MMP-9抑制剂通过PI3K/Akt信号通路对人口腔鳞癌SCC15细胞株生物学行为的影响

目的探讨基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9, MMP-9)抑制剂(SB-3CT)通过磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol-3 kinase, PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B, Akt)信号通路对人口腔鳞癌SCC15细胞株增殖、侵袭、迁移的调控作用。方法对数生长期SCC15细胞分为对照组、低剂量组、中剂量组和高剂量组,分别采用0、2.5、5、10μmol/L SB-3CT进行处理。采用MTT法检测处理24、48、72 h时细胞增殖率;处理24 h时,采用Transwell小室试验检测侵袭细胞数,采用划痕试验检测细胞融合距离,采用实时荧光定量PCR法检测细胞MMP-9、PI3K、Akt mRNA相对表达量,采用Western blot法检测细胞MMP-9、PI3K、Akt、p-Akt蛋白相对表达量。结果处理24、48、72 h时,低、中、高剂量组细胞增殖率低于对照组(P0.05),低、中、高剂量组细胞增殖率依次降低(P0.05),低、中、高剂量组细胞增殖率均随处理时间延长而降低(P0.05)。处理24 h时,低、中、高剂量组侵袭细胞数[(96.26±21.11)、(52.00±13.13)、(21.20±6.15)个]和细胞融合距离[(91.80±25.00)、(65.10±19.00)、(27.20±11.00)μm]小于对照组[(125.00±31.15)个、(127.90±27.00)μm](P0.05),低、中、高剂量组依次减小(P0.05)。低、中、高剂量组细胞MMP-9、PI3K mRNA和MMP-9、PI3K、p-Akt蛋白相对表达量及p-Akt/Akt明显低于对照组(P0.05),低、中、高剂量组依次降低(P0.05)。4组细胞Akt mRNA和蛋白相对表达量比较差异无统计学意义(P0.05)。结论 MMP-9抑制剂可抑制人口腔鳞癌SCC15细胞的增殖、侵袭和迁移能力,可能通过PI3K/Akt信号通路发挥调控作用。     

人口腔鳞状细胞癌SCC9细胞miR-146a-5p表达及对细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨miR-146a-5p在人口腔鳞状细胞癌SCC9细胞系中的表达及对SCC9细胞增殖、凋亡的影响。方法取对数生长期人口腔鳞状细胞癌SCC9细胞和人正常口腔角质HOK细胞,采用实时荧光定量PCR法检测miR-146a-5p mRNA、肿瘤坏死因子受体相关因子6(tumor necrosis factor receptor associated factor 6, TRAF6)mRNA相对表达量。取对数生长期人口腔鳞状细胞癌SCC9细胞,随机分为观察组(转染miR-146a-5p mimics)和空白对照组(转染等量ddH_2O),转染24、48 h,采用CCK-8法检测2组细胞增殖,FITC-PI荧光双染法检测细胞凋亡;转染24 h,采用实时荧光定量PCR法检测PI3K mRNA、Akt mRNA、mTOR mRNA相对表达量,Western blot法检测PI3K、Akt、mTOR蛋白相对表达量。结果 SCC9细胞miR-146a-5p mRNA相对表达量(8.33±0.58)高于HOK细胞(1.04±0.01),TRAF6 mRNA相对表达量(0.05±0.01)低于HOK细胞(1.05±0.01)(P0.05)。转染24、48 h,观察组SCC9细胞增殖吸光度值(1.65±0.02、1.96±0.04)高于空白对照组(1.33±0.01、1.57±0.02)(P0.05),SCC9细胞凋亡率[(0.89±0.01)%、(1.23±0.01)%]低于空白对照组[(2.77±0.01)%、(4.23±0.01)%](P0.05)。转染24 h,观察组Scc细胞PI3K mRNA、Akt mRNA、mTOR mRNA相对表达量(2.98±0.05、8.20±0.06、5.34±0.03)高于空白对照组(1.05±0.01、1.03±0.01、1.07±0.01),PI3K、Akt、mTOR蛋白相对表达量(2.32±0.01、10.23±0.02、5.25±0.01)高于空白对照组(0.62±0.01、4.58±0.01、0.09±0.01)(P0.05)。结论 SCC9细胞miR-146a-5p表达上调,TRAF6表达下调;miR-146a-5p可促进SCC9细胞增殖,抑制其凋亡,其机制可能是增强PI3K/Akt/mTOR信号通路表达。     

