结构域蛋白(HBV DNA P-RNase H, RNase H)的表达对肝母细胞瘤细胞HepG2基因表达谱的影响,进一步阐明RNase H对肝细胞基因表达的调节机制及其生物学功能.方法:以常规的分子生物学技术构建真核表达载体pcDNA 3.1(-)-RNase H,以脂质体转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,提取mRNA,逆转录为cDNA,与转染空白表达载体pcDNA 3.1(-)的HepG2细胞进行cDNA芯片分析.结果:RNase H表达质粒转染的细胞有222条差异表达基因,其中113条基因表达水平上调,109条基因表达水平下调.结论:应用基因芯片成功筛选了RNase H转染细胞后差异表达基因,为进一步阐明RNase H的反式激活作用及免疫调节机制提供了新的依据.     

基因表达谱芯片技术筛选XTP4基因转染细胞差异表达基因

目的 应用基因芯片技术,检测乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白(HBxAg)反式激活基因XTP4的表达对肝母细胞瘤细胞系HepG2基因表达谱的影响,进一步阐明XTP4蛋白可能的分子生物学功能。方法 设计并合成XTP4基因序列特异性的引物,应用聚合酶链反应(PCR)技术扩增XTP4基因片段,以常规的分子生物学技术将获得的XTP4编码基因片段克隆到TA载体中进行核苷酸序列的测定,构建真核表达载体pcDNA3.1(-)-XTP4。以脂质体转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,提取mRNA,逆转录为cDNA,与转染空表达载体pcDNA3.1(-)的HepG2细胞进行cDNA芯片分析。结果 构建的表达载体经过限制性内切酶分析和DNA序列测定,证实准确无误。提取高质量的mRNA,逆转录为cDNA,进行cDNA芯片分析。在1152个基因表达谱的筛选中,发现有21个基因表达水平显著上调,38个基因表达水平显著下调。结论 应用基因表达谱芯片成功筛选了XTP4转染细胞后差异表达基因,为进一步阐明XTP4蛋白可能的生物学功能提供依据。     

基因表达谱芯片技术筛选XTP1基因转染细胞差异表达基因

目的 应用基因芯片技术,检测乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白(HBxAg)反式激活基因XTP1的表达对肝母细胞瘤细胞系HepG2基因表达谱的影响,进一步阐明XTP1蛋白可能的分子生物学功能。方法 设计并合成XTP1基因序列特异性的引物,应用聚合酶链反应(PCR)技术扩增XTP1基因片段,以常规的分子生物学技术将获得的XTP1编码基因片段克隆到TA载体中进行核苷酸序列的测定,构建真核表达载体pcDNA3．1(-)-XTP1。以脂质体转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,提取mRNA,逆转录为eDNA,与转染空表达载体pcDNA3．1(-)的HepG2细胞进行cDNA芯片分析。结果 构建的表达载体经过限制性内切酶分析和。DNA序列测定,证实准确无误。提取高质量的mRNA,逆转录为cDNA,进行cDNA芯片分析。在1152个基因表达谱的筛选中,发现有3个基因表达水平显著上调,24个基因表达水平显著下调。结论 应用基因表达谱芯片成功筛选了XTP1转染细胞后差异表达基因,为进一步阐明XTP1蛋白可能的生物学功能提供依据。     

基因表达谱芯片筛选NS5ATP2剪切体NS5ATP2-512转染细胞差异表达基因

目的应用基因芯片技术检测丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白5A(NS5A)反式激活基因NS5ATP2剪切体512的表达对肝母细胞瘤细胞HepG2基因表达谱的影响,进一步阐明NS5ATP2剪切体512蛋白可能的分子生物学功能。方法设计并合成NS5ATP2基因序列特异性的引物,应用聚合酶链反应(PCR)技术扩增NS5ATP2蛋白编码基因片段,以常规的分子生物学技术将获得的NS5ATP2编码基因片段克隆到TA载体中进行核苷酸序列的测定,在此过程中发现其剪切体NS5ATP2512并构建真核表达载体pcDNA3.1(-)NS5ATP2512。以脂质体转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,提取mRNA,逆转录为cDNA,与转染空白表达载体pcDNA3.1(-)的HepG2细胞进行cDNA芯片分析。结果构建的表达载体经过限制性内切酶分析和DNA序列测定,证实准确无误。提取高质量的mRNA,逆转录为cDNA,进行DNA芯片技术分析。在1152个基因表达谱的筛选中,发现有14个基因表达水平显著上调,15个基因表达水平显著下调。结论应用基因表达谱芯片技术成功筛选了NS5ATP2剪切体NS5ATP2512转染细胞后差异表达基因,为进一步阐明NS5ATP2512蛋白可能的生物学功能提供依据。