特征肽段检测技术用于胶类药材专属性鉴别方法研究

 目的 找出龟甲胶、鹿角胶、阿胶、黄明胶、新阿胶5种胶类药材的特征肽段,从而建立专属性的鉴别方法。方法 用胰蛋白酶针对样品进行酶解,采用液质联用多肽识别技术和数据处理软件对蛋白质酶解后的胶类样品(主含多肽混合物)进行分析处理,进行特征肽段的寻找;采用串联四级杆质谱的多反应检测(multiple reaction monitor, MRM)建立专属性鉴别方法。结果 找出了5种胶类药材的特征离子,确定阿胶的特征离子为m/z 539.8,鹿角胶的特征离子为m/z 765.4,龟甲胶的特征离子为m/z 631.3,黄明胶的特征离子为m/z 641.3,新阿胶的特征离子为m/z774.5,并建立了专属性强的鉴别方法。结论 确定的各胶类的特征肽专属性强,建立各胶类的专属性鉴别方法可以有效地区分各胶类。     

UPLC-QqQ/MS法检测阿胶强骨口服液阿胶及杂皮源成分

目的:建立阿胶强骨口服液中阿胶及掺杂皮源成分的专属性检测方法。方法:用序列分析用胰蛋白酶对阿胶强骨口服液及掺入不同杂皮胶的伪品中胶类成分进行酶解,采用超高效液相色谱-三重四极杆质谱(UPLC-QqQ/MS),选择阿胶特征分子离子峰m/z 539.8→612.4及牛皮源特征肽A特征离子对m/z 641.3→726.2作为检测离子对,离子化模式为ESI+,进行多反应监测。同时,建立阿胶强骨口服液中马皮胶成分红外谱检测法,结合质谱法鉴别掺伪马皮胶样品。结果:3批购买的阿胶强骨口服液保留时间均与阿胶对照药材一致,在7.7 min出峰,未出现与牛皮胶溶液对应的牛皮特征色谱峰。6批掺入不同杂皮胶(牛皮胶、猪皮胶和马皮胶)中2批马皮胶自制口服液检测出阿胶对照特征峰;2批牛皮胶口服液样品检测出牛皮源特征峰。红外光谱结果显示马皮胶自制口服液在1400～1700 cm^-1处吸收峰较特异,可与其它胶质进行区别,补充阿胶强骨口服液对马皮源成分的鉴别。结论:该检测方法专属性强,可用于阿胶强骨口服液中阿胶及杂皮源成分的检测,为阿胶强骨口服液质量标准提升提供了新的思路和方法。     

UPLC-ESI-QTOF-MS检测巴西龟龟甲胶中牛皮特征肽的研究

目的：以巴西龟为来源的龟甲胶中牛皮特征肽成分的检测。方法：采用胰蛋白酶进行酶解,利用超高效液相色谱-电喷雾四极杆飞行时间质谱法分别对以巴西龟为来源的龟甲胶和以中华草龟为来源的龟甲胶进行测定,选定牛皮特征肽离子m/z 604.8、m/z 641.3、m/z 790.8作为检测对象。结果：巴西龟来源的龟甲胶中只检测出牛皮特征肽离子m/z 641.3信号,其MS/MS裂解规律与黄明胶标准品酶解产物所含牛皮特征肽GEAGPSGPAGPTGAR一致,而中华草龟来源的龟甲胶中均未检测出牛皮特征肽信号。结论：该方法专属性强,灵敏度高,可区别巴西龟龟甲胶和掺杂牛皮成分的龟甲胶,可用于龟甲胶的质量控制。     

基于UPLC-ESI-QTOF-MS/MS技术检测龟甲胶中新阿胶成分

目的：检测龟甲胶中新阿胶特征肽成分。方法：采用胰蛋白酶进行酶解,利用超高效液相色谱-电喷雾四极杆飞行时间质谱法（UPLC-ESI-QTOF-MS/MS）对龟甲胶样品进行测定,选定新阿胶特征肽离子m/z 925.4作为检测离子。结果：龟甲胶特征成分含量偏低的样品（但不含有牛皮元和驴皮元特征肽成分）中检测出新阿胶特征肽离子m/z 925.4信号,其MS/MS裂解规律与文献报道一致,而龟甲胶标准品中未检测出该特征肽信号。结论：该方法专属性强、灵敏度高,可检测出龟甲胶中是否掺杂新阿胶成分,可用于龟甲胶的质量控制。     

