清开灵有效组分对体外缺血再灌注损伤大鼠脑微血管内皮细胞的保护作用

目的:建立脑微血管内皮细胞体外缺血再灌注损伤模型,研究细胞生存活性和NO含量的变化,探讨清开灵有效组分的保护作用。方法:体外培养大鼠脑微血管内皮细胞,氧糖剥夺法模拟缺血再灌注损伤,MTT法测定细胞生存活性变化并结合硝酸酶还原法测定细胞上清NO含量。结果:模型组细胞OD值明显低于正常组,NO含量明显升高(P<0.01);清开灵各组分都显著降低上清中NO含量,而且胆酸、黄芩苷、栀子苷(12.5μg.mL-1)组和新清开灵注射液(0.03%)明显增高OD值(P<0.05)。结论:清开灵有效组分通过提高细胞生存活性、减少NO分泌而保护体外缺血再灌注损伤的脑微血管内皮细胞。     

活血化瘀注射液(HHI-I)对TNF-α诱发大鼠肺微血管内皮细胞黏附分子mRNA表达的影响

[目的]从调节白细胞内皮细胞过度黏附角度研究活血化瘀中药的作用机制。[方法]体外培养肺微血管内皮细胞，RT-PCR方法观察活血化瘀注射液对肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱发的体外培养大鼠肺微血管内皮细胞E-选择素、P-选择素、细胞间黏附分子ICAM-1 mRNA表达的影响。[结果]肺微血管内皮细胞与含TNF-α培养基共同孵育后，可显著增加内皮细胞E-选择素、P-选择素、ICAM-1 mRNA表达，在培养基中加入活血化瘀注射液含药血清后，则内皮细胞E-选择素、P-选择素、ICAM-1 mRNA过度表达被明显抑制。[结论]抑制内皮细胞E-选择素、P-选择素、ICAM-1 mRNA过度表达是活血化瘀重要的作用机制之一。     

活血化瘀注射液(HHI-Ⅰ)对TNF-α诱发大鼠肺微血管内皮细胞黏附分子mRNA表达的影响

[目的]从调节白细胞内皮细胞过度黏附角度研究活血化瘀中药的作用机制.[方法]体外培养肺微血管内皮细胞,RT-PCR方法观察活血化瘀注射液对肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱发的体外培养大鼠肺微血管内皮细胞E-选择素、P-选择素、细胞间黏附分子ICAM-1 mRNA表达的影响.[结果]肺微血管内皮细胞与含TNF-α培养基共同孵育后,可显著增加内皮细胞E-选择素、P-选择素、ICAM-1 mRNA表达,在培养基中加入活血化瘀注射液含药血清后,则内皮细胞E-选择素、P-选择素、ICAM-1 mRNA过度表达被明显抑制.[结论]抑制内皮细胞E-选择素、P-选择素、ICAM-1 mRNA过度表达是活血化瘀重要的作用机制之一.     

缺血再灌注损伤脑微血管内皮细胞Necroptosis模型的建立

目的:采用拟缺血再灌注损伤结合z-VAD-FMK(Benzyloxyearbonyl-Val-Ala-Asp-fluoromethylketone,z-VAD-FMK)干预,探索一种脑微血管内皮细胞(Brain Microvascular Endothelial Cells,BMECs)Necroptosis模型。方法:首先利用原代大鼠脑微血管内皮细胞,采用氧糖剥夺及复氧复糖方法,筛选出拟缺血再灌注损伤时间点。在拟缺血再灌注模型基础上,予Casepase抑制剂z-VAD-FMK 20μmol/L干预,采用CCK-8检测细胞活性;透射电镜观察细胞超微结构;Annexin V-FITC/PI(Propidium Iodide)双染色法检测细胞死亡方式。结果:确定氧糖剥夺2 h复氧复糖8 h,作为拟缺血再灌注时间点;z-VADFMK作用于拟缺血再灌注损伤BMECs后,细胞活性无统计学意义;z-VAD-FMK干预组在电镜下呈现明显的Necroptosis特征;流式检测显示,各象限细胞比率无明显变化,但Necroptosis特异性抑制剂Nec-1可显著降低Q2象限细胞比率,提示z-VAD-FMK干预抑制了细胞晚期凋亡,诱导了Necroptosis的发生。结论:z-VAD-FMK可诱导拟缺血再灌注脑微血管内皮细胞发生Necroptosis,为以后研究缺血性脑中风necroptosis机制提供了细胞实验模型。     

