高性价比寡核苷酸基因表达谱芯片的制备方法

目的探讨探针长度对寡核苷酸(Oligo)基因芯片杂交信号的影响。方法以大肠杆菌基因表达信息作为实验模型,根据已有大肠杆菌全基因组芯片数据选择覆盖高、中、低杂交信号强度的20个大肠杆菌基因,针对该20个基因分别设计59-mer和70-mer长度Oligo探针,并将2种探针点制在同一张芯片中,同时设阳性对照探针和阴性对照点样液。提取大肠杆菌RNA,经过反转录、扩增、荧光标记后与芯片进行杂交反应,采用激光共聚焦扫描仪扫描芯片,利用数据分析软件提取探针的杂交信号值并进行显著性分析。结果大肠杆菌28SrRNA和18SrRNA条带清晰,无降解带出现,质量合格。芯片杂交结果显示59-mer和70-mer长度探针的杂交效率和杂交信号差异无统计学意义(P=0.9810),阳性对照探针出现阳性杂交信号,阴性对照点样液未检测到杂交信号,符合质控要求。结论59-mer长度探针可用来制备Oligo基因芯片,这不仅降低了基因芯片制作成本,而且将推动基因芯片技术更为普及的应用。     

K562细胞株表达基因探针制作的探讨

目的　研究基因芯片探针的制备方法 ,为K5 6 2细胞基因表达谱芯片的制作及其在基因表达研究中应用打下基础。　方法　以人红白血病K5 6 2细胞株为材料 ,应用一种分离显示基因的新方法即限制性显示 (RD PCR)技术 ,分离DNA片段 ,作为基因芯片探针。　结果　分离到近千个大小在 2 0 0～ 5 0 0bp的基因片段 ,认为该方法可以克服DD PCR中出现的假阳性较多的缺点 ,简单易操作 ,且利用该方法分离的基因探针 ,制备DNA微集芯片 ,同全长cDNA探针制作芯片相比 ,其探针长度小且相对均一 ,杂交动力学易于控制。　结论　限制性显示技术为基因芯片探针的制备提供了一个全新的思路 ,并将大大加速基因芯片技术及其应用研究     

通用型病毒检测芯片在三种人类致病病毒属检测中的应用

目的 研究制备对人类有致病作用的38个属的病毒寡核苷酸（oligo）基因芯片对三种人类致病病毒的检测能力。方法 应用生物信息学软件设计70-mer oligo探针，固定于玻片载体制备成基因芯片。以痘苗病毒天坛株、甲肝病毒、乙肝病毒作为检测样本，提取病毒核酸，经随机引物扩增、荧光标记，用于芯片杂交，清洗和干燥后对芯片进行扫描和数据分析。结果 芯片上oligo探针能与相应病毒的PCR扩增样品杂交，呈现阳性荧光信号。结论 建立的病毒寡核苷酸基因芯片能够检出和区分三种检测病毒，为进行未知病毒的基因芯片筛查方法的建立奠定了基础。     

运用基因芯片技术研究孕妇TORCH感染

本文利用DNA引物和探针设计软件DNAC lub和Prim er 5.0,根据从Genbank中查得的巨细胞病毒(HCMV169)、单纯疱疹病毒(HSV-Ⅰ,Ⅱ)、风疹病毒(RV)和弓形虫(TOX)基因序列分别设计16只寡核苷酸探针,长度30bp左右,合成后用简易手动点样仪M icroCaster按4×4矩阵点在氨基化玻片上,制成基因芯片;将被检测致病微生物DNA和质粒载体DNA用同一种内切酶切割、连接成“杂种”DNA,再利用载体上的通用引物进行PCR扩增和荧光染料标记扩增产物,并将该产物与DNA芯片杂交,用芯片扫描仪GeneTACTMUC4(Genom ic Solutions Inc)进行扫描,利用随机提供的软件GeneTAC IntegratorM icroarray Analysis Software Version3.30进行数据处理和分析。结果用该种方法制备的基因芯片可同时检测5种致病微生物,将用荧光定量PCR检测的阳性标本用基因芯片检测结果基本一致。     

