裸鼹鼠成纤维细胞原代培养方法的建立

目的建立裸鼹鼠成纤维细胞的原代培养方法,研究裸鼹鼠成纤维细胞的生长特性。方法结合传统的消化培养法和组织培养法进行裸鼹鼠和小鼠成纤维细胞原代培养,CCK-8（cell countingkit）细胞计数比较研究两种物种成纤维细胞的生长速率和细胞周期。以不同浓度接种裸鼹鼠肝脏成纤维细胞,CCK-8计数细胞24h、72h、96h、144h细胞密度。结果结合消化培养法和组织培养法两种细胞原代培养方法,裸鼹鼠及小鼠成纤维细胞的生长状态良好。裸鼹鼠成纤维细胞的增殖速率显著高于小鼠成纤维细胞,处于对数生长期的细胞比例与小鼠比较,显著较高。以1．5×10^4／ml以上的浓度接种裸鼹鼠成纤维细胞能使细胞在两天内进入细胞生长对数期。结论结合消化培养法和组织培养法的原代培养方法能提高细胞原代培养的效率,裸鼹鼠成纤维细胞的增殖能力显著高于小鼠。     

2-甲氧雌二醇对低氧条件下皮肤成纤维细胞自噬水平及纤维化的影响

 目的  研究2-甲氧雌二醇(2-methoxyestradiol, 2-ME)对低氧条件下人皮肤成纤维细胞自噬水平及纤维化的影响。方法  原代培养健康人皮肤成纤维细胞并传代, 取第3～6代细胞, 在低氧(1% O2)条件下培养。使用2-ME (0、5、10、25 μmol/L)和自噬抑制剂Bafilomycin A1 (0、5、10、50 nmol/L)干预, 采用Western blot法检测I型胶原(collagen type Ⅰ)、结缔组织生长因子(connective tissue growth factor, CTGF)、低氧诱导因子-1α (hypoxia-inducible factor 1alpha, HIF-1α)、自噬标志物微管相关蛋白1轻链3 (LC3)及 P62的水平, 采用免疫荧光法检测LC3的水平。结果  成纤维细胞低氧培养24 h后, HIF-1α、Ⅰ型胶原、CTGF和LC3Ⅱ蛋白质水平显著升高, P62蛋白质水平降低, LC3免疫荧光信号显著增强。Bafilomycin A1干预组成纤维细胞I型胶原和CTGF水平降低, HIF-1α、LC3Ⅱ和P62水平升高, LC3免疫荧光信号增强, 该效应呈浓度依赖性。2-ME干预组成纤维细胞HIF-1α、Ⅰ型胶原、CTGF和LC3Ⅱ蛋白质水平降低、P62蛋白质水平升高, LC3免疫荧光信号减弱, 该效应呈浓度依赖性。结论  低氧条件下2-ME通过下调细胞自噬抑制皮肤成纤维细胞纤维化。     

RNA干扰抑制Beclin1基因对裸鼹鼠成纤维细胞增殖与凋亡的影响研究

目的 应用RNA干扰技术抑制自噬调控基因Beclin 1的表达,检测Beclin 1表达对裸鼹鼠皮肤成纤维细胞增殖与凋亡的影响以及P53、BAX、Bcl2等基因表达的影响。方法 分别检测裸鼹鼠成纤维细胞经饥饿、H2O2刺激等处理后Beclin 1的表达,然后采用设计的Beclin l基因的干扰RNA及阴性对照分别瞬时转染裸鼹鼠成纤维细胞。采用Real-time PCR及Western blot法检测沉默效果后,采用CCK-8实验检测沉默后细胞增殖活性,流式细胞仪检测细胞凋亡情况,然后采用Western blot检测相关基因蛋白表达水平。结果 饥饿与H2O2刺激均能导致Beclin 1表达水平的改变。采用gene expresso转染试剂对裸鼹鼠皮肤成纤维细胞转染效率可达到90%以上,Real-time PCR及Western Blot结果显示所设计的Beclin 1 siRNA可有效降低Beclin 1的表达。Beclin 1基因沉默后,裸鼹鼠皮肤成纤维细胞增殖抑制率均显著高于对照组,细胞早期凋亡与晚期凋亡率均显著升高,同时P53、BAX、Bcl2、LC3B、p-AKT、mTOR 等表达量下降。结论 Beclin 1在裸鼹鼠成纤维细胞抵抗饥饿、H2O2刺激等过程中表达量显著变化,同时抑制Beclin 1的表达,可抑制裸鼹鼠细胞细胞增殖,促进其凋亡,这提示Beclin 1基因对裸鼹鼠自噬、增殖、凋亡起到调控作用。     

