肿瘤坏死因子受体（TNFR）基因转移增强TNF对肿瘤细胞的杀伤作用

目的：探讨TNFR基因转移对肿瘤细胞表面TNFR表达量的影响，观察其对TNF杀伤膀胱肿瘤细胞作用的影响。方法：建立TNFR的逆转录病毒表达载体，通过转染包装细胞PA317产生完整病毒颗粒；膀胱癌BIU－87细胞经病毒感染后，检测细胞表面TNFR数量及TNF对其杀伤作用的变化。结果：TNFR基因转移前膀胱癌BIU－87细胞表面与TNF结合的位点数量平均为912个／细胞，经病毒感染后，细胞表面与TNF结合的位点数量平均为2872个／细胞（P＜0．05）；TNF对经病毒感染的BIU－87细胞的杀伤作用较未经病毒感染者有明显增强（P＜0．05）。结论：以逆转录病毒为载体的基因转移方法可以提高肿瘤细胞表面TNFR的表达量，从而增强TNF对肿瘤细胞的杀伤作用。     

膀胱肿瘤细胞膜肿瘤坏死因子受体测定及其意义

目的探讨膀胱肿瘤细胞膜肿瘤坏死因子受体（ＴＮＦ－Ｒ）的表达情况。方法用放射配基结合分析法测定了体外培养的膀胱癌ＢＩＵ－８７细胞膜ＴＮＦ－Ｒ。结果膀胱肿瘤细胞膜存在ＴＮＦ－Ｒ，当肿瘤细胞１．６×１０６个、ｐＨ７．０～８．０、４℃条件下反应１２０ｍｉｎ时，１２５Ｉ－ＴＮＦ与受体结合反应良好，受体解离常数为０．１５ｎｍｏｌ／Ｌ，数目为８６９个结合位点／细胞。结论由于肿瘤细胞存在ＴＮＦ－Ｒ，因此对膀胱肿瘤进行免疫治疗时，ＴＮＦ可以和受体结合发挥生物学效应以杀灭肿瘤细胞     

转hGM－CSF基因人膀胱癌细胞株的建立及其生物学特性

采用逆转录病毒载体将ｈＧＭ－ＣＳＦ基因导入人膀胱癌细胞株ＢＩＵ－８７细胞中，建立转基因细胞株ＢＩＵ／ＧＭ。经ＰＣＲ－ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｌｏｔ杂交证实ＧＭ－ＣＳＦ基因已整合到ＢＩＵ／ＧＭ细胞基因组中。经流式细胞仪细胞ＤＮＡ周期分析表明，转基因前后ＢＩＵ－８７细胞增殖状态无变化。免疫荧光检测发现ＧＭ－ＣＳＦ基因导入及表达不能促进ＢＩＵ－８７细胞表面ＨＬＡ－ＡＢＣ、ＤＲ、ＤＱ抗原的表达。转基因细胞经６０Ｇｙ／ｓＸ线灭活后，丧失增殖能力，但能维持一定水平的ＧＭ－ＣＳＦ分泌活性达２周。本文为进行转基因瘤苗的深入研究奠定了初步基础。     

干扰素及白细胞介素-2对膀胱肿瘤细胞膜肿瘤坏死因子受体表达的影响和意义

目的研究干扰素（ＩＦＮ）和白细胞介素－２（ＩＬ－２）对膀胱肿瘤细胞膜上肿瘤坏死因子受体（ＴＮＦ－Ｒ）的调节作用。方法用放射配基结合分析法检测了ＩＬ－２及ＩＦＮα和γ分别作用前后膀胱癌ＢＩＵ－８７细胞膜ＴＮＦ－Ｒ的变化。结果ＴＮＦ－Ｒ的特异性结合量随着ＩＦＮ与ＩＬ－２的浓度和作用时间的不同而有不同程度的增加。结论用ＩＬ－２、ＩＦＮ免疫治疗后可以诱导膀胱肿瘤细胞膜ＴＮＦ－Ｒ表达增加,使体液内高表达的ＩＮＦ可以与肿瘤细胞膜受体更好地结合以发挥生物学效应,从而杀灭肿瘤细胞。     

