肝脏特异性可调控丙型肝炎病毒核心蛋白表达的转基因小鼠模型的建立

【目的】制备TRE-HCV-C转基因小鼠，为四环素调控系统的体内研究提供了反应部分的转基因小鼠。以便与本实验室同时建立的调控部分的小鼠共同作用，为进一步建立双转基因小鼠模型奠定基础，更为丙型肝炎病毒核心蛋白（HCV-C）的发病机制的研究提供一个实用方便的模型。【方法】重组构建含有目的基因HCV-C、TRE序列和SV40polyA的转基因载体pTRE-HCV-C．以显微注射的方法将l_153kb的转基因片段注人BALB／C母鼠的受精卵．出生动物及其后代经PCR初步筛选出阳性．再经Southern杂交对阳性鼠基因组DNA标本行进一步鉴定。用转基因阳性小鼠和整合有肝脏特异性启动子ApoE和胛A基因的另一品系转基因小鼠杂交，得到子代F1小鼠，通过免疫组织化学来初步检测HCV-C在肝脏中特异性的可调控性的表达。【结果】产生了5只整合有TRE-HCV-C基因的首建鼠，以及它的子代也带有此基因。与基因组上整合有肝脏特异性启动子ApoE和rtTA基因的转基因小鼠杂交后，得到子代F1小鼠。特定时问与DOX作用后，小鼠肝脏的免疫组织化学结果表明，TRE-HCV-C小鼠为丙型肝炎病毒核心蛋白的发病机制研究提供了一个良好的动物模型工具。【结论】成功制备了HCV-C转基因小鼠，可利用四环素调控系统来研究HCV中的C基因对小鼠的作用，为进一步建立四环素调控系统调控下表达HCV-C基因双转基因小鼠模型奠定基础．也是HCV-C基因功能研究及与肝细胞癌的关系的机制研究的一个有用工具。     

严密型四环素调控系统调控的表达HCV-C基因双转基因小鼠模型的建立

目的 制备严密型四环素调控系统调控下表达丙型肝炎病毒核心蛋白(HCV-C)基因的双转基因小鼠,为进一步阐明核心蛋白Core与HCV感染所致的疾病以及与肝细胞癌发生的关系奠定基础.方法 严密型四环素调控部分(ApoE-rtTA-tTS)转基因阳性鼠和反应部分(TRE-HCV-C)转基因阳性鼠交配产生仔鼠,经PCR和Southcm blot分析筛选出阳性鼠.免疫组织化学检测HCV-C蛋白双转基因小鼠肝组织内表达情况及其肝脏的病理变化.结果 得到了2只携带有两种基因(tTS和HCV-C)的双转基因小鼠,成功制备了严密型四环素调控系统的HCV-C双转基因小鼠.结论 结果表明,所建立的严密型四环素调控系统在动物模型中是可行的和有效的,它消除了普通四环素调控系统存在的本底泄漏表达的缺点,是HCV-C基因功能研究及与肝细胞癌的关系的机制研究的一个有用工具.     

乙型肝炎病毒核心抗原转基因小鼠的建立

目的：建立乙型肝炎病毒核心抗原（ayw亚型）转基因小鼠模型。方法：采用受精卵显微注射的方法制备转基因小鼠，以PCR、免疫组化和H－E染色法分析导入基因在小鼠基因组中的整合，肝脏中的表达及肝组织的病理变化。结果：得到6只基因组中整合了核心抗原基因的首建者（founder）小鼠，其中1只在肝细胞核和胞浆均有HBcAg的表达。将肝脏中表达的小鼠继续传代，F1代10只小鼠中的4只小鼠肝细胞有HBcAg的表达。结论：建立了乙型肝炎病毒核心抗原转基因小鼠，核心抗原基因能够在小鼠肝脏中表达，并且可以遗传。     

乙型肝炎病毒核心基因转基因小鼠的建立

目的：建立乙型肝炎病毒核心基因转基因小鼠。方法：构建乙型肝炎病毒核心基因真核表达载体pcDNA3-HBc;采用显微注射法将线性化的表达载体注射至小鼠受精卵的雄性原核巾,然后将注射存活的受精卵植入假孕母鼠的输卵管;取其产10d龄子代鼠进行鉴定。结果与结论：表达载体内切酶酶切及序列分析结果与预期一致;PCR鉴定转基因阳性小鼠比例为25％(6／24)。可表达核心蛋白基因的转基因小鼠成功建立。     

丙型肝炎病毒基因调控细胞模型的建立及其意义

丙型肝炎病毒基因调控细胞模型的建立及其意义李勇年王勤环斯崇文于敏刘芳华目前，在丙型肝炎的研究中，缺乏理想的丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）敏感细胞系和容易获得的感染动物模型，是影响ＨＣＶ深入研究的重要因素。我们构建了由ＨＣＶ５′非翻译区（５′ＵＴＲ）启动翻译报...     