清开灵有效组分调控大鼠脑MVEC缺血再灌注损伤MMP-9mRNA表达的研究

目的:观察大鼠脑微血管内皮细胞缺血再灌注损伤MMP-9表达的影响,探讨清开灵有效组分保护血脑屏障阻抑脑缺血再灌注损伤的作用途径。方法:体外培养大鼠脑微血管内皮细胞,氧糖剥夺法模拟缺血再灌注损伤,采用RT-PCR方法半定量检测MMP-9mRNA的表达。结果:与正常组比较,模型组MMP-9mRNA表达明显增加(P<0.01);与模型组比,黄芩苷及新清开灵复方显著降低MMP-9mRNA的表达(P<0.05)。结论:清开灵有效组分可能通过减少血脑屏障内皮细胞MMP-9mRNA表达而阻抑脑缺血损伤炎症反应。     

疏血通降低大鼠脑缺血再灌注后血管黏附分子表达的研究

目的:研究疏血通注射液(SXT)对大鼠脑缺血再灌注后缺血侧脑组织细胞间黏附分子-1(ICAM-1)、血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)蛋白的表达及分布的影响。方法:建立大鼠大脑中动脉栓塞(MCAO)模型,在缺血2h、再灌注的同时,通过股静脉给予疏血通注射液(0.7mL/Kg)。分为假手术组(Sham组),模型组(Model组),疏血通注射液处理组(Model+SXT组)。给药处理24h后,取缺血侧脑组织,检测缺血侧脑组织中ICAM-1蛋白和VCAM-1蛋白的表达水平。用4%多聚甲醛固定脑组织,石蜡切片免疫组织化学法观察ICAM-1、VCAM-1的分布。结果:蛋白质印迹法和免疫组化显示,模型组缺血侧脑组织中黏附分子ICAM-1、VCAM-1蛋白表达显著增加,疏血通注射液抑制了两种黏附分子表达的增加。结论:疏血通注射液可以通过抑制大鼠脑缺血再灌注后脑组织ICAM-1和VCAM-1的表达,从而减轻脑缺血再灌注损伤。     

通心络对体外模拟脑缺血再灌注损伤大鼠脑微血管内皮细胞的保护作用

目的：观察通心络对体外模拟脑缺血再灌注损伤大鼠脑微血管内皮细胞的保护作用。方法：分离大鼠脑微血管内皮细胞培养鉴定,采用氧糖剥夺法建立模拟体外脑缺血再灌注内皮细胞损伤模型,利用制备的通心络含药血清干预,CCK-8法检测细胞活性;硝酸酶还原法测定细胞上清液NO的含量;Elisa法检测细胞上清液vWF的含量。结果：与正常组比较,模型组细胞OD值明显降低（P〈0．01）,细胞上清液NO和vWF（P〈0．05或P〈0．01）含量明显升高;与模型组比较,10％的通心络含药血清作用24h,细胞OD值明显增高（P〈0．01）,细胞上清液NO含量和vWF含量明显降低（P均〈0．01）。结论：通心络含药血清可能是通过减少NO和vWF分泌保护脑缺血再灌注损伤的脑微血管内皮细胞。     