超高效液相色谱-三重四级杆质谱法用于阿胶糕类食品中阿胶的鉴别及马、牛、羊、猪皮源成分的检测

目的:建立以特征肽为检测指标的阿胶糕中阿胶的鉴别方法与马皮、牛皮、羊皮、猪皮源成分的检测方法。方法:采用三氯乙酸沉淀法提取阿胶糕中的蛋白质,胰蛋白酶进行酶解处理,利用超高效液相色谱-三重四级杆质谱法(UHPLCQQQ MS),电喷雾离子源(ESI),正离子模式下扫描,采用多重反应监测模式,对特征肽目标离子进行检测。结果:经验证,鉴别方法和检查方法均均有良好的专属性,灵敏度高。市售样品测定结果显示,部分样品中检出阿胶成分,有的样品中检出牛皮源成分,有的样品中未检出任何皮源性成分。结论:所建立方法操作简便,专属性强,可用于阿胶糕中阿胶的鉴别和掺假杂皮胶的检测。     

超高效液相色谱-三重四极杆质谱法用于含阿胶中成药中胶类皮源检测研究

目的 建立含阿胶中成药阿胶补血口服液、阿归养血颗粒中阿胶类皮源检测方法，包括阿胶的专属性检测方法，以及猪皮源、马皮源、牛皮源掺伪检查研究。方法 采用胰蛋白酶对用0.01 g·mL^-1NH₄HCO₃溶解的阿归养血颗粒及阿胶补血口服液中阿胶进行酶解，利用超高效液相色谱-三重四极杆质谱(UPLC-QqQ-MS)对样品进行检测。色谱柱为Waters ACQUITY UPLC HSS T3-C₁₈(2.1 mm×100 mm, 1.8μm),流动相为体积分数0.1%甲酸溶液(A)-乙腈(B),梯度洗脱(0～25 min, 95%A→80%A;25～40 min, 80%A→50%A),流速0.3 mL·min^-1,柱温30℃,进样量5μL;离子化模式为ESI+,进行多反应监测，选择阿胶特征分子离子峰m/z 539.8(双电荷)→612.4和m/z 539.8(双电荷)→923.8;马源寡肽A特征分子离子峰m/z 386.4(双电荷)→322.3和m/z 386.4(双电荷)→377.3;...     

UPLC-QQQ-MS法检测孕康口服液中驴皮源和牛皮源成分

目的:建立孕康口服液中驴皮源及牛皮源成分的专属性检测方法。方法:选用胰蛋白酶技术对孕康口服液中胶类成分进行处理,利用超高效液相色谱-三重四极杆质谱(UPLC-QQQ-MS)对驴皮源及牛皮源成分的专属性特征分子离子峰进行检测。结果:10批样品均检出驴皮源成分的特征离子峰,并且均未检出牛皮源成分的特征离子峰。结论:该方法操作简便、准确、快速,灵敏度高,可用于孕康口服液中驴皮源的鉴别及牛皮源的检查。     

基于生物信息学和质谱技术的阿胶特异性肽段筛选与鉴定

目的:建立基于生物信息技术和液质联用技术识别特征肽鉴别阿胶的新方法。方法:利用生物信息技术对驴皮、牛皮和猪皮I型胶原蛋白α1链氨基酸序列进行同源性比对发现3种皮类胶原蛋白氨基酸序列存在差异,通过生物学软件模拟胰酶酶解,分析比对驴皮、牛皮、猪皮来源I型胶原蛋白α1链酶解肽段,然后通过实验对样品前处理条件进行系统摸索,采用超高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱(UPLC/Q-TOF-MS)进行验证。结果:筛选出12个驴皮的特异性肽段,鉴定出1个与预测结果一致的驴皮特异性肽段,其质荷比(m/z)为766.4,分子量为1 530.802 2,对应的多肽序列为GEAGPAGPAGPIGPVGAR,利用特征肽段对10组阿胶样品进行鉴定。结论:生物信息技术结合UPLC/Q-TOF-MS检测出的驴皮特征肽可有效、特异、准确地对阿胶药材进行专属性鉴定。     