Poly I∶C刺激对裸鼹鼠体内自噬水平的影响

目的 研究多聚肌苷-多聚胞苷酸钠盐（Poly I∶C）对裸鼹鼠自噬水平的影响.方法 成年裸鼹鼠以及C57BL/6小鼠分别随机分成Poly I∶C给药组和对照组,分别腹腔注射Poly I∶C和生理盐水.Poly I∶C给药12h后,组织切片HE染色观察小肠组织的病理变化,电镜观察细胞结构的变化,实时定量PCR检测小肠组织中炎症相关因子IL-1、ATG5的mRNA表达情况,蛋白印迹检测小肠组织中自噬相关蛋白LC3B、Beclin 1表达情况.结果 Poly I∶C给药后,裸鼹鼠小肠组织未出现显著的病理变化,但C57BL/6小鼠小肠组织腺体部出现广泛性出血;电镜观察发现,裸鼹鼠小肠组织细胞中线粒体增多、变长,自噬体数量显著增加,而小鼠组织细胞线粒体有大量的空泡化,滑面内质网扩张;实时定量PCR检测未发现组织中IL-1、ATG5 mRNA表达有显著变化;蛋白印迹检测发现,给药后裸鼹鼠组织中LC3B蛋白表达显著上调（P＜0.05）,而C57BL/6小鼠则下调（P＜0.05）.结论 Poly I∶C给药引起裸鼹鼠自噬水平上调,同时,裸鼹鼠自噬水平的上调亦可以提高机体的适应能力,进而起到抵抗Poly I∶C损伤的作用.     

氯化钴诱导低氧对裸鼹鼠肝星形细胞增殖及凋亡的影响

目的 比较研究氯化钴(CoCl2)对裸鼹鼠及C57BL/6J小鼠肝星形细胞增殖和凋亡的影响.方法 采用活细胞计数试剂盒(CCK8)法和流式细胞术分别检测不同浓度CoCl2对裸鼹鼠和小鼠肝星形细胞增殖活力以及和凋亡水平的影响.采用蛋白印迹测定CoCl2处理后裸鼹鼠肝星形细胞低氧诱导因子1α(HIF-1α)和凋亡相关蛋白(BCL2、BAX)的表达水平.结果 低浓度(50 μtmol/L)CoCl2对C57BL/6j、鼠肝星形细胞增殖活性具有明显的抑制作用,并能显著提高其凋亡率,然而同样剂量的CoCl2能够显著提高裸鼹鼠肝星形细胞的增值活性,对细胞凋亡率亦无明显影响.高剂量CoCl2(＞200 μtmol/L)虽能导致裸鼹鼠肝星形细胞增殖活力的降低,及凋亡率的升高,但裸鼹鼠肝星形细胞的变化幅度明显小于小鼠.同时CoCl2处理后,裸鼹鼠肝星形细胞HIF-1α的表达或累积显著升高(P＜0.05),BCL2/BAX比率显著上调(P＜0.05).结论 与C57BL/6J小鼠相比,裸鼹鼠肝星形细胞具有更强的抵抗CoCl2引起的化学性低氧损伤的能力.同时HIF-1α可能参与调控裸鼹鼠抵抗化学性低氧环境造成的损伤.     