携带HuIFN－β cDNA的重组逆转录病毒载体的构建及在人肝癌细胞中的特异表达

目的：研究逆转录病毒介导干扰素基因转移及在肝癌细胞中特异表达作用。方法：将人β干扰素（ＨｕＩＦＮ－β）ｃＤＮＡ克隆到逆转录病毒载体ＰＬ位点，分别构建了转录受ＳＶ４０启动子驱动的载体ＭＮＳＩＦＮＢ和转录受人甲胎蛋白增强子（ＡＦＰｅ）调控的载体ＭＮＡＩＦＮＢ。用脂质体转染法将载体分别转导ＰＡ３１７包装细胞，质粒转染率为每１０５ＰＡ３１７细胞（４～２５）×１０３ＣＦＵ／μｇ，病毒感染率（４．５～５００）×１０４ＣＦＵ／ｍｌ。重组病毒在４μｇ／ｍｌｐｏｌｙｂｒｅｎｅ存在条件下感染人肝癌、肾癌及黑色素瘤细胞。结果：ＮｅｏＲ克隆ＲＮＡ斑点杂交及ＩＦＮ活性分析证明，人ＡＦＰｅ可促进异源启动子启动ＨｕＩＦＮ－β基因在合成ＡＦＰ的人肝癌细胞中高效特异转录和表达。结论：ＡＦＰ＂持家基因＂顺式调控序列在合成ＡＦＰ的肝癌细胞中特异驱动ＩＦＮ－β基因表达，该研究为肝癌特异性免疫基因治疗提供了资料。     

肿瘤坏死因子受体基因转移增强TNF杀伤肿瘤细胞作用的研究

目的 :探讨肿瘤坏死因子受体 (TNFR)基因转移对肿瘤细胞表面 TNFR表达量的影响 ,进而观察其对TNF杀伤肿瘤细胞作用的影响。　方法 :建立 TNFR的逆转录病毒表达载体 ,通过转染包装细胞 PA 317产生完整病毒颗粒 ;人前列腺癌细胞株 PC- 3m和小鼠 Renca肾腺癌细胞株经病毒感染后 ,检测其细胞表面 TNFR数量及TNF在体内外对其杀伤作用的变化。　结果 :TNFR基因转移前后 PC- 3m细胞表面与 TNF结合的位点数量分别为 2 912个 /细胞和 8872个 /细胞 (P<0 .0 5 ) ,Renca细胞表面与 TNF结合的位点数分别为 783个 /细胞和 36 78个 /细胞 (P<0 .0 5 )。 TNFR基因转染后 ,TNF在裸鼠体内对 PC- 3m和 Renca的肿瘤抑制率分别增强 1.8和 2 .1倍。　结论 :以逆转录病毒为载体的基因转移方法 ,可以提高肿瘤细胞表面 TNFR的表达量 ,从而增强 TNF对肿瘤细胞的体外杀伤作用和体内抑制作用     

t al Department of Pathology, Qingdao Medical College, Qingdao 2660

①目的探讨肿瘤坏死因子（ＴＮＦα）对肿瘤细胞的杀伤作用,并观察重组人干扰素（ＩＦＮγ）对ＴＮＦα细胞毒性的协同作用。②方法采用非同位素细胞毒试验,对３个子宫颈来源的细胞系进行传代培养,与ＴＮＦα接触后检测其杀伤细胞情况。③结果ＴＮＦα对子宫颈良、恶性肿瘤细胞均呈微弱的细胞毒作用,而ＩＦＮγ与ＴＮＦα联用则对宫颈癌来源的细胞系具有明显杀伤作用（Ｆ＝１１．２５,Ｐ＜０．０１）,对源于正常、良性肿瘤的细胞系则无明显作用（Ｆ＝１．１５,１．２３,Ｐ＞０．０５）。④结论ＴＮＦα对肿瘤细胞具有杀伤作用,且ＩＦＮγ能促进这种杀伤作用     