HLA-Ⅰ类抗原的组织配型基因芯片的建立及应用

目的:应用基因芯片技术进行北方汉族人群HLA-Ⅰ类抗原中分辨度分型研究,建立稳定的HLA检测芯片.方法:采用寡核苷酸芯片分型方法,依据第十三届国际组织相容性工作会议报告及相关文献,同时考虑遗传的连锁不平衡,及强脊炎、幼年型糖尿病等与HLA密切相关的遗传病等因素,选择了中国人群基因频率较高的等位基因,根据HLA-Ⅰ类不同基因亚型的独特序列,完成了探针的设计与筛选,最后设计了122条探针(HLA-A56条,HLA-B66条)制成基因分型芯片.采用带荧光标记的引物,用合适的PCR方法扩增HLA-Ⅰ类抗原上的多态性区域,产物与芯片上探针杂交.杂交结果经荧光扫描并用特定软件分析判断阳性探针,以此确定样品基因型.结果:所有样本的HLA-Ⅰ类抗原基因分型均获成功.此中分辨度探针可分出598个Ⅰ类抗原等位基因,可检出Ⅰ类抗原特异性57个.结论:基因芯片用于HLA-Ⅰ类抗原分型可行.其分辨率高,特异性强,可用于HLA基因分型、骨髓移植、器官移植的HLA配型、与HLA有密切关系的遗传性疾病的人群筛查.     

肠道病毒71型60mer寡核苷酸探针的设计

目的设计肠道病毒71型（EV71）诊断芯片的寡核苷酸探针。方法使用NCBI获取全基因组序列,利用BLAST系统对基因序列进行比对,获取特异性序列;利用Array designer4．2对其进行寡核苷酸探针设计。结果设计出12条60mer寡核苷酸探针,为芯片的制备做准备。结论将BLAST系统和Array designer4．2软件相结合,能快速有效地设计出诊断芯片的探针.     

HLAⅠ、Ⅱ类抗原的组织配型基因芯片的建立及应用

目的应用基因芯片技术进行北方汉族人群HLAⅠ、Ⅱ类抗原中分辨度分型研究,建立稳定的HLA检测芯片。方法采用寡核苷酸芯片分型方法,选择了中国人群基因频率较高的等位基因,同时考虑遗传的连锁不平衡,根据HLA-A、HLA-B、HLA-DR、HLA-DQB、HLA-DQA不同基因亚型的独特序列,完成了探针的设计与筛选,共设计了213条探针(HLA-A 56条,HLA-B 66条,HLA-DQA 22条,HLA-DQB 38条,HLA-DR 31条)制成基因分型芯片。采用带荧光标记的引物,用合适的PCR方法扩增HLAⅠ、Ⅱ类抗原上的多态性区域,产物与芯片上探针杂交。杂交结果经荧光扫描并用特定软件分析判断,以此确定样品基因型。结果所有样本的HLAⅠ、Ⅱ类抗原基因分型均获成功。此中分辨度探针可分出598个Ⅰ类抗原等位基因,511个Ⅰ类抗原等位基因,可检出Ⅰ类抗原特异性57个,Ⅱ类抗原特异性30个。结论基因芯片用于HLAⅠ、Ⅱ类抗原分型可行。其分辨率高、特异性强,可用于HLA基因分型、骨髓移植、器官移植的HLA配型、与HLA有密切关系的遗传性疾病的人群筛查。     

Lovastatin对肝癌HepG2细胞作用后基因差异表达的初步研究

目的： 用cDNA芯片观察lovastatin作用前后HepG2细胞的差异表达基因。 方法： 20 μmol/L的lovastatin作用于HepG2细胞18 h，各提取实验组与对照组细胞总RNA，用cDNA直接标记法制备探针，进行杂交，杂交信号经扫描后，用软件分析基因表达情况。应用RT-PCR验证部分差异表达基因。 结果： Lovastatin作用后表达上调的基因有30个，表达下调的基因有11个，涉及信号转导、肿瘤免疫、细胞周期等方面，RT-PCR结果符合基因芯片结果。 结论： 用基因芯片筛选出的lovastatin作用后的肝癌细胞差异表达基因为深入研究他汀类药物的抗肿瘤机制提供重要的理论依据。     