肝细胞生长因子对肾小管上皮细胞转分化及整合素连接激酶表达的影响

目的探讨肝细胞生长因子（HGF）在转化生长因子β1（TGF-β1）介导的肾小管上皮细胞转分化中的作用及对整合素连接激酶（ILK）表达的影响。方法将体外培养人肾小管上皮细胞（HKC）分为正常对照组、TGF-β1刺激组和HGF干预组。应用Western blotting方法检测ILK、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的蛋白表达,实时RT-PCR法测定ILK、α-SMA、纤维连接蛋白（Fn）、E钙黏蛋白（E-cadherin）的mRNA表达。结果在TGF-β1刺激组,ILK和α-SMA的蛋白表达量显著增加,ILK、α-SMA和Fn的mRNA表达量也明显升高,E-cad-herin mRNA表达量则明显降低（与正常对照组比较,P〈0.001）。而在HGF干预组,ILK、α-SMA的蛋白表达量以及ILK、α-SMA、Fn的mRNA表达量均较TGF-β1刺激组显著降低,E-cadherin mRNA表达量则明显升高（与TGF-β1刺激组比较,P〈0.01）。结论HGF能抑制TGF-β1介导的肾小管上皮细胞转分化,并可降低ILK蛋白和mRNA表达水平。     

高糖刺激大鼠肾间质成纤维细胞TGF-β、CTGF及α-SMA作用研究

目的探讨高糖对大鼠肾间质成纤维细胞株NRK49f转化生长因子-β(TGF-β)、结缔组织生长因子(CTGF)及α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达的影响。方法将处于对数生长期的大鼠肾间质成纤维细胞株NRK49f用无血清高糖DMEM培养12h、24h及48h,同时设空白对照组,用Western Blot及实时定量RT-PCR法检测并分析各组细胞TGF-β、CTGF及α-SMA表达情况。结果高糖DMEM作用于NRK49f12h即可见TGF-β、CTGF蛋白表达均有增加趋势,与正常对照组比较,高糖刺激24h及48h组TGF-β相对表达量均明显增加,差异有统计学意义(P0.05),且与高糖12h组比较,二者相对表达量变化明显增加(P0.05);高糖DMEM作用于NRK49f12h即可见TGF-β、CTGF mRNA表达均增加,至高糖刺激培养细胞24h及48h时,二者相对表达量均明显高于对照组及高糖培养12h组,差异均有统计学意义(P0.05);高糖DMEM作用于NRK49f24h时可见α-SMA表达条带,至高糖DMEM培养48h时,α-SMA相对表达量最高。结论高糖可刺激体外培养的肾间质成纤维细胞表达TGF-β和CTGF的转录和翻译,并可刺激其表达α-SMA。     

1,25-二羟维生素D3对高糖诱导的肾小管上皮细胞转分化的影响

目的:探讨1,25-二羟维生素D3对高糖诱导的人肾小管上皮细胞(HK-2)转分化的影响及其可能机制。方法:培养人肾小管上皮细胞并分为正常对照组(含5.5mmol/LD-葡萄糖)、高糖组(含25mmol/LD-葡萄糖)和高糖+1,25-二羟维生素D3组,细胞免疫组化方法测定各组HK-2细胞的α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和E-钙黏素(E-cad)的蛋白表达,RT-PCR半定量方法测定各组HK-2细胞的α-SMA和E-cad的mRNA表达。结果:与正常对照组相比,高糖组和高糖+1,25-二羟维生素D3组,α-SMA蛋白表达水平和mRNA表达水平明显升高(P<0.05),E-cad蛋白表达水平和mRNA表达水平明显下降(P<0.05);与高糖组相比,高糖+1,25-二羟维生素D3组α-SMA蛋白表达水平和mRNA表达水平明显下降(6.576±1.044vs.4.715±0.776;0.752±0.086vs.0.491±0.023,P<0.05),而E-cad蛋白表达水平和mRNA表达水平明显上升(2.085±0.553vs.4.970±0.845;0.163±0.036vs.0.478±0.062,P<0.05)。结论:1,25-二羟维生素D3可以抑制高糖诱导的肾小管上皮细胞转分化,其可能通过下调α-SMA的表达,上调E-cad的表达,从而抑制肾小管上皮细胞转分化,对糖尿病肾病有一定防治作用。     