原发性肝癌基因治疗研究——含人TNF基因重组逆转录病毒转移系…

将人ＴＮＦα基因克隆到重组逆转录病毒载体ｐＲＵＦｎｅｏ，构建了含人ＴＮＦ基因重组逆转录病毒载本ＲＵＦ－ＴＮＦ。将ＲＵＦ－ＴＮＦ转染包装细胞Ｆｌｙ Ａ１３，经药物筛选获得稳定分泌含人ＴＮＦ基因重组逆转录病毒的细胞株ＦｌｙＲＵＦＮ１４。ＦｌｙＲＵＦＮ１４产生的病毒上清液能直接转染靶细胞Ｓａｏｓ－２。本研究建立的逆转录病毒介导的ＴＮＦ基因转移系统为肝癌及其他恶性肿瘤的基因治疗提供了条件。     

干扰素及白细胞介素—2对膀胱肿瘤细胞膜肿瘤坏死因子受体表达 …

研究干扰素和白细胞介素－２对膀胱肿瘤膜上肿瘤坏死因子受体的调节作用。方法用放射配基结合分析法检测了ＩＬ－２及ＩＦＮａ和γ分别作用前后膀胱癌ＢＩＵ－８７细胞膜ＴＮＦ－Ｒ的变化。     

外源p53基因和TNFa基因转导对膀胱癌细胞在裸鼠体内的生长抑制

通过逆转录病毒载体将野生型ｐ５３基因、ＴＮＦａ基因单独或与ＩＬ－６基因连接（ＴＮＦＩＬ－６）分别导入膀胱癌细胞株ＥＪ和ＢＩＵ－８７．裸鼠致瘤试验和体外生长实验显示：ｐ５３基因转染组细胞接种裸鼠后９周无肿瘤生长，体外生长速率明显降低，Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交显示Ｈ－ｒａｓ基因表达明显低于非转染组细胞，ＴＮＰａ基因和ＴＮ刊ＩＬ－６基因转染组裸鼠瘤体积明显小于对照组，体外生长速率与对照组无显著差别，两种细胞因子对Ｈ－ｒａｓ基因表达无影响。     

膀胱移行细胞癌中粘蛋白MUC1的表达与肿瘤浸润性树突状细胞的分布

目的 研究膀胱移行细胞癌中粘蛋白MUC1表达和肿瘤浸润性树突状细胞(TIDC)分布的变化,探讨二者在膀胱癌侵袭、转移及化疗耐药过程中的作用。方法 采用免疫组织化学SP法检测MUC1和TIDC在膀胱移行细胞癌的表达和定位及MUC1在T-24细胞、BIU-87和耐药株BIU-87/A中的表达。应用流式细胞仪检测BIU-87、耐药株BIU-87/A及T-24细胞在阿霉素、长春新碱、顺铂3种化疗药物作用48h后的凋亡率。结果 MUC1在各期膀胱移行细胞癌中均表达,表达模式各有特点,MUC1的染色分型同肿瘤的病理分级和临床分期密切相关(P<0.001)。DC的数量同肿瘤病理分级呈负相关,随着病理分级的升高阳性细胞数明显减少(P<0.005)。MUC1在BIU-87、T-24细胞膜、胞浆中均有浅棕色弱阳性表达,在BIU-87/A的胞膜、胞浆中均有深棕色强阳性表达,两者细胞平均光密度值差异有显著性(P<0.01)。流式细胞仪检测BIU-87、T-24和BIU-87/A的自发凋亡率分别为1.15%、1.40%、0.90%,在阿霉素、长春新碱、顺铂3种化疗药物作用48h后,BIU-87的凋亡率分别为45.69%、47.70%、44.50%,T-24的凋亡率分别为43.79%、46.17%、44.50%,均有明显升高(P<0.01),但两种细胞之间及3种化疗药之间差异无显著性(P>0.05)。耐药株BIU-87/A在阿霉素、长春新碱作用48h后的凋亡率分别为19.88%、21.41%,均明显低于亲本细胞株BIU-87(P<0.05)。结论 MUC1的表达模式和TIDC数量的监测可以作为膀胱移行细胞癌恶性程度和预后的判断指标。TIDC的减少可能是膀胱癌免疫逃逸和耐受的重要环节,肿瘤细胞表面高密度的MUC1可能参与膀胱移行细胞癌侵袭转移和化疗耐药机制。     