不同缺失突变的丙型肝炎病毒核心蛋白基因在大肠杆菌中的表达

目的:构建丙型肝炎病毒(HCV)全长及3种不同缺失突变的核心蛋白基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中表达. 方法:用PCR方法扩增基因型为1b型的HCV核心蛋白的全长及3种不同缺失突变的基因片段,对应氨基酸分别为C573:1-191aa,C510:1-59aa 81-191aa,C507:1-169aa,C444:1-59aa 81-169aa. 将其克隆到高效表达载体pRSET-A中构成重组质粒(pRSET-A-C573,pRSET-A-C510,pRSET-A-C507,pRSET-A-C444),转化大肠杆菌BL-21(DE3)pLysS. IPTG诱导表达6×His融合蛋白,表达产物经SDS-PAGE及Western blot检测和鉴定. 结果:经酶切鉴定及测序证实全长及3种不同缺失突变的核心蛋白基因的原核表达载体构建正确. 经SDS-PAGE及Western blot显示在Mr约为21×103, 19×103, 19×103, 16.5×103处出现融合表达条带. 融合蛋白的表达量约占菌体蛋白总量的20%. 结论:全长及3种不同缺失突变的丙型肝炎病毒核心蛋白基因均在大肠杆菌中得到有效表达.     

丙型肝炎病毒核心蛋白基因的克隆及其高效表达

目的在大肠杆菌中表达丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白基因片段。方法利用PCR技术，扩增出357bp的HCV核心蛋白基因片段，双酶切后将其插入到原核表达载体pET-32a，构建重组表达质粒pET-32a／HCVc。转化到大肠杆菌BL21中，IPTG诱导表达。SDS-PAGE鉴定表达情况，Western blot鉴定表达产物的抗原性。结果 经IPTG诱导后获得了目的蛋白的融合表达；SDS—PAGE电泳显示其在32000处有一条融和表达条带；Western blot结果显示其具有HCV抗原特异性。结论 HCV核心蛋白在大肠杆菌中获得高效表达，而且表达产物有良好的抗原性。     

丙型肝炎病毒核心蛋白与转位蛋白相互作用的研究

目的 本文为了探讨丙型肝炎病毒（HCV）核心蛋白（core)在肝肿瘤中起作用的分子机制,研究核心蛋白是否与肿瘤相关蛋白的相互作用。方法 应用酵母双杂交系统3构建HCV核心蛋白诱饵质粒,转化酵母AH109后与含文库质粒的酵母Y187进行配合,在营养缺陷培养基上进行双杂交筛选。筛选出30个克隆,对既能在四缺营养缺陷培养基上生长（SD／-Trp-Leu-His-Ade),又能在涂有x-α-gal的四缺培养平皿上长出蓝色菌落,提取此酵母克隆的质粒转化大肠杆菌后测序,进行生物信息学分析。发现一个可以引起染色体转位的基因即与肿瘤发生有关的基因转位蛋白基因（Translin)同源。为了进一步证实转位蛋白基因所表达蛋白能与HCV核心蛋白相互作用,网织红细胞裂解物进行体外翻译、蛋白之间的免疫共沉淀。结果 结果显示,转位蛋白不但在酵母双杂交中能与HCV核心蛋白相互作用,而且在体外翻译后也能相互作用。结论 HCV核心蛋白可以和转位蛋白相互作用,推测此蛋白可能在HCV致癌中起一定作用,部分解释了HCV引起肿瘤的发病机制。     

四环素调控SV40Tag转基因小鼠模型的建立

目的构建四环素调控的SV40T转基因小鼠模型。方法同时显微注射外源基因p205-rtTA-C3和pTRE-Tag至FVB小鼠原核,注射受精卵移植到同期发情的假孕受体出生个体,经PCR和Southern检测获得阳性转基因小鼠。结果经PCR结合Southern检测得到rtTA和Tag双阳性转基因小鼠一只,rtTA单阳性两只和Tag单阳性一只。结论通过饮水给与四环素的双阳性小鼠可在卵巢中检测到Tag mRNA的表达。     