miR-326靶向MAPK/MEK信号通路抑制食管鳞状细胞癌恶性生物学行为

目的探讨miR-326靶向MAPK/MEK信号通路对食管鳞状细胞癌细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响。方法 20例食管鳞状细胞癌患者,取手术切除食管癌组织和癌旁正常组织,采用实时荧光定量PCR法检测miR-326mRNA和MAPK mRNA相对表达量,采用免疫组织化学法检测MAPK蛋白表达。3种食管癌细胞系(KYSE150、EC9706、TE-9)和人正常食管上皮细胞系Het-1A,采用实时荧光定量PCR法检测细胞miR-326 mRNA和MAPK mRNA相对表达量,Western blot法检测细胞MAPK蛋白相对表达量。将对数生长期EC9706细胞随机分为miR-326组、转染对照组和空白对照组,miR-326组和转染对照组分别转染miR-326 mimic和mimic NC,空白对照组细胞不作任何处理,采用Western blot法检测细胞MAPK、p-MEK、p-ERK1、p-ERK2和p-C-Jun蛋白相对表达量,克隆形成试验检测细胞克隆形成率,划痕试验检测细胞划痕闭合率,Transwell小室试验检测细胞侵袭,流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡,荧光素酶活性检测试剂盒检测细胞荧光素酶活性。结果食管癌组织miR-326 mRNA相对表达量低于癌旁正常组织(P0.05),MAPK mRNA相对表达量高于癌旁正常组织(P0.05)。KYSE150、EC9706和TE-9细胞miR-326 mRNA相对表达量均低于Het-1A细胞(P0.05),MAPK mRNA和MAPK蛋白相对表达量高于Het-1A细胞(P0.05),且EC9706细胞MAPK蛋白相对表达量最高。miR-326组细胞MAPK 3'UTR WT荧光素酶活性(0.53±0.05)明显低于转染对照组(1.22±0.14)(P0.05),MAPK 3'UTR MUT荧光素酶活性(0.86±0.06)与转染对照组(0.91±0.11)比较差异无统计学意义(P0.05)。miR-326组细胞MAPK蛋白相对表达量(0.32±0.15)低于转染对照组(0.88±0.07)和空白对照组(0.91±0.06)(P0.05),细胞克隆形成率[(21.30±0.55)%]、划痕闭合率[(29.47±4.12)%]和侵袭细胞数[(113.86±3.15)个]低于转染对照组[(75.43±0.81)%、(80.52±2.51)%、(427.27±4.25)个]和空白对照组[(79.13±0.65)%、(83.44±1.87)%、(468.10±3.38)个](P0.05),G_0/G_1期细胞比率[(63.15±1.20)%]和细胞凋亡率[(18.54±0.60)%]高于转染对照组[(41.18±0.60)%、(5.28±1.30)%]和空白对照组[(45.11±0.80)%、(4.13±0.90)%],S期和G_2/M期细胞比率及p-MEK、p-ERK1、p-ERK2和p-C-Jun蛋白相对表达量低于转染对照组和空白对照组(P0.05),转染对照组与空白对照组比较差异均无统计学意义(P0.05)。结论 miR-326靶向抑制MAPK/MEK信号通路的激活,影响食管鳞状细胞癌细胞的增殖、迁移、侵袭和凋亡。     

重症肌无力患者外周血单个核细胞中miR-146a表达分析

目的探讨miR-146a在重症肌无力(myasthenia gravis, MG)患者外周血单个核细胞中的表达及其临床意义。方法 MG患者35例为观察组,同期体检健康者30例为对照组,采用Ficoll分层液法分离外周血单个核细胞,实时荧光定量PCR法检测2组外周血单个核细胞miR-146a mRNA相对表达量;Pearson法分析MG患者单个核细胞miR-146a mRNA相对表达量与定量MG评分的相关性。结果观察组外周血单个核细胞miR-146a mRNA相对表达量(3.41±0.25)明显高于对照组(0.95±0.12)(P0.05);全身型MG患者外周血单个核细胞miR-146a mRNA相对表达量(4.18±0.21)高于眼肌型者(3.01±0.15)(P0.05);MG患者单个核细胞miR-146a mRNA相对表达量与定量MG评分呈正相关(r=0.584,P0.001)。结论 MG患者外周血单个核细胞miR-146a表达明显上调,且与病情严重程度有关。     

人脐带间充质干细胞对人卵巢癌SKOV3细胞凋亡的影响及可能机制

目的探讨人脐带间充质干细胞(human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells, hUC-MSCs)对人卵巢癌SKOV3细胞凋亡的影响及可能作用机制。方法取传代培养至第5代的hUC-MSCs细胞,应用显微镜下观察细胞形态,采用流式细胞术检测细胞表面标志物。取细胞数分别为0个/mL(对照组)、1×10~6个/mL(低剂量组)、2×10~6个/mL(中剂量组)、4×10~6个/mL(高剂量组)第5代hUC-MSCs细胞悬液0.5 mL,接种于Transwell小室膜上,应用Transwell小室与对数生长期SKOV3细胞共培养60 h,采用CCK-8法检测SKOV3细胞增殖相对抑制率,采用流式细胞术检测SKOV3细胞凋亡率,采用实时荧光定量PCR法检测SKOV3细胞PI3K mRNA、Akt mRNA、B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2, Bcl-2) mRNA、caspase-3 mRNA相对表达量。结果显微镜下第5代hUC-MSCs呈贴壁长梭状细胞,单核,大小较均一,呈漩涡状、放射状或平行排列,仍可保持原代hUC-MSCs细胞典型形态;流式细胞仪检测结果显示,第5代hUC-MSCs细胞表面CD44、CD29表达率分别为(98.406 7±0.133 2)%、(98.393 3±0.366 9)%,CD34、CD45表达率分别为(0.013 3±0.005 8)%、(0.006 7±0.005 8)%。第5代hUC-MSCs细胞与SKOV3细胞共培养60 h,低剂量组、中剂量组、高剂量组SKOV3细胞凋亡率[(40.63±0.74)%、(45.53±0.67)%、(56.53±0.57)%]、细胞增殖相对抑制率[(23.96±1.55)%、(40.35±1.34)%、(46.25±2.41)%]和caspase-3 mRNA相对表达量(1.46±0.02、1.91±0.04、2.37±0.01)依次增高(P均0.05),且均高于对照组[(31.60±0.53)%、0、1](P0.05)。低剂量组、中剂量组、高剂量组PI3K mRNA(0.60±0.02、0.46±0.02、0.34±0.04)、Akt mRNA(0.85±0.04、0.66±0.03、0.46±0.05)、Bcl-2 mRNA(0.85±0.04、0.69±0.04、0.39±0.03)相对表达量依次降低(P均0.05),且均低于对照组(1、1、1)(P0.05)。结论 hUC-MSCs细胞与SKOV3细胞共培养可促进SKOV3细胞凋亡,且hUC-MSCs细胞数越多促凋亡作用越强,其机制可能与下调Bcl-2、上调caspase-3表达,抑制PI3K/Akt信号通路有关。     

