中低温度热疗诱导骨肉瘤细胞株凋亡

目的:研究加热诱导成骨肉瘤细胞株(OS-9901)凋亡,为中低温度热疗辅助成骨肉瘤综合治疗提供理论依据. 方法:成骨肉瘤OS-9901细胞株分别经不同温度的热疗作用1 h,用TUNEL法染色及计数、透射电子显微镜观察其对骨肉瘤细胞株的诱导凋亡作用. 同时通过免疫组织化学染色,观察43℃ 1 h热疗对成骨肉瘤细胞株OS-9901的Bcl-2蛋白表达的影响. 结果:43℃作用1 h的成骨肉瘤细胞株继续培养6 h后出现大量异常细胞,透射电镜观察可见有典型的细胞凋亡特征性形态改变. TUNEL法染色后通过计数可见有42%的细胞凋亡比例. 免疫组织化学显示,43℃作用1 h的成骨肉瘤细胞株6 h后Bcl-2蛋白的表达明显减少. 结论:43℃作用1 h可以诱导成骨肉瘤细胞株OS-9901凋亡. 加热后成骨肉瘤细胞Bcl-2表达减少,从而进一步诱导发生细胞凋亡,为热疗诱导肿瘤细胞凋亡的机制提供了部分理论依据.     

咖啡因在骨肉瘤顺铂化疗中增效作用的实验研究

目的探讨咖啡因在骨肉瘤细胞株(OS-732)顺铂化疗中的增效作用.方法骨肉瘤细胞株分别经咖啡因、顺铂、咖啡因 顺铂作用72h,采用MTT法体外细胞毒性试验观察三者的细胞毒性;应用流式细胞仪分析咖啡因、顺铂及两者配伍对骨肉瘤细胞株细胞周期的影响.结果骨肉瘤细胞株与浓度分别为0.2、2.0、5.0、10.0、20.0mmol/L的咖啡因作用时,细胞毒性指数(CI)分别为12.50%、27.88%、30.77%、56.73%、84.62%;与浓度为0.1、1.0、10.0、100.0μg/ml的顺铂作用时,CI分别为24.04%、54.80%、65.38%、88.46%;而与低浓度咖啡因与顺铂联合作用,其CI明显增加,随着各自浓度的升高,CI明显增加.流式细胞仪分析显示咖啡因对细胞周期也有明显的影响,使G0与G1期细胞比例明显增加,G2与M期细胞比例明显减少,S期细胞比例无明显改变.结论咖啡因在骨肉瘤细胞株顺铂化疗中有显著的增效作用,并能改变骨肉瘤细胞的细胞周期.     

康莱特联合顺铂高效杀伤骨肉瘤细胞

目的 研究康莱特联合顺铂对骨肉瘤细胞的杀伤作用及其相关机制，探寻骨肉瘤的中西医结合化疗方案。方法 免疫组化及RT—PCR方法检测不同浓度康莱特作用下骨肉瘤OS732细胞的Fas表达，并将康莱特与顺铂单独及联合应用于OS732细胞，采用MTT法检测细胞毒性作用，流式细胞仪定量分析凋亡细胞所占比例，相差显微镜及荧光显微镜下观察凋亡细胞形态改变。结果 康莱特可上调OS732细胞的Fas表达并诱导凋亡，10μL／mL康莱特与1μg／mL顺铂合用于OS732细胞的抑制率与各自单用时相比明显提升（P〈0．01）。细胞形态观察及凋亡率测定也显示，康莱特与顺铂联用可诱导更多OS732细胞凋亡。结论 康莱特可协同顺铂高效杀伤骨肉瘤细胞，这可能与康莱特上调Fas表达诱导骨肉瘤细胞凋亡有关。     

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体诱导骨肉瘤细胞凋亡的研究

目的：研究肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）对骨肉瘤OS-732细胞的诱导凋亡作用，探寻骨肉瘤临床化疗的斯方案。方法：将TRAIL应用于体外培养的骨肉瘤OS-732细胞，采用MTr法检测细胞毒性作用，倒置相差显微镜及荧光染色方法观察肿瘤细胞形态改变，扫描及透射电镜在亚细胞形态上证实凋亡细胞。结果：不同浓度TRAIL作用下，细胞抑制率问差别十分显著（P〈0.01）。超微结构观察显示骨肉瘤细胞凋亡。结论：TRAIL诱导骨肉瘤细胞凋亡，且具有浓度依赖性。     