单增李斯特菌检测基因芯片的研制与评价

目的 研制快速、特异、灵敏的检测单增李斯特菌的基因芯片.方法 选择gyrB、ISR、16S rRNA、23S rRNA、hlyA、iap和prfA作为单增李斯特菌的检测靶基因,研制一种Oligo探针基因芯片,对18个不同种属来源的已知参考生物样品进行检测和鉴定,并且采用对比试验、重复性试验、灵敏度试验和特异性试验对该芯片进行验证评估.结果 通过对比发现IDT合成的70 mer Oligo芯片探针在芯片打印与芯片检测两个方面较优.比较10、40和80 μmol/L 3个Oligo探针点样浓度,结果 显示10 μmol/L的探针点样浓度已能获得很好的芯片检测结果.单增李斯特菌检测芯片具有较好的重复性;样品检测绝对量下限为0.9 ng DNA左右.结论 Oligo基因芯片可以快速准确地检测单增李斯特菌.     

氧化还原电解脱保护DNA在片合成新方法的探讨

DNA芯片是一种新的高通量DNA分析检测技术。DNA芯片把大量已知序列探针集成在基片上 ,通过与标记的若干靶核苷酸序列杂交 ,可以对生物细胞或组织中大量的基因信息进行检测和分析。DNA芯片的制备方法大致可以分为点样法和在片合成法。本文初步探索了以氧化还原电解脱保护法为特征的电助基因芯片制备方法 ,获得了一些有意义的结果     

结核杆菌检测基因芯片的制备研究

目的建立结核杆菌检测基因芯片的制备技术.方法靶基因的制备、标记,用点样仪点于玻片介质上,并经过点样后处理制成基因芯片,用扫描仪测定处理前后芯片上荧光强度的变化,计算DNA固定率,分别设计了不同的玻片,不同的点液,不同的点样后处理方法的固定率的测定.结果对结核杆菌检测基因芯片制备的条件和方法优化实验表明,用醛基修饰玻片作为介质,点样液用DMSO溶液作为点样液,点样后芯片处理,以水合1h再干燥30min为佳.结论本研究建立的结核杆菌检测基因芯片的制备技术有较高的效率和可靠的实用性能.     

氧化还原电解脱保护DNA在片合成新方法的探讨

DNA芯片是一种新的高通量DNA分析检测技术。DNA芯片把大量已知序列探针集成在基片上，通过与标记的若干靶核苷酸序列杂交，可以对生物细胞或组织中大量的基因信息进行检测和分析。DNA芯片的制备方法大致可以分为点样法和在片合成法。本文初步探索了以氧化还原电解脱保护法为特征的电助基因芯片制备方法，获得了一些有意义的结果。     

CYP2C19显色型基因芯片的研究

目的提供一种基于显色原理的CYP2C19基因芯片诊断方法。方法采用碱性磷酸酶促显色原理设计制备固定有*2、*3检测探针的CYP2C19基因芯片,通过EDTA抗凝外周血样本提取基因组DNA,PCR扩增CYP2C19*2、*3突变片段并与芯片在43℃杂交,经洗涤、显色后扫描获取图像,经软件分析输出基因型并对基因芯片性能进行系统评价。结果 CYP2C19显色型基因芯片检出限为20 ng基因组DNA;与基因组DNA同等浓度鱼精DNA检测信号阴性;用*2/*2、*1/*3基因型样本重复检测10次,结果一致;常见浓度的甘油三酯、总胆固醇、胆红素和完全溶血对测定没有影响。临床三家医院临检实验室对1000例临床样本的检测与双向测序方法比对验证,结果一致。结论为高通量基因诊断产品的产业化提供了一种实用的技术选择。     

定位基因芯片探针点的圆心度方法

基因芯片扫描图像中探针点的定位是芯片信息提取的基础，定位准确性与否直接关系到探针点信息提取的正确性。本文提出一种利用圆心度函数定位基因芯片扫描图像中探针点位置的方法，圆心度函数是一种利用边缘信息来检测巳知半径圆形区域的有效方法，不仅可以突出圆形区域的圆心位置。而且抗噪声能力强。基于圆心度分布图和芯片的空间结构，本文提出了定位探针点的具体方法，实际芯片探针点定位实验验证了本方法的有效性。     

cDNA基因芯片数据分析软件的研发进展

数据分析与挖掘是基因芯片研究的关键和难点,而软件是数据分析方法实现的主要手段。我们从以下几个方面对cDNA基因芯片分析软件进行了综述。首先介绍了芯片数据的获取及分析的软件,然后概述了不同统计软件在芯片数据分析中的应用,并详细介绍几种常用的芯片数据分析软件,最后简述了基因网络分析及数据挖掘方面的软件。     

