手足口病患者柯萨奇病毒核酸检测结果分析

目的探讨手足口病患者柯萨奇病毒核酸检测的临床应用价值。方法利用实时荧光聚合酶链反应技术,以EV71/CA16基因组编码区的高度保守区为靶区域,设定特异性引物及荧光探针,通过一步法RT-PCR扩增对EV71RNA/CA16RNA进行检测。结果在428份患者标本中,EV71-RNA阳性136份,CA16-RNA阳性6份,其中有1例患者既是EV71-RNA咽拭子和肛拭子均阳性又是CA16-RNA咽拭子阳性。而有40例(80份标本)患者EV71-RNA咽拭子和肛拭子均阳性,46份EV71-RNA单独肛拭子阳性,10份EV71-RNA单独咽拭子阳性。在6份CA16-RNA阳性患者标本中,4份为肛拭子阳性,2份为咽拭子阳性。结论手足口病患者柯萨奇核酸检测对重症患者判断预后有重要的指导意义,对指导临床合理制订治疗方案有重要的参考价值,值得推广应用。     

全自动核酸提取仪对三种性传播病原体检测的性能评价

目的评价全自动核酸(RNA)提取仪(型号MagX)对沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,CT)、淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae,NG)和解脲脲原体(Ureaplasmaurealyticum,UU)检测结果应用于临床的可行性。方法收集检测CT样本159例、NG样本128例、UU样本144例,应用荧光核酸恒温扩增检测技术(Simultaneous Amplification and Testing,SAT),同一样本分别采用手工提取分装加样和MagX提取分装加样两种检测方法,然后进行实时荧光PCR。以手工检测结果为金标准,对MagX检测结果进行阳性符合率(灵敏度)、阴性符合率(特异度)、总符合率(准确度)的评价。同时,对该仪器进行防污染验证。全自动核酸(RNA)提取仪与手工检测结果进行Kappa一致性分析。结果 159例CT,128例NG和144例UU样本的阳性符合率、阴性符合率、总符合率依次为CT:0.910 6,92.59%,98.48%和97.48%;NG:0.938 3,100.00%,98.18%和98.44%;UU:0.885 6,93.33%,95.24%和94.44%;其Kappa系数均0.8(CT:Kappa=0.910 6,NG:Kappa=0.938 3,UU:Kappa=0.885 6),CV值均5%;没有携带污染现象存在。结论上海仁度生物科技生产的CT,NG和UU核酸检测试剂盒(RNA恒温扩增)在全自动核酸(RNA)提取仪(型号MagX)的检测符合临床检测标准,可在临床使用。     

实时荧光RT-PCR快速检测肠道病毒RNA及其临床意义

目的应用实时荧光逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法快速检测肠道病毒RNA,为手足口病的早期诊断提供临床依据。方法采用实时荧光RT-PCR法检测手足口病患儿粪便、脑脊液中肠道病毒通用型、柯萨奇病毒A组16(CA16)和肠道病毒71型(EV71)RNA。结果 234份粪便标本中肠道病毒通用型阳性214例,检出率为91.45%;CA16阳性56例,阳性率为23.50%;EV71阳性87例,阳性率37.17%,其中有4例同时检出CA16和EV71。2份脑脊液标本中3种肠道病毒核酸结果均为阴性。结论实时荧光RT-PCR能对肠道病毒RNA进行快速检测,为手足口病的早期诊断提供诊断依据,并对手足口病患儿的病情分析、治疗及预后观察起到指导作用。     

实时荧光核酸恒温扩增技术检测泌尿生殖道沙眼衣原体感染

目的 评价实时荧光核酸恒温扩增技术（simultaneous amplification and testing, SAT）检测沙眼衣原体（CT）核酸试剂盒（RNA恒温扩增）的敏感性和特异性。 方法 对229例临床疑似患者的尿样及拭子标本同时进行SAT检测和“金标准”沙眼衣原体细胞培养检测,检测结果有差异的标本采用PCR方法对拭子标本进行复测,根据实验结果评估SAT技术在尿样及拭子标本检测中的敏感性和特异性。 结果 结合细胞培养和PCR的实验结果作为“扩大金标准”,得出SAT技术对临床拭子标本的检测敏感性为97.1%,特异性为100%;对尿样标本检测的敏感性为89.4%,特异性为99.2%。拭子和尿样标本检测结果的符合率为95.2%,经卡方检验,差异无显著性（χ^{2=3.27,P>0.05）。 结论 SAT技术检测CT试剂盒对拭子及尿样标本敏感性及特异性均较好,适用于临床实验室对CT的检测。}     