hsa_circ_0000417表达水平对神经胶质瘤细胞生物学行为的影响

目的探讨hsa_circ_0000417表达水平对胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。方法采用实时荧光定量PCR法检测hsa_circ_0000417在正常人星形胶质细胞HA1800和人源神经胶质瘤细胞U87MG和U251中相对表达量;选择hsa_circ_0000417相对高表达的人源神经胶质瘤细胞U251随机分为siRNA-circ抑制剂组和siRNA-NC对照组,分别转染靶向hsa_circ_0000417接头序列的抑制剂siRNA-circ和阴性对照siRNA-NC,采用实时荧光定量PCR法检测2组U251细胞hsa_circ_0000417相对表达量;转染1、2、3、4 d时,采用CCK-8法测转染后2组细胞增殖率;转染24 h时,采用划痕试验检测2组细胞划痕愈合面积,采用Transwell小室试验检测2组侵袭细胞数。结果人正常星形胶质细胞HA1800 hsa_circ_0000417相对表达量(1.00±0.06)高于人源神经胶质瘤细胞U251(0.85±0.03)和U87MG(0.36±0.02)(P0.05),人源神经胶质瘤细胞U251高于U87MG(P0.05)。转染后siRNA-circ抑制剂组hsa_circ_0000417相对表达量(0.04±0.01)低于siRNA-NC对照组(1.00±0.09)(P0.05);转染1、2、3、4 d时,siRNA-circ抑制剂组细胞增殖率[(90.55±6.30)%、(90.88±2.87)%、(72.42±7.83)%、(65.51±4.28)%]均低于siRNA-NC对照组[(100.00±5.24)%、(100.00±7.86)%、(100.00±4.51)%、(100.00±7.57)%](P0.05)。转染24 h时,siRNA-circ抑制剂组划痕愈合面积百分比[(12.26±2.06)%]和侵袭细胞数[(207±95)个]少于siRNA-NC对照组[(19.01±3.89)%、(814±102)个](P0.05)。结论 Hsa_circ_0000417可提高神经胶质瘤细胞U251的增殖、迁移和侵袭能力,hsa_circ_0000417有可能成为神经胶质瘤新的治疗靶点。     

敲除SIRT1对急性髓细胞白血病小鼠白血病细胞凋亡及细胞周期的影响

目的探讨急性髓细胞白血病小鼠SIRT1表达及对白血病细胞凋亡及细胞周期的影响。方法 C57BL/6J小鼠10只,随机分为观察组和对照组各5只。2组小鼠应用半致死剂量X射线(4.75 Gy)照射7 min后,经尾静脉移植2.5×10~5个病毒感染的白血病细胞制备急性髓细胞白血病模型。移植第14天,观察组腹腔注射pIpC溶液5 mg/kg,隔天注射1次,共3次,诱导SIRT1敲除;对照组注射等量生理盐水。移植第24天处死2组小鼠,取股骨骨髓提取白血病细胞,采用实时荧光定量PCR法检测SIRT1 mRNA、细胞周期蛋白依赖性激酶1 mRNA、p19 mRNA、p21 mRNA、p27 mRNA相对表达量,采用流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期。结果观察组SIRT1 mRNA相对表达量(0.11±0.01)低于对照组(1.01±0.01)(P0.05),p19 mRNA、p21 mRNA、p27 mRNA相对表达量(3.76±0.22、1.53±0.06、2.23±0.02)高于对照组(1.01±0.01、1.02±0.01、1.01±0.01)(P0.05),细胞周期蛋白依赖性激酶1 mRNA相对表达量(1.05±0.02)与对照组(1.01±0.02)比较差异无统计学意义(P0.05)。观察组细胞凋亡率[(30.3±0.3)%]与对照组[(27.3±0.4)%]比较差异无统计学意义(P0.05)。观察组G_0期细胞比率[(55.22±0.60)%]高于对照组[(19.20±0.30)%](P0.05),G_1期、S/G_2/M期细胞比率[(24.20±0.50)%、(20.10±0.30)%]与对照组[(56.11±0.60)%、(24.38±0.40)%]比较差异无统计学意义(P0.05)。结论敲除SIRT1不影响急性髓细胞白血病小鼠白血病细胞凋亡,可使白血病细胞停滞于G_0期,其机制可能与上调细胞周期抑制基因p19、p21、p27表达有关。     