磁场对荷瘤小鼠TNF及TNFR水平的影响

目的　观察磁场对荷瘤鼠瘤组织内肿瘤坏死因子 (TNF)及肿瘤坏死因子受体 (TNFR)的影响。方法　采用磁场照射荷瘤小鼠瘤区。结果　磁疗组小鼠体内TNF活性明显增强 ,TNFR表达量增多 ,与非磁疗组相比 ,差异有高度显著性 (P <0 .0 1)。结论　磁场具有增强荷瘤小鼠TNF活性并促进TNFR表达的作用。     

膀胱移行细胞癌中粘蛋白MUC1的表达与肿瘤浸润性树突状细胞的分布

目的研究膀胱移行细胞癌中粘蛋白MUC1表达和肿瘤浸润性树突状细胞（TIDC）分布的变化，探讨二者在膀胱癌侵袭、转移及化疗耐药过程中的作用。方法采用免疫组织化学SP法检测MUC1和TIDC在膀胱移行细胞癌的表达和定位及MUC1在T-24细胞、BIU-87和耐药株BIU-87／A中的表达。应用流式细胞仪检测BIU-87、耐药株BIU-87／A及T-24细胞在阿霉素、长春新碱、顺铂3种化疗药物作用48h后的凋亡率：结果MUC1在各期膀胱移行细胞癌中均表达，表达模式各有特点，MUC1的染色分型同肿瘤的病理分级和临床分期密切相关（P〈0．001）。DC的数量同肿瘤病理分级呈负相关．随着病理分级的升高阳性细胞数明显减少（P〈0．005）。MUC1存BIU-87、T-24细胞膜、胞浆中均有浅棕色弱阳性表达，在BIU-87／A的胞膜、胞浆中均有深棕色强阳性表达，两者细胞平均光密度值差异有显著性（P〈0．01）。流式细胞仪检测BIU-87、T-24和BIU-87／A的自发凋亡率分别为1．15％、1．40％、0．90％，在阿霉素、长春新碱、顺铂3种化疗药物作用48h后．BIU-87的凋亡率分别为45．69％、47．70％、44．50％，T-24的凋亡率分别为43．79％、46．17％、44．50％，均有明显升高（P〈0．01），但两种细胞之间及3种化疗药之间差异无显著性（P〉0．05）。耐药株BIU-87／A在阿霉素、长春新碱作用48h后的凋亡率分别为19．88％、21．41％．均明显低于亲本细胞株BIU-87（P〈0．05）。结论MUC1的表达模式和TIDC数量的监测可以作为膀胱移行细胞癌恶性程度和预后的判断指标。TIDC的减少可能是膀胱癌免疫逃逸和耐受的重要环节，肿瘤细胞表面高密度的MUC1可能参与膀胱移行细胞癌侵袭转移和化疗耐药机制。     