顺铂联合卡铂对骨肉瘤细胞株毒性的实验研究

目的探讨半量顺铂、卡铂联合对骨肉瘤细胞株(OS-732)的细胞毒性强度,为临床应用提供实验依据.方法采用MTT法细胞毒性试验,先分别获取顺铂、卡铂对骨肉瘤细胞株的半数抑制浓度(IC50),再分别用IC50的顺铂、IC50的卡铂、1/2IC50的顺铂 1/2IC50的卡铂作用骨肉瘤细胞株48h和72h,比较3组药物对骨肉瘤细胞株的细胞毒性.结果根据相应实验结果制作生长曲线求得顺铂、卡铂对骨肉瘤细胞株的IC50分别为7.6μg/ml和199.0μg/ml.分别用8.0μg/ml顺铂、200.0μg/ml卡铂、4.0μg/ml顺铂 100.0μg/ml卡铂作用48h时,对骨肉瘤细胞株的细胞毒性指数(CI)值依次为(54.7±5.3)%、(56.9±6 3)%、(57.5±5.7)%,3组比较差别无显著性意义(P＞0.05);作用72h时CI值依次为(65.7±4.5)%、(69.4±2.2)%、(68.4±3.6)%,含卡铂的两组与单独顺铂组比较差别均有显著性意义(均P＜0.05).结论半量顺铂、卡铂联合应用能产生单独顺铂或卡铂对骨肉瘤细胞株相似的细胞毒性作用.     

锰型超氧化物歧化酶基因转染对人骨肉瘤细胞的诱导凋亡作用

目的探讨锰型超氧化物歧化酶(MnSOD)基因转染对人骨肉瘤细胞的诱导凋亡作用。方法采用电穿孔方法将反义和正义MnSOD cDNA表达载体稳定转染OS-732骨肉瘤细胞,应用四唑蓝(MTT)比色法、流式细胞技术、DNA梯度实验观察MnSOD转染对OS-732细胞的诱导凋亡作用。结果转染了pHβA-SOD ( )载体的OS-732细胞(MnSOD-732)较对照空载细胞(Vector-732)生长明显受到抑制,生长曲线呈下降趋势(P＜0．05),说明细胞凋亡或死亡。转染了pHβA-SOD(-)载体的OS-732细胞(MnSOD AS-732)生长曲线呈上升趋势(P＜0．05),说明MnSOD低表达可促进骨肉瘤细胞生长。Vector-732和MnSOD AS-732培养24h后未出现Ap峰,MnSOD-732培养24h后G_1峰前出现Ap峰,肿瘤细胞凋亡率为13．26%。细胞周期分析显示, MnSOD-732较Vector-732或MnSOD AS-732的S期比例明显增加,G2～M期比例明显减少。MnSOD-732可见DNA梯度条带,Vector-732和MnSOD AS-732均未见明显梯状条带。结论转染正义MnSOD质粒可诱导OS-732细胞凋亡,MnSOD有望成为新的骨肉瘤细胞抑制剂。     

顺铂联合卡铂对骨肉瘤细胞毒作用的实验研究

目的 :通过半量顺铂和卡铂联合与单一顺铂或卡铂对骨肉瘤细胞株 (OS - 732 )的细胞毒性的对比研究 ,为顺铂联合卡铂治疗骨肉瘤提供实验依据。方法 :用IC50 的顺铂、IC50 的卡铂、 1/2IC50 的顺铂 +1/2IC50的卡铂与骨肉瘤细胞株 (OS - 732 )的作用 4 8、 72h后计算各组的细胞毒性指数值 (CI)。结果 :IC50 的顺铂、IC50 的卡铂、 1/2IC50 的卡铂与骨肉瘤细胞株 (OS - 732 )的作用 4 8h后CI值分别为 5 5 8%、 5 7 4 %、 5 8 1% ,三组比较无统计学意义 (P >0 0 5 ) ;IC50 的顺铂、IC50 的卡铂、 1/2IC50 的顺铂 +卡 1/2IC50 的卡铂与骨肉瘤细胞株 (OS - 732 )作用 72h后CI值分别为 6 4 4 %、 6 9 8%、 6 8 5 % ,IC50 的顺铂组与 1/2IC50 的顺铂 +1/2IC50 的卡铂组和IC50 的卡铂组比较均有统计学意义 (P <0 0 5 )。IC50 的卡铂组与 1/2IC50 的顺铂 +1/2IC50 的卡铂组比较无统计学意义 (P >0 0 5 )。结论 :半量顺铂、卡铂联合能产生与单独顺铂或卡铂对骨肉瘤细胞株 (OS - 732 )相似的细胞毒性作用。     