基于Label-free定量多肽组学的鹿角胶与鹿皮胶糖基化肽研究

该文采用纳升液相-串联质谱法对鹿角胶(DCG)与鹿皮胶(DHG)样品的糖基化肽类进行分析,以Label-free定量(LFQ)多肽组学方法对糖基化肽类成分的相对含量进行比较分析,筛选确定DCG与DHG样品中差异显著的糖基化肽类成分。结果从5批次DCG样品中共鉴定了5 736个肽段,其中含半乳糖基化赖氨酸(galactosyl-hydroxylysine,GalHyl)的肽段共213个,含葡萄糖半乳糖基化赖氨酸(glucosyl-galactosyl-hydroxylysine,Glc-Gal-Hyl)的肽段共102个;从5批次DHG样品中共鉴定了6 836个肽段信息,含Gal-Hyl的肽段共250个,含Glc-Gal-Hyl的肽段共98个。以肽段峰面积差异大于3倍,且组间有极显著性差异(P0.01)为条件筛选差异肽段,确定444个肽段在DCG与DHG中差异显著,其中含Gal-Hyl的肽段共16个,含Glc-Gal-Hyl的肽段共5个;进一步以选择离子峰的峰型、峰面积标准偏差及差异倍数筛选确定了5个在DCG与DHG样品中差异极显著的糖基化肽,可作为潜在的区分DCG与DHG的标记物。该文研究为DCG与DHG的鉴别区分提供了新的思路,为胶类中药的物质基础研究、质量标准提升研究提供方法依据,具有较好的理论意义与应用价值。     

花类药材金银花精准煮散饮片的质量评价

目的：饮片质量均一性是中药稳定临床疗效的基础。本文基于成分分析与DNA分子鉴定手段,考察金银花精准准煮散饮片与市售原饮片质量差异,探索精准煮散饮片的质量控制方法。方法：应用ITS2序列作为DNA条形码对金银花饮片进行鉴定;对比金银花市售原饮片及精准煮散饮片的干膏收率;采用HPLC-DAD法进行3批次饮片混合粉碎前后指标成分含量、指纹图谱及相似度评价。结果：金银花煮散饮片出膏率及指标成分绿原酸含量均略高于市售饮片;市售饮片绿原酸的批间溶出量有明显的差异性,RSD为11.93%;混合制成煮散饮片后差异降低,RSD为8.29%。指纹图谱相似度结果显示,混合粉碎后指纹图谱相似度提高,标定共有峰7个,峰面积均有不同程度提高。结论：金银花精准煮散饮片与市售原饮片基本属性相一致,但煮散饮片的出膏率、成分溶出及质量均一性均有明显提高,表明煮散饮片有较好的临床应用优势。     

叶类药材淫羊藿精准煮散饮片的质量研究

目的：采用化学指纹图谱法结合DNA分子鉴定技术,考察淫羊藿精准煮散饮片与市售原饮片质量差异。方法：制备不同规格淫羊藿煮散饮片,对比市售饮片及煮散饮片的干膏收率;应用ITS2及psbA-trnH条形码序列对淫羊藿饮片进行分子鉴定;采用HPLC-DAD法进行3批次饮片混合粉碎前后质量均一性、指纹图谱及相似度评价。结果：淫羊藿煮散饮片出膏率略高于市售饮片;3批市售饮片指标成分淫羊藿苷提取率有明显的差异性,RSD为15.56%,煮散饮片差异较小RSD为6.82%。指纹图谱相似度评价结果显示,淫羊藿精准煮散饮片的指纹图谱相似度提高,标定共有峰10个,峰面积均有提高。ITS2及psbA-trnH序列对淫羊藿煮散饮片可实现准确鉴定。结论：淫羊藿精准煮散饮片与市售饮片基本属性相一致,但煮散饮片的浸膏提取率、指标成分的批间均一性有不同程度提升。研究结果显示发展精准煮散饮片有良好的应用前景。     

高效液相色谱-串联质谱法同时测定参麦注射液中9种皂苷

目的:本研究采用高效液相色谱-串联质谱检测方法,建立同时测定参麦注射液中人参皂苷Rg1,Re,Rf,Rc,Rd,Rb1,Rb2,Ro和麦冬皂苷D的分析方法。方法:本实验应用Thermo BDS Hypersil C18柱(150 mm×2.1 mm,5μm),柱温30℃。以乙腈(A)-0.02%醋酸溶液(B)为流动相进行梯度洗脱,流速0.2 mL·min-1,以电喷雾离子源选择反应监测(SRM)方式正离子模式分别检测离子对m/z 823.5→643.75(人参皂苷Rg1),m/z 969.4→789.46(人参皂苷Re),m/z 823.6→371.94(人参皂苷Rf),m/z 1101.7→343.17(人参皂苷Rc),m/z 969.4→789.46(人参皂苷Rd),m/z 1131→371.80(人参皂苷Rb1),m/z 1101.7→343.35(人参皂苷Rb2),m/z 979.7→641.65(人参皂苷Ro);负离子模式检测离子对m/z 889.4→853.67(麦冬皂苷D)。结果:本法专属性良好,各成分均能达到有效分离,线性关系良好(r>0.99),人参皂苷Rg1,Re,Rf,Rc,Rd,Rb1,Rb2,Ro和麦冬皂苷D最低定量限分别为0.03、0.003、0.3、0.03、0.003、0.03、0.03、5、3 ng·mL-1,回收率均在97.10%¹02.14%范围内,重复进样精密度均小于2.63%(RSD)。讨论:与文献中报道方法相比,本方法快速、灵敏度高、准确性好、重复性好,可以对参麦注射液中含量差异较大的四类皂苷类成分进行同时定量,能够用于参麦注射液的含量测定和质量控制。     