实时荧光RT-PCR在SARS病毒定量检测中的应用

目的建立实时荧光定量PCR技术检测患者SARS病毒含量。方法通过高效样品处理方法提取血清、漱口液中SARS-CoV RNA,采用简巢式PCR和TaqMan荧光探针标记技术检测SARS-CoV核酸,阳性扩增产物制备重组质粒,重组质粒系列稀释后标定作为定量标准曲线。结果本法具有很好的特异性、重复性,灵敏度达到1×105copies/L。132例漱口液标本中,40例SARS患者SARS-CoV核酸的检出率为65%(26/40),疑似病人检出率为11.5%(6/52),40例健康人均未检出;39例SARS患者的血清标本中SARS-CoV核酸检出率为25.6%(10/39),3例疑似病人血清均未检出。对52例疑似病人漱口液阳性的6例样本的基因扩增产物进行测序确认,与BJ01 AY278488标准序列一致,检测结果与临床表现基本相符。结论本法快速、特异,适用于临床样本中SARS冠状病毒的检测,同时为滴度低、取样困难的病原体的检测探索了一种新的方法。     

检测EV71和EV-U的TaqMan-LNA探针多重荧光RT-PCR的建立

目的 建立一种针对手足口病病原体的快速准确检测方法。 方法 利用TaqMan-LNA探针建立多重荧光定量RT-PCR方法,同时检测肠道病毒71型(EV71)和肠道病毒通用型(EV-U),用含有目的序列RNA的标准品制备标准曲线,对病毒进行准确定量,同时对该方法的特异性、灵敏度、重复性进行评估。结果 用TaqMan-LNA探针多重荧光RT-PCR法检测CoxA16、CoxB2、EV71病毒和其他人类病毒RNA,证实其特异性为100%;对EV71和EV-U的检测灵敏度均达到10^{2拷贝/μl;将EV71和EV-U的RNA标准品进行重复性实验,其批内、批间变异系数分别为0.97%～2.02%和0.89%～2.13%。 结论 本方法灵敏度较高,特异性强,重复性好,适用于手足口病的临床检测。}     

实时荧光核酸恒温扩增技术和液体培养法在不孕不育人群解脲脲原体检测中的应用比较

目的比较实时荧光核酸恒温扩增技术(SAT)和液体培养法在解脲脲原体(UU)检测中的诊断价值,以选择更为准确、快速、实用的临床检测方法。方法采集本院就诊的不孕不育对象200例的分泌物2份拭子样本,分别用于液体培养法和SAT法检测。结果液体培养法阳性率为60%,SAT法阳性率为47%,培养法阳性率高于SAT法,女性UU阳性率显著高于男性,26例结果不一致中有11例培养阴性SAT阳性,15例培养阳性而SAT阴性,SAT法的敏感性(100%)和特异性(93.5%)均高于培养法。结论解脲脲原体在不孕不育人群中感染率较高,加强就诊对象UU的筛查、诊治和预防,确保优生优育。SAT技术简便、快速、精准,具有较高的临床实用性,是适合实验室诊断的检测方法 。     

肠道病毒71型RT-LAMP快速检测方法的建立及初步应用

目的建立手足口病肠道病毒71型(EV71型)逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)快速检测方法,并对其进行应用评价。方法利用软件针对EV71型病毒特异性基因6个区域设计4条LAMP引物,在普通恒温水箱内65℃保温约1 200min完成RT-LAMP扩增,扩增结果通过电泳和肉眼来判断。利用RT-LAMP和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法同时检测70份EV71型肠道阳性标本;将EV71型的RNA做一系列10倍稀释后用RT-LAMP和RT-PCR方法进行检测来比较两者敏感度。结果 EV71型出现LAMP特征性梯状条带,肉眼可以判断结果;RT-LAMP与RT-PCR方法检测100份EV71型标本的检出率比较差异无统计学意义(P0.05);RT-LAMP方法的敏感度(10.0pg/μL)与RT-PCR方法相同。结论建立了一个可以在普通恒温水箱内进行核酸扩增的EV71型RT-LAMP检测方法,初步应用证实该方法有一定的应用前景。     

荧光聚合酶链式反应与酶联免疫吸附法筛查肠道病毒71型病原感染的比较研究

目的比较肠道病毒71型（EV71）核酸与EV71-IgM抗体检测两种方法对临床诊断手足口患儿的意义。方法采用荧光定量聚合酶链式反应法对2011年4月20日-9月10日诊治的1 379例临床诊断为疑似手足口患儿进行肛拭子EV71核酸检测,同时用酶联免疫吸附法对血清标本进EV71-IgM抗体水平检测。结果 1 379例患儿EV71核酸的阳性为79例,阳性率为5.73%,EV71-IgM抗体阳性为82例,阳性率为5.95%,两者均阳性为32例。两检测方法一致率为95.2%,两者之间的阳性检出率差异无统计学意义（χ2=0.093,P=0.761）。结论应用EV71核酸及EV71-IgM抗体检测的两种联合监测,能更有效地提高手足口病患儿感染的诊断水平,对预防及对诊断手足口病有积极意义。     