RNA干扰抑制Beclin1基因对裸鼹鼠成纤维细胞增殖与凋亡的影响

目的应用RNA干扰技术抑制自噬调控基因Beclin 1的表达,检测Beclin 1表达对裸鼹鼠皮肤成纤维细胞增殖与凋亡的影响以及p53、BAX、Bcl2等基因表达的影响。方法分别检测裸鼹鼠成纤维细胞经饥饿、H₂O₂刺激等处理后Beclin 1的表达,然后采用设计的Beclin l基因的干扰RNA及阴性对照分别瞬时转染裸鼹鼠成纤维细胞。采用real-time PCR及Western blot法检测沉默效果后,采用CCK-1实验检测沉默后细胞增殖活性,流式细胞仪检测细胞凋亡情况,然后采用Western blot检测相关基因蛋白表达水平。结果饥饿与H₂O₂刺激均能导致Beclin 1表达水平的改变。采用gene expresso转染试剂对裸鼹鼠皮肤成纤维细胞转染效率可达到90%以上,real-time PCR及Western blot结果显示所设计的Beclin 1 siRNA可有效降低Beclin 1的表达。Beclin 1基因沉默后,裸鼹鼠皮肤成纤维细胞增殖抑制率均显著高于对照组,细胞早期凋亡与晚期凋亡率均显著升高,同时p53、BAX、Bcl2、LC3B、p-AKT、mTOR等表达量下降。结论Beclin 1在裸鼹鼠成纤维细胞抵抗饥饿、H₂O₂刺激等过程中表达量显著变化,同时抑制Beclin 1的表达,可抑制裸鼹鼠细胞增殖,促进其凋亡,这提示Beclin 1基因对裸鼹鼠自噬、增殖、凋亡起到调控作用。     

“Sirt1-自噬”在低氧诱导小鼠成牙骨质细胞凋亡中的作用

目的：初步研究“Sirt1-自噬”在低氧诱导小鼠成牙骨质细胞OCCM-30凋亡中的作用。方法：体外培养小鼠成牙骨质细胞,随机分为对照组、低氧组、低氧+Sirt1激活剂白藜芦醇组、低氧+自噬抑制剂3-MA组、低氧+白藜芦醇+Sirt1抑制剂ex527组、低氧+白藜芦醇+3-MA组,MDC染色观察自噬溶酶体变化;LC3Ⅱ免疫荧光检测自噬体变化;透射电镜观察自噬体;Western blot检测Sirt1、LC3Ⅱ、p62等蛋白表达;流式细胞仪检测细胞凋亡情况;不同组间结果数据采用单因素方差分析,组间采用LSD-t分析。结果：低氧组较对照组自噬溶酶体含量（P=0.000）及自噬体数量（P=0.000）明显增加,LC3Ⅱ蛋白表达明显增加（P=0.001）,p62蛋白表达明显减少（P=0.000）,细胞凋亡率增加（P=0.000）;低氧+白藜芦醇组较低氧组自噬溶酶体（P=0.019）及自噬体数量（P=0.000）、LC3Ⅱ蛋白表达（P=0.049）、Sirt1蛋白表达（P=0.000）明显增加,p62蛋白表达明显减少（P=0.000）,细胞凋亡率减少（P=0.021）;低氧+白藜芦醇+ex527组...     

ERK5对人肺成纤维细胞自噬、凋亡和增殖的调控

目的 探讨细胞外信号调节蛋白激酶-5(ERK5)对人肺成纤维细胞系(HLFs)自噬、凋亡和增殖的调控及对成纤维细胞表型转化的影响.方法 转化生长因子β1(TGF-β1)诱导HLFs建立肺纤维化细胞模型,过表达ERK5基因(ERK5)后通过Western blot检测自噬、凋亡、增殖相关因子和表型转化标志因子α-SMA的...     