PI3K/Akt信号通路对人结肠癌HT-29细胞增殖的影响

目的探讨PI3K/Akt信号通路在人结肠癌HT-29细胞增殖中的作用。方法人结肠癌HT-29细胞分为结肠癌组和抑制剂组,癌旁正常细胞株为对照组,均取对数生长期细胞进行实验。结肠癌组和对照组应用培养基+等量生理盐水进行培养,抑制剂组应用培养基+PI3K/Akt信号通抑制剂LY294002 10μL进行培养。MTT法检测3组培养24、48、72h时细胞增殖情况,Western blot法检测3组PI3K、Akt、磷酸化Akt、P-糖蛋白表达,流式细胞仪检测3组细胞周期及凋亡情况。结果培养24、48、72h,对照组和抑制剂组细胞吸光度值均小于结肠癌组(P0.05),对照组与抑制剂组比较差异无统计学意义(P0.05);培养24h,对照组和抑制剂组PI3K、Akt、磷酸化Akt和P-糖蛋白表达均低于结肠癌组(P0.05),对照组与抑制剂组比较差异无统计学意义(P0.05);流式细胞仪检测结果显示,结肠癌组G_1期细胞比率[(62.54±5.15)%]、细胞凋亡率[(45.18±6.76)%]均高于对照组[(39.47±3.84)%、(10.98±0.62)%]和抑制剂组[(37.18±2.03)%、(9.31±0.41)%](P0.05),G_2/M期细胞比率[(11.34±2.06)%]低于对照组[(29.32±3.77)%]和抑制剂组[(28.71±2.35)%](P0.05),S期细胞比率[(26.75±2.46)%]与对照组[(29.81±3.18)%]和抑制剂组[(30.44±2.87)%]比较差异均无统计学意义(P0.05);抑制剂组G_1期、G_2/M期、S期细胞比率及细胞凋亡率与对照组比较差异均无统计学意义(P0.05)。结论 PI3K/Akt信号通路可抑制人结肠癌HT-29细胞增殖,其机制可能与抑制其转导通路下游P-糖蛋白表达、使细胞周期阻滞于G_1期有关。     

卵泡抑素样蛋白5对HCCLM3细胞迁移和侵袭的影响

目的探讨卵泡抑素样蛋白5(follistatin-like 5,FSTL5)在不同肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)细胞株中的表达及在HCCLM3细胞迁移、侵袭中的作用。方法取对数生长期HCC细胞(SMMC-7721、HepG2、HCCLM3、MHCC97H、PLC)和永生化正常肝上皮细胞LO2,采用实时荧光定量PCR法检测FSTL5mRNA相对表达量。将对数生长期HCCLM3细胞随机分为转染组和对照组,转染组转染FSTL5的表达质粒,对照组转染空白质粒;转染24h,采用实时荧光定量PCR法检测2组HCCLM3细胞FSTL5mRNA相对表达量,划痕愈合试验检测HCCLM3细胞迁移能力,Transwell小室法检测HCCLM3细胞侵袭能力,三维培养实验检测HCCLM3细胞伪足生长情况。结果FSTL5mRNA相对表达量在SMMC-7721(0.37±0.03)、HepG2(0.43±0.03)、HCCLM3(0.19±0.02)、MHCC97H(0.28±0.02)、PLC细胞(0.35±0.01)均低于LO2细胞(1.04±0.04)(P0.05),且在HCCLM3细胞表达量最低(P0.05);转染24h,转染组HCCLM3细胞FSTL5mRNA相对表达量(12.04±1.42)明显高于对照组(1.00±0.25)(P0.05),划痕愈合率[(24.7±2.4)%]、侵袭细胞数目[(11.7±2.3)%]均明显低于对照组[(86.7±3.7)%、(34.7±5.9)%](P0.05);三维培养实验结果显示,转染组HCCLM3细胞克隆球未见伪足生成,对照组可见少量伪足生成且延展性较好。结论 HCC细胞(SMMC-7721、HepG2、HCCLM3、MHCC97H、PLC)中FSTL5表达明显降低,过表达FSTL5可抑制HCCLM3细胞迁移和侵袭。     