超高效液相色谱-质谱联用技术评价当归养血丸中阿胶投料情况

目的 建立当归养血丸中阿胶的检测方法,为投料阿胶质量控制提供技术支持。方法 采用胰蛋白酶对当归养血丸进行酶解,利用超高效液相色谱-质谱联用技术(UPLC-MS/MS),在电喷雾离子化(ESI⁺)模式下,进行多反应监测(multiple reaction monitoring,MRM),进行阿胶专属鉴别、马皮源成分检查及阿胶特征多肽含量测定。结果 建立方法线性、专属性、稳定性、重复性、耐用性良好。以此方法,11批当归养血丸中均检出阿胶,其中9批检出马皮源成分,7批低于阿胶特征多肽含量拟定限度。结论 所建立的方法准确可靠、专属性强,可用于当归养血丸中阿胶的质量评价。     

低场核磁技术结合化学计量学法快速检测掺假阿胶产品

目的研究快速检测掺假阿胶的低场核磁共振技术(LF-NMR)新方法。方法应用低场核磁共振技术(LF-NMR)结合主成分分析法(PCA)和逐步判别分析法(Step-LDA)对掺黄明胶、新阿胶、劣质胶的阿胶进行测定。结果阿胶、黄明胶、新阿胶、劣质胶的弛豫特性不同,LF-NMR技术结合PCA可以实现对掺假阿胶与纯阿胶间的辨识,利用Step-LDA构建的判别模型对纯阿胶与不同形式掺假阿胶的区分效果更好,回判成功率均达100%,交叉验证组所有样本均正确分类,准确率达到100%,不同比例的掺假阿胶在得分图上呈规律性分布。建立掺假阿胶的Step-LDA得分模型,不同掺假物质的检测限为:黄明胶7%～9%,新阿胶7%～9%,劣质胶5%～7%。结论应用低场核磁共振技术结合化学计量学可实现掺黄明胶、新阿胶、劣质胶的阿胶的区分,LF-NMR结合Step-LDA鉴别准确率较好。     

基于高效液相色谱指纹图谱及聚类分析、主成分分析的市售片姜黄质量研究

目的基于HPLC指纹图谱、主成分分析法(PCA)和聚类分析法(CA)对市售片姜黄饮片的质量进行研究。方法采用HPLC法测定30批市售片姜黄饮片指纹图谱,并对其相似度进行比较,确定共有峰;运用SPSS 19.0数据分析软件,以各共有峰峰面积为变量,进行PCA和CA分析。结果建立了市售片姜黄饮片的共有峰模式,标定了24个共有峰,并指认了其中4个共有峰,分别为莪术二酮、莪术醇、吉马酮、呋喃二烯,30批片姜黄饮片的相似度为0.643~0.986。CA结果将所有批次片姜黄共分为3类,反映了30批市售片姜黄的质量特征。PCA结果筛选出累计贡献率达到83.153%的5个主成分,以它们计算所有样本的综合得分,对片姜黄饮片质量进行排序。结论 HPLC指纹图谱结合CA和PCA可以对片姜黄饮片的质量进行客观、有效的评价。     

UPLC-MS/MS同时测定桂枝茯苓胶囊中6种三萜酸类成分的含量

建立超高效液相色谱-质谱联用(UPLC-MS/MS)同时测定桂枝茯苓胶囊中6种三萜酸类成分含量的分析方法。采用Agilent Porosheell 120 SB-C_(18)柱(4.6 mm×150 mm,2.7μm);流动相为0.1%甲酸水溶液-甲醇,梯度洗脱,流速0.4 m L·min~(-1),柱温30℃;进样量5μL。质谱条件采用电喷雾离子(ESI)源,多重反应监测(MRM)扫描,定量离子对为m/z 527.8→465.5(茯苓酸),m/z 525.6→465.6(去氢茯苓酸),m/z 483.4→337.3(去氢土莫酸),m/z 481.5→419.5(猪苓酸C),m/z467.4→337.1(去氢齿孔酸),m/z 453.4→337.0(松苓新酸)。结果显示,6种三萜酸类成分在进样质量浓度范围内呈现良好的线性关系(r0.996 8),精密度RSD6.2%;重复性RSD5.9%,平均回收率分别为97.90%,100.2%,99.60%,101.7%,102.6%,103.0%。该方法准确、快速、重复性好,实现了中药成方制剂中茯苓三萜酸类成分的定量测定,可为桂枝茯苓胶囊的质量控制提供参考方法;并为含茯苓的中药成方制剂中建立含量测定方法提供参考。     