2009-2010年江苏省徐州市儿童手足口病病原学检测分析

目的了解江苏省徐州地区2009-2010年儿童手足口病流行的病原学特征。方法 2009年3-8月和2010年1-12月共采集徐州儿童医院门诊、住院及常规监测的511例疑似手足口病(HFMD)儿童患者的咽拭、肛拭标本,提取病毒RNA,用实时荧光定量PCR(real-time PCR)方法同时进行肠道病毒(EV),肠道病毒71型(EV71)和柯萨奇病毒A16(Cox A16)的特异性基因检测。结果 511例疑似手足口病患儿的标本中,总肠道病毒阳性288例,占56.36%;288个肠道病毒核酸阳性病例中,EV71核酸阳性202例,Cox A16核酸阳性55例,构成比分别为70.14%和19.10%。≤5岁儿童感染的肠道病毒有EV71型、Cox A16型及非EV71非Cox A16的其他肠道病毒感染,>5岁儿童则只有EV71感染病例。结论 2009-2010年徐州地区儿童手足口病患儿以1～3岁儿童为主,其主要病原是肠道病毒EV71型,其次是Cox A16型。     

逆转录-环介导等温扩增快速检测EV71病毒

目的建立一种检测肠道病毒71型（EV71）快速、敏感的一步逆转录-环介导等温扩增（RT-LAMP）方法。方法针对EV71病毒VP2基因特异性序列的6个区域设计4条LAMP引物,建立RT-LAMP检测方法,并评价其特异性和灵敏度。结果通过GoldView染色和凝胶电泳均能观察到LAMP扩增产物的存在,且与柯萨奇病毒A16型（CA16）无交叉反应发生。所建立的RT-LAMP检测方法灵敏,最低检测限为1.0×102copies/mL。RT-LAMP检测的41份咽拭子标本中有27份出现EV71阳性反应,与荧光定量PCR结果一致。结论 RT-LAMP是一种快速、敏感、特异、准确的方法,适合用于基层医疗机构临床检测。     

2012～2013年杭州市萧山区手足口病病原谱及临床特征分析

目的：了解杭州市萧山区手足口病（H FM D ）病原谱及临床特征。方法采用荧光定量反转录聚合酶链反应,对2012年5月至2013年7月就诊的208例H FM D疑似患儿咽拭子标本（45份）和粪便标本（208份）进行病原体检测,结合患儿临床资料分析检测结果。结果208例患儿中,肠道病毒（EV ）检出率为83．17％,其中EV71、柯萨奇病毒A16（CoxA16）和其他EV亚型所占比例分别为55．49％、13．29％和31．21％;男、女性患儿EV检出率比较差异无统计学意义（P＞0．05）。5岁及其以下患儿以EV71感染为主,5岁以上患儿以其他EV亚型感染为主。HFMD患儿临床症状主要为发热伴疱疹,各种类型临床症状患儿均以EV71感染为主。粪便标本EV检出率高于咽拭子标本（P＜0．05）。结论 EV71和其他EV亚型是该地区 HFMD患儿常见病原体,CoxA16感染流行趋势有所下降。加强EV、EV71和CoxA16检测有助于 HFMD的预防和控制。     

2010—2012年浙江省余姚市手足口病的病原构成及Cox A16 VP1基因特征分析

目的了解浙江省余姚市引起手足口病的病原构成,研究Cox A16基因特征及变异情况。方法收集手足口病患者标本,用实时荧光定量聚合酶链反应(real-time PCR)检测并分型,每年选择几个样品进行Cox A16 VP1基因的扩增和核苷酸序列测定,测序结果利用DNAstar和Blast软件进行比对分析。结果 2010—2012年从1651份标本检出柯萨奇病毒A组16型(Cox A16)25.86%,肠道病毒71型(EV71)39.85%,其他肠道病毒19.38%;Cox A16 VP1蛋白氨基酸序列相似性为99.3%~100%,7株Cox A16基因分型属于B1基因亚型。结论 2010—2012年余姚市手足口病流行的主要病原体为Cox A16和EV71,流行的Cox A16属于B1基因亚型,并具有高度相似性。     