裸鼹鼠与C57BL/6小鼠自噬调节的比较研究

目的 比较裸鼹鼠与小鼠的自噬调节,以期为裸鼹鼠高自噬、抗癌、衰老缓慢等生物学特性的研究提供参考.方法 利用电镜技术和蛋白印迹检测新生裸鼹鼠和C57BL/6小鼠肝脏和肺脏组织的自噬水平.自噬干扰裸鼹鼠成纤维细胞和小鼠成纤维细胞,24、48、72h CCK-8细胞计数法检测细胞的增殖情况,蛋白印迹检测各组细胞各个时间点Beclin 1的表达水平.结果 与C57BL/6小鼠比较,裸鼹鼠组织的LC3B表达显著较高.裸鼹鼠细胞对自噬抑制剂3-MA具有一定的耐药性,自噬诱导剂雷帕霉素对裸鼹鼠细胞的增殖抑制显著高于小鼠细胞.结论 裸鼹鼠组织具有高自噬水平,应对外界的自噬抑制压力时,裸鼹鼠细胞的自身调节能力明显高于C57BL/6小鼠.     

自噬在低氧诱导人肾小管上皮细胞凋亡中的作用

目的：探讨自噬在低氧诱导人肾小管上皮细胞株（HK-2）凋亡中的作用。方法：培养HK-2细胞,根据培养环境氧浓度不同分为对照组（21%O2）和低氧组（1%O2）;根据低氧培养时间不同,低氧处理细胞进一步分为：低氧6 h亚组、低氧12 h亚组、低氧18 h亚组和低氧24 h亚组。Western blot检测HK-2细胞自噬相关蛋白Beclin1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、P62和凋亡相关蛋白活化的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶（cleaved-caspase3）表达水平,流式细胞仪检测HK-2细胞凋亡情况;采用低氧诱导稳定表达GFP-LC3的HK-2细胞18 h,在荧光显微镜下观察GFP-LC3自噬小体的变化;进一步采用低氧联合自噬诱导剂雷帕霉素（ra－pamycin,RP）或自噬抑制剂巴弗洛霉素A1（bafilomycin A1,BAfA1）处理HK-2细胞,细胞分为常氧对照组、常氧+雷帕霉素/或巴弗洛霉素组、低氧对照组、低氧+雷帕霉素/或巴弗洛霉素组。Western blot检测Beclin1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、P62和cleaved-caspase3表达水平,流式细胞仪检测细胞凋亡情况。结果：与对照组（0.161±0.043）相比较,低氧12 h[（0.315±0.060）,P=0.019]、18 h[（0.586±0.063）,P=0.000]、24 h[（0.698±0.085）,P=0.000]亚组HK-2细胞cleaved-caspase3蛋白表达明显增多;低氧12 h、18 h、24 h亚组HK-2细胞凋亡率分别为（23.633±5.346）%、（25.200±4.782）%、（38.567±8.046）%,较对照组（11.800±3.966）%明显增多（P=0.036,P=0.021,P=0.000）。同时,低氧18 h、24 h亚组HK-2细胞表达Beclin1蛋白[（0.557±0.071）,（0.897±0.074）[较对照组（0.249±0.040）明显上调（P=0.001,P=0.000）;低氧6 h、12 h、18 h、24 h亚组细胞表达LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白[（1.795±0.143）,（2.873±0.078）,（3.029±0.089）,（3.735±0.059）]较对照组（1.322±0.191）明显上调（P=0.036,P=0.000,P=0.000,P=0.000）;细胞表达自噬底物P62蛋白[（0.776±0.061）,（0.602±0.119）,（0.419±0.117）,（0.384±0.068）]较对照组（0.957±0.035）明显下调（P=0.028,P=0.001,P=0.000,P=0.000）;低氧组细胞GFP-LC3斑点计数相对值为（40.667±6.028）,较对照组（18.667±5.508）明显增加（P=0.010）。雷帕霉素增加自噬后,低氧诱导的HK-2细胞凋亡（26.433±3.402）及cleaved-caspase3蛋白表达（0.265±0.066）较低氧对照组[（36.133±5.856）,（0.358±0.060）]明显减少（P=0.012,P=0.000）;巴弗洛霉素A1抑制自噬后,低氧诱导的HK-2细胞凋亡增多（49.233±3.412）及cleaved-caspase3蛋白表达（1.242±0.110）较低氧对照组[（25.933±3.650）,（0.659 ± 0.060）]明显增加（P=0.000,P=0.000）。结论：自噬在低氧诱导的HK-2细胞凋亡中起保护作用。     