脑心通胶囊对体外模拟脑缺血再灌注损伤大鼠脑微血管内皮细胞的保护作用

 目的观察脑心通胶囊对体外模拟脑缺血再灌注损伤大鼠脑微血管内皮细胞的保护作用。方法建立体外培养大鼠脑微血管内皮细胞模拟脑缺血再灌注损伤模型,模拟脑缺血3h,再灌注1,3,6,12,24,36,48,72h后损伤内皮细胞的活性、死亡率变化以及脑心通胶囊的影响,测定体外培养大鼠脑微血管内皮细胞模拟脑缺血3h,再灌注24h时脑心通胶囊含药血清对细胞裂解液SOD活性、MDA及NO含量的影响。结果体外培养的大鼠脑微血管内皮细胞在模拟缺血再灌注损伤后,细胞内线粒体活力下降,死亡率升高,脑心通胶囊0.24,0.48g·kg^-1能不同程度改善细胞损伤(P<0.05,P<0.01),明显提高裂解液中SOD活性(P<0.05,P<0.01),降低裂解液中MDA和NO含量(P<0.05,P<0.01),对大鼠脑微血管内皮细胞模拟脑缺血再灌注损伤有明显的保护作用。结论脑心通胶囊对体外培养大鼠脑微血管内皮细胞模拟脑缺血损伤有保护作用,其机制可能与抗脂质过氧化作用有关。     

清开灵注射液对大鼠脑缺血再灌注损伤过程中转化生长因子-β1表达的影响

目的：探讨清开灵注射液对大鼠脑缺血再灌注损伤过程中转化生长因子-β1（TGF—β1）表达的影响。方法：雄性Wistar大鼠，随机分成正常组、模型组及清开灵注射液治疗组。反复夹闭双侧颈总动脉复制脑缺血再灌注损伤模型。利用免疫组织化学方法在缺血再灌注不同时间点分别检测脑组织中GFAP及TGF—β1的含量。结果：大鼠脑缺血再灌注损伤不同时间点脑组织中GFAP及TGF—β1的表达有不同程度增加，而清开灵注射液可不同程度地降低GFAP及TGF-β1的表达。结论：清开灵注射液可能通过抑制星形胶质细胞活性而降低TGF—β1的表达。     

清开灵对小鼠脑微血管内皮细胞缺氧损伤MLCK基因转录的影响

目的:研究清开灵对小鼠脑微血管内皮细胞缺氧损伤MLCK基因转录的影响。方法:细胞分为正常对照组(有糖Earle液)、模型组(缺氧缺糖模拟缺血:无糖Earle液,37℃,5%CO2,1%O2培养24 h)、清开灵低、中、高浓度组(缺氧缺塘+清开灵1%、2%、4%),在37℃、5%CO2培养箱中培养24 h后经MTT比色法检测细胞活力、荧光定时定量PCR检测MLCK基因转录。结果:缺氧缺糖24 h后微血管内皮细胞活性降低(P<0.05)、MLCK基因转录被抑制(P<0.05);清开灵1%、2%、4%组均抑制了缺糖缺氧条件下微血管内皮细胞活性的降低(P<0.05),清开灵4%组降低MLCK的表达(P<0.05)。结论:缺糖缺氧条件下微血管内皮细胞活性降低。清开灵通过抑制MLCK的表达,恢复BBB的部分屏障功能。     

丹红注射液对缺氧损伤脑微血管内皮细胞的保护机制

为研究丹红注射液对缺氧损伤脑微血管内皮细胞(rBMECs)的保护机制。该实验采用原代培养乳鼠脑微血管内皮细胞并进行Ⅷ因子鉴定, 建立缺氧4 h损伤模型的同时, 丹红注射液(25, 50, 100 mL·L)作用于rBMECs, 生化法检测细胞中超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)水平, RT-PCR法检测细胞MMP-9, ICAM-1, P53 mRNA表达水平, 透射电镜观察细胞超显微结构变化。结果表明缺氧使原代培养的rBMECs受到明显损伤, 与模型组比较, 丹红注射液(50, 100 mL·L)可显著对抗缺氧造成的损伤, 增强SOD活性, 降低MDA水平, 明显下调MMP-9, ICAM-1, P53 mRNA的表达, 丹红注射液100 mL·L能够保护细胞正常的形态、显微结构、维持细胞间紧密连接, 抑制缺氧诱导的细胞凋亡。从结果中可以得出丹红注射液对缺氧损伤rBMECs具有明显的保护作用, 其机制与增强细胞抗氧化能力, 抑制炎症反应及细胞凋亡有关。     