顺铂损伤U2-OS细胞诱导细胞周期阻滞、凋亡及p53、bcl-2、c-myc基因表达的实验研究

目的 探讨顺铂损伤U2骨肉瘤细胞(U2-OS)诱导细胞周期阻滞及凋亡过程中不同时间p53、bcl-2、c-myc基因表达的变化,为提高骨肉瘤化疗敏感性提供理论依据.方法 使用0、0.3、3.0、30.0 μg/mL顺铂作用U2-OS细胞2 h后继续培养0、6、12、24、48 h.采用四唑蓝比色法(MTT法)、流式细胞术、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、蛋白免疫印迹发光法(Western blot法)检测顺铂对U2-OS细胞体外增殖、凋亡作用、细胞周期变化及相关基因的表达.结果 不同浓度的顺铂在体外对U2-OS细胞均有抑制作用,其抑制率随着浓度明显增加,且有组间差异(P<0.05).在顺铂损伤早期细胞发生G1期细胞周期阻滞,且仅p53明显表达;继续培养48 h后,30.0 μg/mL顺铂作用过的细胞凋亡率达27.08%,p53、bcl-2和c-myc mRNA及蛋白表达呈现明显组间差异.结论 不同浓度顺铂通过细胞内p53、bcl-2、c-myc基因表达的变化,诱导骨肉瘤细胞凋亡是其抗肿瘤的机制之一.在细胞损伤早期p53的表达诱导了G1细胞周期的阻滞,而中后期p53的表达抑制了bcl-2的表达,促进细胞凋亡的发生.c-myc基因表达的抑制在损伤后期参与了抑制细胞的增殖.     

热疗联合顺铂诱导人胃癌MKN45细胞凋亡作用的研究

为研究顺铂及同时合并43℃30min热疗作用下胃癌细胞的凋亡过程,采用细胞培养的方法,通过AO染色、DNA微电泳及电镜观察,发现人胃癌MKN 45细胞在25mg/L浓度的顺铂作用2h、43℃30min热疗作用及两者同时作用下,呈现不同程度的凋亡。电镜观察到凋亡的细胞表;现DNA微电泳呈拖尾现象,提示凋亡细胞内DNA片断化;凋亡细胞AO染色呈阳性反应,且顺铂与热疗共同作用时AO阳性率高于两者单独作用时,有显著性差异(P<0.05),但两者单独作用时AO染色比较无显著性差异。提示热疗与顺铂合用时对人胃癌细胞的凋亡具有协同作用。     

顺铂与卡铂对骨肉瘤细胞株作用的分子机制

目的探讨顺铂与卡铂对骨肉瘤细胞(MG-63)作用的分子机制。方法骨肉瘤细胞混悬液与不同浓度顺铂和卡铂分别作用24、48、72 h后,用倒置显微镜观察细胞生长情况。用噻唑蓝法测定每孔的吸光度值,制作生长曲线,并求出顺铂和卡铂的半抑制浓度(IC_(50))。用IC_(50)顺铂、卡铂作用于骨肉瘤细胞24、48、72 h后用流式细胞仪进行细胞周期分析。免疫印迹技术观察细胞的增殖细胞核抗原(PCNA)、Bcl-2和Bax的表达。结果相同浓度顺铂和卡铂作用的骨肉瘤细胞死亡数量随时间增加而增加。不同浓度顺铂和卡铂对骨肉瘤细胞分别作用24、48、72 h后,对细胞的生长均起到抑制作用,相同时间内,药物浓度越高,生长抑制作用越明显(P<0.05)。骨肉瘤细胞与IC_(50)顺铂和卡铂作用24、48、72 h后,在细胞各期均未见明显凋亡峰,但随着时间增加,G_1、S、G_2期所占比例逐渐下降;顺铂和卡铂作用后不同时间点凋亡细胞所占比例比较差异均有统计学意义(P<0.05)。与对照组比较,顺铂组和卡铂组PCNA表达下降,Bax表达增加,Bcl-2表达略减少。结论顺铂和卡铂对肿瘤细胞生长各期均有抑制作用,对于骨肉瘤细胞来说,卡铂的浓度约需25倍于顺铂才能产生相似的生长抑制效应。顺铂、卡铂与骨肉瘤细胞作用后存在凋亡现象,但是未能形成凋亡峰,这可能与铂类化合物能够对处于任何生长周期的细胞均能产生杀伤作用有关。     