裸鼹鼠不同组织中低氧相关基因的表达

目的 检测幼年与成年裸鼹鼠肺脏、肝脏和脑组织中低氧相关基因的表达水平,分析裸鼹鼠耐低氧的分子机制.方法 分别提取幼年与成年裸鼹鼠肺脏、肝脏和脑组织中mRNA,采用RT-PCR方法检测低氧相关HIF-Iα、VEGFb、FLT-1、FLT-3、Fiz1、NKRF基因的表达.结果 成年裸鼹鼠肺脏、肝脏和脑组织中HIF-1α、VEGFb、FLT-1、FLT-3、Fiz1、NKRF的表达水平显著高于幼年裸鼹鼠.结论 裸鼹鼠体内低氧相关基因在不同年龄阶段表达水平不同.     

裸鼹鼠生物学特性的研究进展

裸鼹鼠是主要产于非洲肯尼亚、埃塞俄比亚等地的啮齿类动物,它诸多奇特的生物学特性为医学研究提供了一种新型应用面较广的实验动物,尤其是其在肿瘤、衰老、老年病、心血管病的发病机制研究和止痛药的研发方面更是有着无以伦比的优势,是近些年在国内外备受关注的一种新型实验动物.     

抑癌基因p53在裸鼹鼠不同组织中表达水平的差异

目的 比较裸鼹鼠与C57BL/6J小鼠组织中抑癌基因p53表达的差异,并分析p53基因在不同年龄裸鼹鼠不同组织中表达水平的差异.方法 采用Western blotting检测新生裸鼹鼠与C57BL/6J小鼠肝脏、肺脏、脑、肾脏中p53蛋白的表达,进一步比较了不同年龄裸鼹鼠肝脏、肺脏、脑、肠道中p53蛋白的表达,同时采用RT-PCR检测了裸鼹鼠肝脏、肺脏中p53基因的转录水平.以及低氧处理裸鼹鼠皮肤成纤维细胞中p53基因的表达水平.结果 新生裸鼹鼠肝脏、肺脏、脑、肾脏组织中p53蛋白的表达低于新生C57BL/6J小鼠组织,成年裸鼹鼠肝脏、肺脏组织中p53蛋白表达量亦显著高于幼年裸鼹鼠.裸鼹鼠成纤维细胞在低氧条件下p53蛋白的表达量较高,并且随着低氧处理时间的延长,表达量进一步升高.结论 新生裸鼹鼠组织中抑癌基因p53表达水平显著低于C57BL/6J小鼠,并且p53基因随着年龄增长而发生变化.     

裸鼹鼠骨骼标本的制作及其形态学观察

目的采用传统方法制备裸鼹鼠骨骼标本,对其骨骼系统进行形态学观察。方法利用水煮法制作裸鼹鼠骨架,与C57BL／6J小鼠骨骼标本比较研究裸鼹鼠骨骼特点,并观察裸鼹鼠股骨三维结构。结果所制作的裸鼹鼠骨架完整洁净,没有骨质损伤,裸鼹鼠头骨、椎骨、肋骨、四肢骨均具有适应于穴居习性的特征。结论裸鼹鼠的骨骼具有典型的适应掘穴生活的特征。     

裸鼹鼠血液生理生化及尿常规值的测定

目的对裸鼹鼠进行血液生理指标、生化指标和尿常规值测定。方法采用全自动血细胞分析仪、生化测定仪及尿液分析仪对不同月龄、不同性别裸鼹鼠的血液学指标、生化指标值及尿常规值进行测定。结果得到了3月龄、6月龄和9周龄以及不同性别裸鼹鼠血液生理生化值与尿常规值;部分血液生理指标受性别及月龄影响较大。结论明确了裸鼹鼠部分血液生理生化及尿常规正常范围值,为今后裸鼹鼠研究奠定了基础。     