HPLC-ELSD法分析测定阿胶与黄明胶中4种主要未衍生化氨基酸的含量

目的:建立了一种高效液相色谱-蒸发光散射检测法(HPLC-ELSD)同时测定阿胶和黄明胶中4种主要未衍生化氨基酸(L-甘氨酸、L-羟脯氨酸、L-丙氨酸、L-脯氨酸)含量的方法,从而对阿胶进行质量控制。方法:采用Thermo hypercarb色谱柱(150 mm×4.6 mm,5μm)进行分析,流动相A为0.08%三氟乙酸甲醇、乙腈(90:10),B为2 mmol/L全氟戊酸水,梯度洗脱,流速为0.8 mL/min,载气流速为1.5 L/min,漂移管温度为55℃。结果:L-甘氨酸、L-羟脯氨酸、L-丙氨酸、L-脯氨酸的质量浓度与峰面积呈良好的线性关系(r0.9993),阿胶与黄明胶的加样回收率分别为98.12%～102.14%、97.23%～102.03%,RSD均2.53%(n=6)。结论:此方法简单快速、重复性较好,适用于快速准确地测定阿胶和黄明胶中L-甘氨酸、L-羟脯氨酸、L-丙氨酸、L-脯氨酸含量,为其质量控制提供参考。     

基于HS-SPME-GC-MS分析阿胶、龟甲胶、鹿角胶3种动物胶蛤粉烫炮制前后挥发性成分变化

目的 分析探讨蛤粉烫对阿胶、龟甲胶、鹿角胶3种动物胶挥发性成分的影响.方法 采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱(headspace solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry,HS-SPME-GC-MS)对阿胶、龟甲胶、鹿角胶3种动物...     

基于LC-MS/MS技术同时定量分析片仔癀中特征胰酶水解肽

目的：阐明片仔癀中的蛋白组,定量分析其中的特征胰酶水解肽,以提高片仔癀的质量控制水平。方法：优化总蛋白提取条件,采用二辛可宁酸(BCA)法测定总蛋白含量,利用鸟枪法蛋白组学表征片仔癀的蛋白组,并进一步选择含量较高、稳定性好、长度适宜的特征多肽作为目标分析物,采用在线能量分辨质谱法(online ER-MS)优化特征肽的离子对及最佳碰撞能,建立反相液相色谱-选择反应监测(RPLC-SRM)定量分析方法,测定11批片仔癀中目标多肽的含量。结果：利用UniProt数据库从片仔癀中共鉴定了来源于200个蛋白的343个肽段,以酶和骨架蛋白为主;筛选得到ALSSALHER、TLLEGEESR和VAPLGEEFR 3个特征肽,以其作为目标分析物进行定量分析,online ER-MS优化3个特征肽的定量参数离子对分别为m/z 492.3→799.4、517.3→819.4和509.3→637.3,碰撞能分别为25.0、24.4、28.6 eV。方法学验证符合定量要求,3个多肽类成分在各批片仔癀样品中均被检出(ALSSALHER:0.06～0.44μg·g^–1;TLLEGEESR:...     

当归饮片指纹图谱及模式识别研究

目的建立当归饮片HPLC指纹图谱,为评价饮片质量提供依据。方法采用HPLC对来自岷县不同产区的50批次当归标准化自制饮片和15批次市售饮片建立相应的指纹图谱,色谱条件为Waters Symmetry#x00AE;C_(18)(4.6mm×250 mm,5μm)色谱柱,以乙腈-0.5%醋酸水为流动相进行梯度洗脱,流速1 ml·min~(-1),检测波长为254 nm,柱温30℃。利用相似度评价、聚类分析及主成分分析方法对65批饮片共有峰的峰面积进行分析处理。结果建立了当归饮片HPLC指纹图谱,确定了29个共有峰,对7个共有峰进行了化学成分确认;市售饮片相似度普遍低于自制饮片,50批标准化自制饮片不同地理位置间相似度具有一定的差异;聚类分析可大致将不同产区的当归样品分开,市售饮片与标准化自制饮片能够明显区分;主成分分析结果表明岷县秦许镇产当归质量较佳。结论当归饮片HPLC指纹图谱的建立及化学模式识别的应用为饮片的质量控制提供了简单有效的评价方法。