甲状腺乳头状癌组织中Lemur酪氨酸激酶3对人TPC-1细胞增殖与迁移和侵袭能力的影响

目的探讨甲状腺乳头状癌(papillary thyroid carcinoma,PTC)组织中Lemur酪氨酸激酶3(lemur tyrosine kinase3,LMTK3)表达,及沉默LMTK3基因对人TPC-1细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。方法 PTC患者86例,手术切除PTC组织标本为PTC组,癌旁正常组织为对照组,采用实时荧光定量PCR法检测2组LMTK3mRNA相对表达量,分析LMTK3mRNA相对表达量与PTC病理特征的关系。取对数生长期人TPC-1细胞株,随机分为小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)-LMTK3组(转染LMTK3基因的干扰序列)、siRNA-对照组(转染siRNA对照序列)、空白组(不作任何处理),采用实时荧光定量PCR法检测3组转染48h时LMTK3mRNA相对表达量,采用Transwell法检测3组转染48h时细胞迁移、侵袭能力,采用MTT法检测3组转染后12、24、48、72、96h时细胞增殖能力。结果PTC组LMTK3mRNA相对表达量(1.71±0.08)高于对照组(1.07±0.12)(P0.05);PTC组LMTK3mRNA相对表达量在TNM分期Ⅲ~Ⅳ期(1.78±0.11)、有颈淋巴结转移(1.82±0.10)、有包膜侵犯者(1.78±0.12)高于TNM分期Ⅰ~Ⅱ期(1.62±0.08)、无颈淋巴结转移(1.56±0.07)、无包膜侵犯者(1.59±0.08)(P0.05);siRNA-LMTK3组转染48h时LMTK3mRNA相对表达量(0.25±0.05)低于siRNA-对照组(0.89±0.07)和空白组(0.92±0.08)(P0.05),siRNA-对照组与空白组比较差异无统计学意义(P0.05);3组转染12h吸光度(optical density,OD)值(0.21±0.02、0.19±0.04、0.20±0.03)比较差异无统计学意义(P0.05),siRNA-LMTK3组转染24、48、72、96h时OD值(0.27±0.06、0.40±0.04、0.44±0.06、0.58±0.05)均低于siRNA-对照组(0.42±0.08、0.53±0.07、0.61±0.13、0.78±0.08)和空白组(0.38±0.05、0.54±0.07、0.68±0.06、0.84±0.09)(P0.05),siRNA-对照组与空白组比较差异无统计学意义(P0.05);siRNA-LMTK3组转染48h时迁移细胞数目[(60.39±4.00)个]、侵袭细胞数目[(49.09±5.83)个]均较空白组[(118.42±6.18)、(95.97±3.09)个]和siRNA-对照组[(123.22±4.01)、(93.44±5.64)个]少(P0.05),空白组与siRNA-对照组比较差异均无统计学意义(P0.05)。结论 PTC组织LMTK3呈高表达,且其表达与肿瘤恶性程度有关;特异性沉默人TPC-1细胞中LMTK3基因表达可降低肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭能力。     

槲皮素对胃癌细胞SGC-7901上皮间质转化的抑制作用

目的探讨槲皮素对人胃癌细胞SGC-7901上皮间质转化的影响及机制。方法胃癌细胞SGC-7901分为对照组(普通培养液)、LY294002组(培养液+LY294002)、槲皮素组(培养液+槲皮素);采用MTT法检测槲皮素对胃癌细胞SGC-7901增殖的影响,依据细胞生长抑制率计算槲皮素对胃癌细胞SGC-7901的半数抑制浓度(median inhibitory concentration,IC_(50))值,参照IC_(50)值进行后续实验;采用划痕试验检测3组胃癌细胞SGC-7901增殖、迁移能力;采用Western blot法检测胃癌细胞AKT、p-AKT、Snail、Vimentin及E-钙黏附素(E-cadherin)蛋白表达情况;采用荧光定量PCR法检测3组胃癌细胞上皮间质转化相关因子Snail、Vimentin及E-cadherinmRNA的表达情况。结果槲皮素对胃癌细胞SGC-7901有明显的增殖抑制作用,其IC_(50)为(112.9±2.05)μmol/L;LY294002组胃癌细胞迁移距离[(0.16±0.03)mm]、槲皮素组胃癌细胞迁移距离[(0.15±0.02)mm]均低于对照组[(0.44±0.04)mm](P0.05),LY294002组与槲皮素组比较差异无统计学意义(P0.05);Snail、Vimentin、p-AKT蛋白表达水平在LY294002组(0.760±0.003,0.750±0.006,0.71±0.03)、槲皮素组(0.750±0.006,0.690±0.004,0.68±0.02)均明显低于对照组(1,1,1),E-cadherin表达在LY294002组(2.89±0.19)与槲皮素组(3.66±0.18)均高于对照组(1)(P0.05);LY294002组、槲皮素组、对照组AKT蛋白表达水平(1.03±0.02,1.02±0.01,1)比较差异无统计学意义(P0.05);Snail、Vimentin mRNA表达水平在LY294002组(0.72±0.02,0.78±0.03)、槲皮素组(0.71±0.01,0.79±0.03)均明显低于对照组(1,1),E-cadherin mRNA表达水平在LY294002组(2.51±0.08)、槲皮素组(2.77±0.16)均高于对照组(1)(P0.05);LY294002组Snail、Vimentin、E-cadherin mRNA及Snail、Vimentin、E-cadherin、p-AKT蛋白表达水平与槲皮素组比较差异均无统计学意义(P0.05)。结论槲皮素对人胃癌细胞SGC-7901上皮间质转化有抑制作用,其作用机制可能是抑制AKT信号通路。     