利用光波导模式光谱生物传感器研究二级结构对固-液界面DNA杂交动力学的影响

目的探讨探针和靶分子二级结构对基因芯片杂交过程的影响,并完善基因芯片设计方法,提高基因芯片的重复性和特异性。方法应用二级结构分析软件Mfold设计3对25-mer完全互补的具有不同二级结构的探针和靶分子（P0T0、P3T3、P4T4）及1对尾端有2个碱基错配的探针和靶分子（P4T3）。制备醛基化传感器芯片,将终浓度为1、2、5、10、20μmol／L的探针分别固定在芯片上,与浓度为5μmol／L的N,N＇-对羧苄基吲哚三菁（Cy5）标记靶分子杂交,荧光图像扫描仪检测确定最佳杂交探针浓度;以最佳探针浓度构建芯片,分别与终浓度为0．1、0．2、0．5、1．0、2．0、5．0lamol／L的Cy5标记靶分子杂交,荧光图像扫描仪检测确定最佳杂交靶分子浓度;同时用光波导模式光谱生物传感器（OWLS）实时监测其杂交过程。以0．4％SDS和0．1％NaOH分别处理杂交后芯片10、20、30、60min,荧光图像扫描仪检测芯片再生稳定性。控制靶分子进样速度和杂交时间分别为15μl／h、7h和180μl／h、0．5h,OWLS测定杂交复合物质量、杂交效率和反应速率。结果荧光图像扫描结果显示,最佳杂交探针和靶分子浓度分别为10、1μmol／L,传感器芯片构建成功且具有再生稳定性。15μl／h、7h和1800a／h、0．5h条件下,P0T0、P3T3、P4T4、P4T3杂交复合物的质量（ng／cm^2）分别为45和30、43和20、40和13、42和18;杂交效率（％）分别为40．9和27．3、39．1和18．2、36．4和11．8、38．2和16．4;杂交7h时的反应速率常数[K,10’L／（m01．s）]值分别为0．465、0．247、0．081、0．247。     

电子基因微芯片在医学研究中的应用

<正>基因芯片(DNAmicrochip)也称DNA微阵列(DNAmicroarray),是把大量基因探针或基因片段按特定的排列方式固定在芯片载体上,形成致密有序的DNA分子点阵,按碱基互补配对原则与样品DNA杂交,然后通过计算机进行解读和分析获取大量信息,实现对生物样品高效、平行地检测或医学诊断。由于具有高通量、快捷、便宜等优点,基因芯片在各个领域起着越来越重要的作用。芯片可以根据探针的性质、固体表面的支撑物、探针寻址或目标检测方法的不同分为原位合成寡核苷酸微阵列(situ-synthesizedoligonucleotide microarray)、高密度微珠阵列(high-densitybead arrays)、电子微芯片(electronic microarrays)等。近年     

腹泻相关致病菌基因芯片的制备及应用

目的确定引起人类感染性腹泻的11种病原微生物,并制备芯片用于检测门诊腹泻患者粪便标本中的致病菌。方法根据本院2009年1月至2012年12月期间腹泻门诊的粪便病原菌检测数据,采用生物信息学的方法,收集11种病原菌的所有基因序列,设计引物及探针,优化并制备芯片,PCR扩增杂交并对杂交结果进行分析。用该芯片对本院保存的163个肠道致病菌临床分离株进行鉴定来评价芯片的特异性,用芯片来检测掺有不同浓度沙门氏菌的粪便标本评价芯片的灵敏度。同时收集2010年6月至2013年3月在本院就诊的1052份腹泻患者粪便标本,平行进行PCR扩增、细菌培养、基因芯片检测,比较不同检测方法的阳性率。结果成功制备了腹泻相关11种致病菌检测芯片。应用制备的芯片检测了163个临床分离株,准确率达100％。与PCR方法比较,基因芯片检测沙门氏菌的灵敏度达102CFU／ml,比PCR法检测灵敏度高10倍。用该芯片对临床1052份腹泻患者腹泻标本进行检测,与传统的培养法及PCR法比较,有较高的阳性检出率,达36％,比常规细菌培养阳性率高13％（X2=2．28,P〈0．05）,比PCR检出率高4％（X2=5．16,P〉0．05）。结论成功制备11种腹泻相关致病菌基因芯片,能同时对11种腹泻致病菌进行检测,有较好的特异性和灵敏度,有更高的阳性率,可以用于临床检测。     