高糖对人脑微血管内皮细胞黏附分子表达的影响及在内毒形成中的作用

目的:观察高糖环境下人脑微血管内皮细胞(HBMEC)细胞间黏附分子-1(ICAM-1)及血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)表达的变化,探讨其在内毒形成中的作用。方法:以培养HBMEC作为靶细胞,在内皮细胞培养基中加入无水葡萄糖制备细胞损伤模型。采用四甲基偶氮唑盐法(MTT法)检测高糖环境下细胞的活性;采用免疫细胞化学染色方法检测黏附分子ICAM-1、VCAM-1的蛋白表达。结果:高糖作用24、48、72h时,与正常对照组比较活性显著降低,ICAM-1、VCAM-1的蛋白表达水平也均明显升高(P<0.01),并呈剂量、时间依赖性。结论:高糖对HBMEC有显著的损伤作用,黏附分子表达升高在糖尿病微血管病变早期可能起主要作用,其动态变化和毒性效应体现了内毒形成及作用过程。     

谷红注射液抗脑缺血性再灌注损伤的作用及其机制

为探讨谷红注射液抗脑缺血再灌注损伤的作用及机制, 本实验将SD大鼠随机分为假手术组、模型组、谷红注射液低、中、高剂量组、尼莫地平注射液组, 每组10 只。在建立大鼠大脑中动脉局灶性栓塞(MCAO)模型的基础上, 观察大鼠神经功能缺损症状, 脑梗死体积比, 各组大鼠脑组织中超氧化物歧化酶(SOD)活力, 丙二醛(MDA)含量, 谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和过氧化氢酶(CAT)的活性;以及血清组织型纤溶酶原激活物(t-PA)、纤溶酶原激活物抑制因子(PAI)含量、血栓素B₂(TXB₂)和 6-酮前列腺素F_1α (6-keto-PGF_1α )的含量。结果表明谷红注射液能显著促进神经功能缺损症状的恢复, 缩小大鼠手术后的脑梗死体积, 显著提高脑组织中SOD, GSH-Px和CAT活性, 降低MDA含量, 同时还可显著提高血清中t-PA的含量, 降低PAI含量, 降低TXB₂的含量, 提高6-keto-PGF_1α 含量。说明谷红注射液具有较好的抗氧化和抗血栓的作用, 对大鼠脑缺血再灌注损伤有明显的保护作用。     

灯盏花素对大鼠脑微血管内皮细胞损伤的保护作用

目的观察灯盏花素对谷氨酸致原代培养的大鼠脑微血管内皮细胞(rBMECs)损伤的保护作用。方法灯盏花素(200、100、50μmol/L)作用于rBMECs 24 h后,加入谷氨酸(终浓度为1 mmol/L)培养18 h,MTT法检测rBMECs细胞活性,并按试剂盒方法检测细胞上清液中乳酸脱氢酶(LDH)水平、细胞中丙二醛(MDA)水平和超氧化物歧化酶(SOD)活性。结果谷氨酸(l mmol/L)使原代培养的rBMECs明显受到损伤,灯盏花素高、中浓度(200、100μmol/L)可显著对抗谷氨酸造成的rBMECs损伤,抑制LDH释放,降低MDA水平,增强SOD活性。结论灯盏花素对谷氨酸所致原代培养的rBMECs损伤具有明显的保护作用,其机制与增强细胞抗氧化能力有关。     

脑微血管内皮细胞体外缺血再灌注模型的建立及牛胆酸的保护作用

目的:建立脑微血管内皮细胞体外缺血再灌注模型,并观察了牛胆酸对其影响。方法:体外培养大鼠脑微血管内皮细胞,以氧糖剥夺(Krebs液)再复氧复糖模型模拟缺血再灌注损伤,并用牛胆酸进行了干预,用MTT比色法测定A值代表细胞生存活性。结果:氧糖剥夺4h再复氧复糖12h可造成培养大鼠脑微血管内皮细胞损伤,牛胆酸干预后A值明显高于模型组(P<0.01)。结论:牛胆酸可显著减轻脑微血管内皮细胞体外模拟缺血再灌注细胞损伤。     