GeneXpert实时荧光定量PCR快速检测艰难梭菌的临床评估

目的对GeneXpert实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)在快速检测临床粪便标本中艰难梭菌的应用进行评估。方法采用双拭子蘸取临床未成形粪便标本,一支拭子用于GeneXpert实时荧光定量PCR检测艰难梭菌毒素基因tcdB,另一支用于常规厌氧菌培养检测;对GeneXpert实时荧光定量PCR检测结果与常规厌氧菌培养结果的一致性进行统计学分析,并计算GeneXpert实时荧光定量PCR的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值等参数。结果临床收集到141例未成形粪便标本,GeneXpert实时荧光定量PCR检出艰难梭菌毒素基因tcdB阳性42例,其中常规厌氧菌培养阳性34例,两者一致性较好(Kappa=0.775 0,P0.01),GeneXpert实时荧光定量PCR的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值分别为87.2%、92.2%、81.0%和94.9%。结论 GeneXpert实时荧光定量PCR直接检测粪便标本中的艰难梭菌具有检测快速、操作简便等优点,有重要的临床应用价值。     

感染中枢神经系统肠道病毒的分子生物学分型

目的探讨小儿肠道病毒（EV）中枢神经系统感染病毒基因VP1序列的分子分型的临床意义。方法采用逆转录聚合酶链反应（RTPCR）方法．应用通用引物和VP1段分子分型引物检测77例临床诊断为无菌性脑膜炎病儿（其中急性期63例．恢复期14例）脑脊液（CSF）的EVRNA，并对VP1分型引物扩增阳性片段进行克隆、测序及分型研究。结果77例无菌性脑膜炎病儿CSF中，采用通用引物经两次PCR在急性期共获得阳性结果47例（占急性期的74．6％），恢复期3例（占恢复期的21．4％）。将EVRNA阳性的50例标本应用分型引物经两次PCR共获得阳性结果31例（占62．0％）。随机抽取27条阳性片段进行克隆测序，测序结果通过BLAST软件与GenBankEV标准毒株进行同源性对比分析，相关序列同源性均在97％以上。结论采用分型引物扩增VP1部分序列并测序．将EV的VP1部分序列与GenBank中的EV标准毒株进行对比，根据基因序列的同源性可以对EV进行型别鉴定．为EV的分型研究提供了新的方法和思路。     

实时荧光聚合酶链反应检测患儿手足口病病原体

目的采用实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)检测患儿手足口病病原体,为防治手足口病提供依据。方法收集手足口病疑似患儿189例(按年龄分为<3岁组113例、3～5岁组76例)及39例手足口病密切接触儿童的咽拭子、疱疹液,用FQ-PCR检测标本中的肠道病毒通用型(EV)、肠道病毒71型(EV71)及柯萨奇病毒A组16型(CoxA16),并与酶联免疫吸附试验(ELISA)结果进行比对。结果 189例手足口病患儿疑似组FQ-PCR检测EV阳性141例,阳性率为74.6%,其中<3岁阳性91例、3～5岁阳性50例,3～5岁组EV检出率明显低于<3岁组(P<0.05);EV71阳性135例,CoxA16阳性65例;咽拭子标本阳性率为74.5%(120/161),疮疹液标本阳性率为82.1%(23/28);ELISA检测EV阳性76例(40.2%);39例手足口病密切接触者FQ-PCR检测EV阳性率为33.3%(13/39),ELISA检测阳性率为17.9%(7/39)。结论 FQ-PCR是一种特异性强、灵敏度高、检测较快速、效率高的方法,对检测手足口病病原体及进行相关流行病调研有重要价值。     

空肠弯曲菌 TaqMan-MGB双重探针实时荧光定量 PCR快速检测

目的　开发一种特异、灵敏的TaqMan MGB 双重探针实时荧光定量PCR 方法,用于空肠弯曲菌的快速定量检 测。方法　针对空肠弯曲菌鞭毛蛋白A 和马尿酸酶基因设计特异性引物和探针,建立一种新型TaqMan-MGB 双重探针 实时荧光定量PCR 检测空肠弯曲菌方法,对该方法的定量检测线性范围、特异度、灵敏度、重复性、稳定性进行评价, 应用该方法对临床标本中的空肠弯曲菌进行检测,同时用细菌培养、普通PCR、基因克隆和测序鉴定。结果　建立的 空肠弯曲菌TaqMan MGB 双重探针实时荧光定量PCR 检测方法专属性强,能准确检出空肠弯曲菌,而与其他细菌无交 叉反应,特异度为100%。该技术灵敏度高,能精确定量检测空肠弯曲菌DNA 线性范围达10 个数量级,最低检测限为 4 个菌落形成单位。重复性和稳定性良好,组内和组间相对标准偏差均小于1%。应用该方法成功从78 例临床标本中定 量检出28 例空肠弯曲菌阳性标本,用普通PCR 和基因克隆测序分析确认,细菌培养方法仅获得6 株存活的空肠弯曲菌。 结论　TaqMan MGB 双重探针实时荧光定量PCR 具有快速简便、可靠稳定、特异灵敏的优点,可用于临床标本中空肠 弯曲菌定量检测,值得推广应用。