胰腺癌相关基因寡核苷酸芯片的制备和初步应用(英文)

目的：研究胰腺癌相关基因寡核苷酸芯片的构建及其在检测胰腺癌基因表达谱方面的应用。方法：有目的地筛选胰腺癌相关基因，采用合成后点样的方法将合成的寡核苷酸探针点于同型双功能偶联剂（APS-PDC）包被的基片上，制成寡核苷酸基因芯片。Trizol法抽提组织总RNA，并用Qiagen Rneasy kit 进一步纯化。在cDNA第1链合成过程中，通过反转录酶将CyDye标记核苷酸直接渗入到cDNA中制备荧光探针，其中用Cy3-dCTP标记胰腺癌组织，Cy5-dCTP标记正常胰腺组织。将荧光标记探针定量后与芯片杂交16-18 h。用Agilent 扫描仪进行扫描，Imagene3.0软件（Biodiscovery,Inc.）图像分析，计算2种荧光Cy3 与Cy5信号强度的比值。挑选差异基因CDC25B和TUSC3进行荧光定量PUR（Sybrgreen方法）验证，以B-actin基因为内参照基因，PCR产物的定量方法采用比较Ct法。结果：芯片杂交扫描图像信号清晰，具有较低的整体背景和较高的信噪比，各阳性质控点信号均匀一致，阴性质控点和空白点信号低。与正常组织相比，胰腺癌组织中差异表达基因24条，占全部基因的25.5%，其中上调基因17条（占18.1%），下调基因7条（占7.4%）。荧光定量PCR验证，CDC25B和TUSC3基因在胰腺癌中的表达分别为上调和下调，其表达趋势与芯片实验的结果一致。结论：制备的胰腺癌相关基因芯片，可同时、并行检测多种胰腺癌相关基因的表达改变，具有一定的特异性和灵敏性。胰腺癌组织与正常胰腺组织相比，基因表达谱具有明显的差异，为进一步研究胰腺癌的发病机理和早期诊断提供了有用的信息。     

应用基因芯片检测喉鳞状细胞癌甲醛固定石蜡包埋组织microRNA表达谱

目的 建立以甲醛固定石蜡包埋组织为材料、基于基因芯片技术的microRNA(miRNA)表达谱的分析方法 ;筛选与喉鳞状细胞癌(简称喉癌)生物学特征密切相关的差异表达miRNA.方法 从喉癌甲醛固定石蜡包埋组织中制备总RNA,经质量鉴定后进行荧光标记.采用Agilent公司的容纳723条人类miRNA探针的基因芯片完成杂交实验,以获得喉癌的miRNA表达谱.以GeneSpring GX和R-Project软件处理分析基因芯片实验数据,筛选与喉癌转移相关的差异表达miRNA.结果 从24例甲醛固定石蜡包埋组织标本中获得了符合基因芯片实验质量标准的RNA样品,并完成了基因芯片杂交及数据分析.从中共鉴定到319个miRNA,有96个miRNA在24例喉癌中均有表达,其中与淋巴结转移密切相关的(检错率<0.05)差异表达miRNA有5个,分别为miR-23a* 、miR-28-5p、miR-15a、miR-16和miR-425.结论 甲醛固定石蜡包埋组织可以提供符合基因芯片分析质量要求的miRNA,是研究miRNA的重要样品资源.从喉癌的miRNA表达谱中筛选出的转移相关差异表达miRNA(miR-23a*、miR-28-5p、miR-15a、miR-16和miR-425)有可能成为评估喉癌转移风险的新型分子标志.