参脉注射液对实验性肺缺血/再灌注损伤时血红素氧合酶-1表达与活性的影响

目的:探讨参脉注射液对兔肺缺血-再灌注损伤时血红素氧合酶-1(HO-1)表达与活性的影响。方法:采用在体兔单肺原位缺血-再灌注损伤模型。实验兔20只,随机均分为肺缺血-再灌注损伤组(I-R组)和参脉注射液治疗组(SM组,15 mL.kg^-1)。用原位杂交方法观察HO-1在兔肺组织中的表达变化;测定肺组织湿干重比(W/D)及肺泡损伤数(IAR);电镜观察肺组织超微结构的改变。结果:HO-1在I-R组、SM组肺血管内皮、部分血管平滑肌、外膜层及部分气道上皮均有阳性表达,原位杂交的平均吸光度分别为0.148±0.013,0.158±0.012,SM组HO-1的表达水平明显高于I-R组(P<0.01),W/D,IAR值显著低于I-R组(P<0.01),肺组织形态学异常改变轻于I-R组。结论:参脉注射液可通过提高肺组织HO-1的表达水平,对肺缺血-再灌注损伤发挥积极的保护作用。     

脉络宁对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用及其机制研究

目的：探讨脉络宁注射液对大鼠脑缺血再灌注（ischemia/reperfusion,I/R）损伤的保护作用及其机制。方法：健康成年雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠随机分为假手术组、模型组、依达拉奉对照组（3 mg·kg^-1）、脉络宁高、中、低剂量组（4,2,1 mL·kg^-1）,每组10只,尾静脉注射给药。采用线栓法阻断大脑中动脉（middle cerebral artery occlusion,MCAO）建立大鼠I/R模型。缺血2 h,再灌注24 h时后,HE染色观察大鼠缺血侧脑组织神经血管单元（neurovascular unit,NVU）的病理变化,免疫组织化学法检测胶质纤维酸性蛋白（glialfibrillary acidic protein,GFAP）及离子钙接头蛋白（ionized calcium binding adaptor molecule 1,Iba1）的表达,蛋白免疫印记法检测肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）、白细胞介素-1β （interleukin 1β,IL-1β）、血管细胞黏附分子-1（vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-l）、细胞间黏附分子-1（intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1）的表达。结果：脉络宁注射液明显改善缺血再灌注大鼠脑组织NVU的病理变化;减少GFAP和Iba1阳性细胞的数量;显著降低缺血再灌注大鼠脑组织TNF-α,IL-1β,ICAM-1,VCAM-1的表达。结论：脉络宁注射液对脑缺血再灌注大鼠神经血管单元具有明显的保护作用,其机制可能涉及抑制星形胶质细胞和小胶质细胞的激活,以及多种炎性因子的分泌和表达。     

川芎内酯A预处理对心肌微血管内皮细胞缺氧/复氧损伤保护作用及机制研究

目的：探讨川芎内酯A预处理对心脏微血管内皮细胞缺氧/复氧（H/R）损伤的保护作用及作用机制。方法：采用体外培养的大鼠乳鼠心脏微血管内皮细胞,空白组不加任何处理；单纯H/R组缺氧4 h/复氧2 h；单纯预处理组低氧25 min/复氧30 min,然后缺氧4 h/复氧2 h,各给药组分别加1×10^-7,1×10^-9,1×10^-11 mol·L^-1的川芎内酯A孵育55 min,然后缺氧4 h/复氧2 h；实验结束后取细胞上清液测一氧化氮（NO）,一氧化氮合酶(NOS),内皮素（ET）,取造模后的且固定在盖玻片的细胞,用原位杂交法检测iNOSmRNA和ETmRNA的基因表达。结果：H/R组细胞存活数降低明显,细胞培养液中NO和NOS活性显著降低,ET的活性明显升高,iNOSmRNA表达量减少,ETmRNA表达量增加；川芎内酯A 3个剂量组与H/R组比较,细胞存活数均明显增加,细胞培养液中NO和NOS活性增加,ET活性降低,iNOSmRNA表达量增加而ETmRNA表达量则减少。结论：川芎内酯A预处理能减轻内皮细胞损伤,对心脏微血管内皮细胞缺氧/复氧损伤可能具有保护作用,其作用机制可能与上调内皮细胞中iNOSmRNA的表达和下调ETmRNA的表达有关。