沉默Gab1抑制人胆管癌TFK-1细胞增殖的可能机制

目的探讨沉默Grb2相关结合蛋白1(Grb2-associated binding proteins 1, Gab1)提高放射线照射效果对人胆管癌TFK-1细胞增殖的抑制作用及可能机制。方法对数生长期人胆管癌TFK-1细胞随机分为放射组(转染小干扰RNA-NC质粒)、观察组(转染小干扰RNA-Gab1质粒)和对照组(转染小干扰RNA-NC质粒)。转染后培养48 h,放射组、观察组应用8 Gy X线照射24 h,对照组不进行X线照射。取X线照射24 h的细胞,采用CCK-8法检测细胞活力,平板细胞克隆形成实验检测细胞增殖能力,实时荧光定量PCR法检测Gab1 mRNA相对表达量,Western Blot法检测Gab1、PI3K、Akt蛋白相对表达量。结果 X线照射24 h,放射组、观察组细胞活力吸光度值(0.52±0.05、0.41±0.04)、细胞增殖形成的菌落数[(214.32±6.47)、(164.34±6.03)个]、Gab1 mRNA相对表达量(4.05±0.36、0.83±0.18)、Gab1蛋白相对表达量(3.05±0.36、2.03±0.18)、PI3K蛋白相对表达量(1.31±0.10、0.83±0.18)、Akt蛋白相对表达量(3.54±0.22、1.15±0.18)均低于对照组[0.65±0.04、(289.54±8.53)个、5.55±0.21、3.85±0.21、1.96±0.09、4.36±0.24](P0.05),且观察组低于放射组(P0.05)。结论沉默Gab1可提高放射线照射对人胆管癌TFK-1细胞活力及增殖的抑制作用,其机制可能与下调PI3K/Akt表达有关。     

辛伐他汀对高糖培养肾小管上皮细胞RANTES和TGF-β1表达的影响

目的:探讨高糖环境中人近端肾小管上皮细胞(HK-2)RANTES(regulated upon activation normal T cell expressed and secreted)和转化生长因子β1(TGF-β1)表达变化及辛伐他汀(Sim)的干预作用.方法:原代培养HK-2分为正常糖对照组(NG)、甘露醇组(MG)、高糖组(HG)、HG+ Sim 2 μmol/L干预组(HG+Sim2)、HG+Sim 4μmol/L干预组(HG+Sim4),RT-PCR法测定细胞RANTES和TGF-β1 mRNA表达,ELISA法检测细胞上清液中RANTES、TGF-β1蛋白含量.结果:RANTES、TGF-β1的mRNA和蛋白在NG及MG仅有少量表达,而在HG则明显升高(P＜0.05);加入Sim后,上述表达均较前下降(P＜0.05),具有浓度依赖性.各组HK-2表达的RANTES和TGF-β1无论是mRNA还是蛋白之间均存在显著正相关(P＜0.01).结论:高糖促进HK-2 RANTES、TGF-β1的表达,而Sim明显抑制高糖环境中上述因子的过度表达,发挥肾脏保护作用.     

肾上腺髓质素和转化生长因子β_1对肺成纤维细胞增殖及c-myc表达的影响

目的探讨肾上腺髓质素(adrenomedullin,AM)对转化生长因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)促肺成纤维细胞增殖及c-myc基因表达的影响。方法体外原代培养人胚肺成纤维细胞(human fetal lung fibroblasts,HFLFs),分为对照组、AM组、TGF-β1组和AM+TGF-β1组,采用MTT法观察各组光吸度(optical density,OD)值;各组提取细胞总RNA,采用反转录PCR观察c-myc基因mRNA表达情况。结果 AM+TGF-β1组HFLFs细胞培养24、48、72h时OD值(0.615±0.054、0.483±0.017、0.675±0.014)明显低于TGF-β1组(0.830±0.012、0.753±0.089、0.929±0.039)(P0.05),TGF-β1组HFLFs细胞培养72h时OD值(0.929±0.039)明显高于对照组(0.605±0.274)(P0.05),AM组HFLFs细胞培养24、48h时OD值(0.559±0.019、0.412±0.096)明显低于对照组(0.785±0.081、0.646±0.038)(P0.05);AM组c-myc mRNA相对表达量(0.450±0.025)明显低于对照组(P0.01);TGF-β1组c-myc mRNA相对表达量(1.160±0.100)高于对照组(P0.05);AM+TGF-β1组c-myc mRNA相对表达量(0.340±0.030)低于TGF-β1组(P0.01)。结论 AM能抑制肺成纤维细胞增殖和c-myc基因表达,AM可能具有抗纤维化作用。     