端粒酶反义寡核苷酸对膀胱癌端粒酶活性及细胞增殖的影响

目的 :探讨端粒酶反义核苷酸对膀胱癌的治疗作用。方法 :以端粒酶 RNA模板区为靶点 ,不同剂量的序列为 TAGGGTTAGACAA的硫代磷酸修饰的反义寡核苷酸 ( PS- ASON)作为实验组 ( A、B、C) ,以硫代磷酸修饰 1 3个核苷酸的随机引物作为对照组 ( D) ,仅加入培养基作为空白对照组 ( E) ,与人膀胱癌细胞株 BIU87细胞共同孵育 ,TRAP- ELISA方法检测端粒酶活性变化 ,计数1～ 30 d细胞数 ,计算细胞倍增时间 ,MTT法测定 ASON对细胞的抑制率。结果 :2 5例膀胱癌组织中 ,2 4例 ( 96% )表达端粒酶活性 ,4例癌旁组织无端粒酶活性表达。与随机引物及空白对照组比较 ,实验组的 ASON能明显降低端粒酶活性 ,减少细胞增殖数目 ,增加抑制率及延长倍增时间 ,并显示剂量的依赖性 ( P<0 .0 1 )。结论 :以端粒酶 RNA模板区为靶点的反义寡核苷酸引起膀胱癌 BIU87细胞端粒酶活性下降 ,增殖抑制 ,引起细胞退化 ,对膀胱癌的治疗有潜在的意义。     

健康高龄者外周血NK细胞活性及肿瘤坏死因子分泌的研究

目的 为探讨健康高龄者外周血自然杀伤细胞的活性及经诱导活化后肿瘤坏死因子（tumor necrotic fac-tor,TNF）的分泌。方法 采用乳酸脱氢酶释放法,以K562细胞和SGC-7901细胞为靶细胞测定外周血NK细胞的活性;白介素2（IL-2）与脂多糖诱导活化后的TNF的分泌活性测定以L-929细胞作为靶细胞,用MTT法测定其存活率表示。结果 与健康中青年组比较,高龄组人群的NK细胞对K562和SGC-7901细胞的杀伤活性均降低,但差异无统计学意义（P〉0.05）,经IL-2与LPS诱导的外周血淋巴细胞分泌的TNF活性均增高,差别有显著性（P〈0.01和P〈0.05）。结论 高龄组人群的外周血淋巴细胞经诱导分泌的TNF活力增高可能补偿了部份免疫功能的下降。     

He—Ne激光照射对SP2／0骨髓瘤小鼠TNF及TNFR水平的影响

目的：观察激光照射对瘤鼠瘤组织内肿瘤坏死因子（ＴＮＦ）及肿瘤坏死因子受体（ＴＮＦＲ）的影响。方法：采用麦联免疫吸附试验及受体吸附试验分析测定瘤组织内ＴＮＦ及ＴＮＦＲ和可溶性ＴＮＦＲ（ＳＴＮＦＲ）的含量。结果：激光照射组小鼠瘤组织内ＴＮＦ活性明显增强,ＴＮＦＲ表达量增多,瘤细胞增殖率降低,与对照组相比有高度显著性差异（Ｐ〈０．０１）。结论：氦氖激光具有增强带瘤小鼠机体ＴＮＦ活性并促进ＴＮＦＲ表达的作     