Induction of apoptosis in osteogenic sarcoma cells by combination of tumor necrosis factor-related apoptosis inducing ligand and chemotherapeutic agents

Background Osteosarcoma is one of the most common primary malignant tumors of bone with poor prognosis. TNF-related apoptosis inducing ligand (TRAIL) is a member of the tumor necrosis factor (TNF) cytokine family. TRAIL induces apoptosis in various tumor cell lines but is not found to be cytotoxic to many normal cell types in vitro. We investigated the cytotoxic activity of TRAIL and chemotherapeutic agents, including methotrexate (MTX), doxorubicin (DOX) and cisplatin (CDDP), on established osteosarcoma cell line—OS-732.Methods OS-732 cells were incubated with chemotherapeutic agents MTX,DOX and CDDP at various peak plasma concentrations(PPC), 0.1PPC,1PPC and 10PPC, alone or with 100 ng/ml of TRAIL for 24 hours or 48 hours. MTT was used to evaluate the cytotoxic activity of different agents on OS-732. The apoptosis proportion was assayed by flow cytometry. Cellular morphologic changes were observed by phase contrast microscope, scan electron microscope, and transmission electron microscope.Results The inhibitory rate was (24.438±3.414)% with TRAIL of 100 ng/ml for 24 hours. The cells were responsive to DOX and CDDP with a dose-effect relationship (P&lt;0.05). In OS-732 cells, DOX and CDDP cooperated synergistically with TRAIL when incubated the cells with them for 24 hours (the combined inhibitory rate is (58.360±2.146)% and (54.101±2.721)%, respectively). TRAIL alone or drugs alone induced the apoptosis rate was less than 25% (P&lt;0.05). However, the combination of TRAIL and MTX did not present synergistic effects on OS-732 cells (P&gt;0.05, compared with TRAIL alone). Conclusions Osteosarcoma OS-732 cells were not responsive to TRAIL-induced apoptosis. DOX and CDDP sensitize osteosarcoma OS-732 cells to TRAIL-induced apoptosis. The combination of TRAIL and MTX presented no synergistic effects on killing OS-732 cells.     

重组野生型p53基因转染人骨肉瘤细胞株体外实验模型的建立

目的：将外源性野生型ｐ５３基因导入人骨肉瘤细胞株中，为进一步研究野生型ｐ５３蛋白诱导骨肉瘤细胞凋亡提供体外实验模型。方法：用ＤＮＡ转染技术将ＰＭ４７质粒，它是一种含激素诱导启动的鼠乳腺肿瘤病毒启动子和生化选择标志基因Ｅｃｏｇｐｔ的重组野生型ｐ５３ｃＤＮＡ质粒导入人骨肉瘤细胞株ＯＳ－７３２中，用ｇｐｔ选择培养基筛选阳性细胞克隆。结果：成功地将外源性野生型ｐ５３ｃＤＮＡ重组质粒导入人骨肉瘤细胞株ＯＳ－７３２细胞中，在ｇｐｔ选择培养基中培养２周后生长出阳性细胞克隆，命名为ＯＳ－７３２－Ｐ。结论：利用基因转染技术能将外源性野生型ｐ５３基因导入人骨肉瘤细胞株中，并能在选择培养基中生长     

人骨肉瘤细胞系OS—732诱导微血管生成的解剖显微结构及超微结构观察

目的 观察人骨肉瘤细胞系OS-732诱导微血管生成的解剖显微结构及超微结构特点。方法 应用鸡胚绒毛尿囊膜模型。通过解剖显微镜，光镜及透射电镜观察该细胞系诱导生成微血管的解剖显微结构及超微结构特点。结果 OS-732细胞系具有较强的诱导血管生成能力，解剖显微镜下可见血管辐辏现象。透射电镜下可见新生血管壁由单层内皮细胞构成，内皮细胞裂隙增宽，基底膜不完整，缺乏平滑肌成分。结论 肿瘤诱导的新生血管在病理，生理及形态功能方面都具有特征性，以血管为靶点治疗骨肉瘤对改善预后可能具有重要意义。     