shRNA-FAM-38A基因对宫颈癌CS1213细胞增殖和迁移的影响

目的探讨shRNA-FAM-38A基因在宫颈癌CS1213细胞增殖和迁移中的作用。方法宫颈癌CS1213细胞分为空白对照组、阴性对照组和实验组。空白对照组细胞不转染慢病毒载体,阴性对照组细胞转染无序序列慢病毒载体,实验组细胞转染沉默shRNA FAM-38A慢病毒载体。采用实时荧光定量PCR法检测3组细胞FAM-38A、caspase-3和caspase-9 mRNA相对表达量,采用Transwell小室实验检测3组CS1213细胞迁移细胞数,采用CCK-8实验检测3组细胞增殖率。结果实验组细胞FAM-38A mRNA相对表达量(0.32±0.07)、迁移细胞数[(44.38±5.32)个]、细胞增殖率[(47.54±7.63)%]低于空白对照组[0.95±0.13、(99.72±19.63)个、(144.63±21.75)%]和阴性对照组[1.14±0.23、(119.63±21.87)个、(145.62±11.97)%](P0.05),caspase-3、caspase-9 mRNA相对表达量(5.11±1.21、12.64±2.87)高于空白对照组(0.84±0.09、0.22±0.03)和阴性对照组(0.89±0.12、0.21±0.04)(P0.05),空白对照组FAM-38A、caspase-3、caspase-9 mRNA相对表达量及迁移细胞数、细胞增殖率与阴性对照组比较差异均无统计学意义(P0.05)。结论 shRNA-FAM-38A基因可抑制宫颈癌细胞的增殖和迁移能力,可作为宫颈癌的潜在治疗靶点。     

miR-153-3p调控神经突的生长

目的探讨miR-153-3p在大、小鼠神经突生长中的作用。方法对数生长期C57BL/6小鼠N2A细胞和Rattus norvegicus大鼠PC12细胞,随机分为miR-153-3p过表达组(转染miR-153-3p过表达试剂miR-153-3p mimic)、miR-153-3p抑制组(转染miR-153-3p表达抑制剂miR-153-3p inhibitor)、过表达对照组(转染miR-153-3p mimic空白对照试剂miR-153-3p mimic NC)、抑制剂对照组(转染miR-153-3p inhibitor空白对照试剂miR-153-3p inhibitor NC)。转染48 h,采用实时荧光定量PCR法检测4组细胞miR-153-3p mRNA相对表达量,免疫荧光法检测神经突生长情况。结果 miR-153-3p过表达组N2A细胞、PC12细胞miR-153-3p mRNA相对表达量(28.98±1.63、19.67±0.88)均高于miR-153-3p抑制组(0.94±0.19、0.89±0.05)、过表达对照组(0.99±0.08、1.00±0.09)、抑制剂对照组(1.00±0.04、1.00±0.14)(P0.05),miR-153-3p抑制组、过表达对照组、抑制剂对照组比较差异均无统计学意义(P0.05);miR-153-3p过表达组N2A细胞、PC12细胞神经突总长度[(31.13±3.85)、(38.08±2.12)μm]和最长神经轴突长度[(18.04±2.58)、17.48±1.75)μm]均较miR-153-3p抑制组[N2A细胞:(54.53±1.83)、(31.74±2.36)μm;PC12细胞:(64.46±12.85)、(29.46±7.36)μm]、过表达对照组[N2A细胞:(42.53±6.29)、(24.99±3.47)μm;PC12细胞:(53.58±4.88)、(25.31±3.66)μm]、抑制剂对照组[N2A细胞:(41.33±2.77)、(24.57±3.86)μm;PC12细胞:(44.44±7.59)、(23.04±4.31)μm]短(P0.05),且过表达对照组、抑制剂对照组PC12细胞、N2A细胞神经突总长度和最长神经轴突长度较miR-153-3p抑制组短(P0.05),过表达对照组、抑制剂对照组比较差异无统计学意义(P0.05)。结论miR-153-3p可抑制小鼠N2A细胞、大鼠PC12细胞神经突生长。     

槲皮素对高糖培养海马神经元凋亡及Akt、p-Akt、Bcl-2、Bax蛋白表达的影响

目的探讨槲皮素对高糖培养海马神经元凋亡影响的可能作用机制。方法新生24 h Sprague-Dawley大鼠,取海马神经元原代培养,分为正常对照组、高糖组、槲皮素组、槲皮素+Akt抑制剂组和Akt激动剂组。各组在不同条件培养基中培养72 h后流式细胞仪检测细胞凋亡率,Western blotting检测各组神经元p-Akt、Akt、Bcl-2和Bax蛋白表达。结果与正常对照组相比,高糖组细胞凋亡率明显升高(P0.01),p-Akt/Akt和Bcl-2/Bax均明显减少(P0.01);与高糖组比较,槲皮素组、Akt激动剂组细胞凋亡率明显下降(P0.01),p-Akt/Akt和Bcl-2/Bax均明显升高(P0.01)。与槲皮素+Akt抑制剂组比较,槲皮素组细胞凋亡率明显下降(P0.01),p-Akt/Akt和Bcl-2/Bax均明显升高(P0.01)。结论槲皮素能够减少高糖培养下海马神经元的凋亡,其作用机制与增加Akt信号通路中Akt蛋白磷酸化的程度,进而增加Bcl-2蛋白的表达、抑制Bax蛋白的表达有关。