生存素反义寡核苷酸诱导膀胱癌细胞凋亡及增强其化疗敏感性

目的探讨生存素反义寡核苷酸（生存素-ASODN）对化疗药多西紫杉醇（泰索帝）诱导膀胱癌细胞系BIU87细胞凋亡的影响。方法将已构建成功的生存素-ASODN真核表达载体pcDNA3-SWas通过脂质体介导转染膀胱癌细胞系BIU87,并筛选转染成功的阳性克隆;采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）法检测其生存素mRNA表达;锥虫蓝拒染法观察生存素-ASODN与泰索帝联合应用对BIU87细胞生存的影响;细胞计数和四甲基偶氮唑盐（MTT）试验测定转染细胞对泰索帝敏感性;琼脂糖凝胶电泳分析细胞凋亡DNA断裂情况;核染色检测凋亡细胞的细胞核的变化;流式细胞术检测细胞凋亡率。结果转染生存素-ASODN真核表达载体pcDNA3-SWas的BIU87-SVVas细胞生存素mRNA表达水平下降、细胞增殖明显受抑,与转染pcDNA3空载体BIU87-neo细胞、未转染载体的BIU87细胞进行比较,差异均有统计学意义（均P〈0．05）;经琼脂糖凝胶电泳,BIU87-SVVa8细胞可见到DNA梯形条带,而其他对照组未见到;与BIU87-neo、BIU87细胞相比,BIU87-SVVas细胞的细胞核呈致密浓染;加入泰索帝的BIU87-SVVas细胞组的凋亡率大幅度增加。结论生存素-ASODN可促进泰索帝诱导BIUg7细胞凋亡及增加其对泰索帝的敏感性,为膀胱癌的生物学治疗研究奠定了实验基础。     

肿瘤坏死因子-α对少突胶质前体细胞的影响及其机制的研究

目的：探讨肿瘤坏死因子‐α（T N F‐α）对少突胶质前体细胞（O PC ）的作用及机制,为脑室周围白质软化（PV L ）的治疗提供策略。方法将分离纯化的OPC分为空白对照组、TNF‐α组、肿瘤坏死因子受体1（TNFR1）抗体组,将50 ng／mL TNF‐α作用于TNF‐α组、TNFR1抗体组,免疫荧光化学检测OPC的分化情况,四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测3组细胞的相对活力, RT‐PCR检测细胞TNFR1的mRNA水平的表达情况。结果与空白对照组和TNFR1抗体组相比,TNF‐α组OPC的细胞活力明显下降（P＜0．05）,并且不能沿着少突胶质谱系细胞进行分化,即分化为原少突胶质细胞。TNF‐α组TNFR1的mRNA表达明显的上调,空白对照组和TNFR1抗体组的mRNA表达无明显的变化。结论 TNF‐α主要通过 TNFR1引起OPC的凋亡,抑制O PC分化。     

化毒丹对小鼠迟发型超敏反应的影响

目的：研究化毒丹对小鼠迟发型超敏反应（DTH）的影响。方法：50只Balb／c鼠随机分为正常对照组、DTH模型组及化毒丹高剂量组（1．0mg／g）、中剂量组（0．5mg／g）和低剂量组（0．25mg／g）。除空白组小鼠的左侧足垫注射生理盐水0．05ml外，其余各组小鼠左侧足垫注射10％绵羊红细胞的生理盐水悬液0．05ml，同时，对化毒丹高、中、低剂量组小鼠给予0．5ml化毒丹灌胃，连续灌胃5d后，用0．05ml 10％SRBC．NS攻击小鼠右侧足垫（空白组注射0．5ml生理盐水），24h后测量小鼠足垫肿胀程度。采用ELISA法检测血清中肿瘤坏死因子（TNF）水平，采用噻唑兰（MTT）法检测淋巴细胞的活性。结果：与正常对照组比较，DTH模型组及化毒丹高、中、低剂量组小鼠足垫肿胀程度明显增加（P〈0．05～0．01），与DTH模型组相比较，化毒丹各剂量组小鼠足垫肿胀程度明显增加（P〈0．001）；与正常对照组比较，DTH模型组、化毒丹高剂量组小鼠血清中TNF水平明显降低（P〈0．05～0．01），与DTH模型组相比较，化毒丹中、低剂量组小鼠血清中TNF水平明显增加（P〈0．001）；与正常对照组比较，化毒丹中剂量组小鼠脾脏淋巴细胞活性明显降低（P〈0．05），化毒丹低剂量组小鼠脾脏淋巴细胞活性明显增加（P〈0．05）。结论：化毒丹对小鼠DTH具有双向调节作用。