裸鼹鼠抵抗病毒感染相关机制的初步研究

目的 探讨多聚肌苷-多聚胞苷酸钠盐（PolyI∶C）诱导下裸鼹鼠肺脏、肠组织的病理变化以及低氧诱导因子（HIF-1 α）和坏死因子（NF-κB）信号通路关键基因的表达水平,分析裸鼹鼠抵抗病毒可能的分子机制.方法 裸鼹鼠分为PolyI∶C处理组、生理盐水对照组.注射12h后处死动物,肺脏和肠组织切片经HE染色后观察病理变化;提取裸鼹鼠肺脏、肠组织中mRNA,采用半定量RT-PCR方法检测基因HIF-1 α、VEGFb（血管内皮生长因子b）、VEGF c（血管内皮生长因子c）、FLT-1（血管内皮生长因子受体1）、Fiz1（血管内皮生长因子受体3结合锌指蛋白1）、NKRF（转录因子NRF蛋白）的表达水平.结果 与对照组相比,PolyI∶C处理组的肺脏和肠组织病理变化不明显,而所检测基因的表达水平几乎都显著下降,仅肠组织中的FIZ1的表达水平有所上升（P＞0.05）.结论 PolyI∶C对裸鼹鼠没有产生明显的致病作用,它不能诱导裸鼹鼠体内HIF-1α和NF-κB信号通路活化,提示裸鼹鼠可能通过抑制相关信号通路的活性促使体内受感染的靶细胞迅速凋亡,从而清除入侵的病原体.     

白藜芦醇对缺氧诱导大鼠乳鼠心肌细胞凋亡的作用

目的 观察白藜芦醇(Res)对缺氧诱导大鼠乳鼠心肌细胞凋亡的保护作用. 方法 建立体外培养大鼠乳鼠心肌细胞缺氧模型, MTT法检测心肌细胞活力,Hoechst33258染色检测心肌细胞凋亡,测定心肌细胞内总抗氧化能力(T-AOC)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性. 结果 经8h、12h、16h、24h缺氧培养后,心肌细胞抑制率分别为(22.13±3.22)%、(29.75±0.34)%、(37.43±6.42)% 和(45.47±7.32)%;心肌细胞缺氧培养24h后,呈现典型的凋亡形态学变化;心肌细胞内GSH-Px活性从(46.96±8.36)U/ml下降到(27.13±4.76) U/ml(P<0.01);心肌细胞内T-AOC为(2.68±0.31)U/ml,缺氧24h后下降到(1.28±0.27)U/ml(P<0.05).Res(25、50、75μmol/L)可剂量依赖性降低8h、12h、16h、24h缺氧培养所引起的心肌细胞抑制率升高(P<0.05,P<0.01或P<0.001);心肌细胞凋亡形态学改变逐渐改善, 50μmol/L和75μmol/L Res作用更明显;剂量依赖性升高心肌细胞内GSH-Px活性和T-AOC水平(P<0.05 或P<0.01). 结论Res可减轻缺氧诱导大鼠乳鼠心肌细胞凋亡程度.     

银杏内酯对缺氧诱导的大鼠皮层神经元早期凋亡的影响

目的：观察银杏内酯(ginkgolide,Gin)对缺氧诱导的大鼠皮层神经元凋亡的保护作用。方法：选用胎龄14～16d的SD胎鼠的大脑皮层细胞进行原代培养,建立缺氧神经元损伤模型。实验分为药物实验组(Gin组)、空白对照组、阳性对照组(MK-801),每组均进行有糖和无糖培养两种处理。应用MTT法分析细胞存活率、AnnexinV-PE双标流式细胞仪法定量分析细胞早期凋亡。结果：MTT结果显示,Gin使皮层神经元存活率明显增加,且有糖的缺氧组皮层神经元存活率优于无糖组;流式细胞仪测定结果显示,预先加入Gin(终浓度37．5μg／m1)的一组神经元的凋亡峰明显低于空白组,而无糖处理组凋亡峰均高于有糖处理组。结论：银杏内酯(37．5μg/ml)对缺氧损伤的皮层神经元具有保护作用,可拮抗缺氧条件下体外培养的皮层神经元的早期凋亡。