抗VEGF抗体对骨肉瘤OS-732细胞血管生成及其肿瘤细胞增殖、凋亡的影响

目的：探讨阻断血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor,VEGF)的血管生成作用对骨肉瘤OS-732细胞及血管内皮细胞增殖、凋亡的影响。方法：应用鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）模型,通过解剖显微镜血管计数,光镜HE染色,原位末端标记及PC-NA免疫组化检测观察VEGF抗体对骨肉瘤血管生成及肿瘤增殖,凋亡状态的影响。结果：VEGF抗体组肿瘤区血管数目及瘤细胞数显著低于PBS对照组,肿瘤细胞凋亡指数显著高于PBS对照组,增殖指数两组差异不明显,同时VEGF抗体组凋亡的微血管内皮细胞增多,增殖期微血管内皮细胞少见。结论：VEGF抗体能显著抑制骨肉瘤OS-732血管生成,抑制内皮细胞增殖,促进内皮细胞凋亡,可能是VEGF抗体发挥抗血管生成作用的途径之一,并可能通过抑制血管形成而促进肿瘤细胞凋亡,最终达到抑制瘤细胞生长的作用。     

顺铂联合蛋白酶体抑制剂杀伤骨肉瘤细胞的研究

目的:观察顺铂和蛋白酶体抑制剂对骨肉瘤细胞的杀伤作用.方法:用四甲基偶氮唑盐法检测细胞存活率,电镜观察细胞凋亡形态,流式细胞仪分析凋亡率,逆转录聚合酶链反应检测切除修复基因-1(ERCC-1)的转录水平.结果:骨肉瘤细胞存活率蛋白酶体抑制剂与顺铂联合作用比单独顺铂作用低,细胞显示出更特征性的凋亡形态,凋亡率高从(14.37±2.37)%上升到(50.93±4.84)%(P<0.01).顺铂单独作用能增加ERCC-1的转录水平,顺铂和蛋白酶体抑制剂联合作用后ERCC-1转录水平有所下降.结论:蛋白酶体抑制剂能增强顺铂杀伤骨肉瘤细胞和诱导骨肉瘤细胞的凋亡.这可能与降低ERCC-1转录有关.     

人成骨肉瘤细胞系OS-732细胞周期的研究

本文应用放射自显影技术研究人成骨肉瘤细胞系OS-732的细胞周期。实验结果表明,细胞周期T_c为18.7小时,平均核分裂指数为3.73‰。T_s=13.1小时,T_M=1小时,T_(G1)=3.6小时,平均标记指数为35.96％,生长指数为51.34％。这些结果提示OS-732细胞系保持其生长特性,对人成骨肉瘤的各种实验研究是较好的模型。     

骨肉瘤VEGF表达及VEGF抗体抑制血管生成的实验研究

目的研究血管内皮生长因子（VEGF）表达与骨肉瘤血管生成和预后的关系,以及VEGF抗体抑制骨肉瘤细胞OS-732诱导血管生成的作用和可能机制,为以VEGF为靶点治疗骨肉瘤提供实验依据。方法应用免疫组化和形态计量方法,检测80例骨肉瘤VEGF表达、肿瘤微血管密度（MVD）,以及OS-732血管生成相关因子的表达。进一步应用鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）模型观察VEGF抗体对OS-732诱导血管生成及肿瘤细胞生长的抑制作用。结果（1）骨肉瘤VEGF表达与肿瘤微血管密度（MVD）及预后密切相关。（2）OS-732表达VEGF和BFGF,而且VEGF表达强度明显高于BFGF,OS-732具有很强的诱导血管生成能力。（3）VEGF抗体干预实验结果显示VEGF抗体组肿瘤区血管密度明显低于PBS对照组,细胞凋亡指数显著高于PBS对照组,而增殖指数两组差异无统计学意义。同时,VEGF抗体组凋亡的微血管内皮细胞增多,增殖期内皮细胞少见。结论VEGF是骨肉瘤重要的血管生成因子,其表达可能是评估骨肉瘤预后的一项有价值的指标。VEGF抗体能够抑制内皮细胞增殖,促进内皮细胞凋亡,显著抑制骨肉瘤OS-732血管形成,并可能通过抑制血管形成而促进肿瘤细胞凋亡,达到抑制瘤细胞生长的作用。该结果提示VEGF可以作为骨肉瘤抗血管生成治疗的潜在靶分子。