丙型肝炎病毒截短型核心基因表达载体的构建与表达

目的构建重组丙型肝炎病毒核心基因表达载体pVec-core,并进行原核表达。方法人工合成丙型肝炎病毒截短型核心基因至pUC57载体上,经双酶切后,将其克隆至原核表达质粒pVec中,测序正确后将重组质粒pVec-core转化入表达宿主菌BL21,经IPTG诱导表达核心蛋白,SDS-PAGE检测目的蛋白的表达情况。采用GST亲和层析方法纯化融合蛋白并进行Western印迹法验证。结果丙型肝炎病毒核心基因表达载体构建成功,重组菌表达出相对分子质量约为40.6 kD重组融合蛋白,并以可溶形式存在于菌体中。蛋白经谷胱甘肽琼脂糖凝胶纯化,得到纯度较高的目的蛋白。经Western印迹分析,该蛋白可与HCV患者阳性血清发生特异性结合反应,具有良好的抗原活性。结论核心抗原表达载体在原核表达系统中高效表达,为利用其作为诊断抗原及研究核心蛋白的其他生物学功能奠定了基础。     

基于四环素调控系统的ApoE-rtTA/TRE-HCV-C双转基因小鼠的制备

目的为了丰富现有的四环素调控系统的小鼠资源库,同时也为更好地研究目的基因HCV-C的作用机制提供一个活体的动物模型,制备基于四环素调控系统原理的调控部分ApoE-rtTA的转基因小鼠,与反应部分TRE-HCV-C转基因小鼠,相互交配制作出双转基因小鼠。方法应用显微注射法将构建好的两种基因片段ApoE-rtTA及TRE-HCV-C分别注入超排的昆明母鼠的受精卵,再植入假母输卵管,出生动物及其后代经PCR初步筛选出阳性,将两者及阳性后代交配产生携带5只转基因鼠再经Western blot和RT-PCR在RNA和蛋白水平上进一步鉴定。结果产生了3只整合有ApoE-rtTA基因的首见鼠和125只阳性子代,以及产生了5只整合有TRE-HCV-C基因的首见鼠和16只阳性子代。PCR及Southern Blot证实上述阳性鼠确有转基因整合。将两者交配产生携带5只双转基因鼠。结论成功制备了携带有ApoE-rtTA及TRE-HCV-C转基因小鼠,建立了分别携带有这两种基因的鼠群,以及同时携带有两种基因的双转基因小鼠,为四环素调控系统提供了一个良好的通用型的调控动物模型,同时也可利用四环素调控系统来研究HCV中的C基因对小鼠的作用,也是HCV-C基因功能研究及与肝细胞癌的关系的机制研究的一个有用工具。     

p21HBsAg/HBsAg转基因小鼠肝脏病理学研究

目的观察p21HBsAg/HBsAg转基因小鼠肝脏病理学改变.方法分别选取2、6、12、18、24月龄的SPF级p21HBsAg/HBsAg转基因小鼠和p21+/+野生型小鼠,剖检进行大体观察,取肝脏及肝脏肿瘤组织,进行组织学HE染色及电镜超微结构观察.结果 p21HBsAg/HBsAg转基因小鼠肝脏大体、光镜和电镜下均有明显病理改变.随着月龄的增加,肝脏色暗质硬,表面有结节和肿瘤形成;光镜下,肝细胞浊肿,炎症细胞浸润,脂肪变性,点状、灶状和碎屑状坏死,非典型增生,肝细胞癌.癌细胞分化良好,类似肝细胞,形成索状和腺泡状结构.癌细胞核深染,具核分裂像.电镜下,癌细胞核变形,核膜曲折凹陷,线粒体肿胀,数目增多,嵴减少.4例18月龄转基因小鼠发生肝细胞癌(4/10),6例24月龄的转基因小鼠发生肝细胞癌(6/10),其中2例发现远处转移.结论 p21HBsAg/HBsAg转基因小鼠肝脏出现明显病理损害,18月龄小鼠开始发展成高分化的肝细胞癌,高龄小鼠形成的肝细胞癌能够转移.     

CMV43CT转基因小鼠心血管发育的形态学研究

目的研究CMV43CT转基因小鼠心血管发育,探讨其用作先天性心脏畸形动物模型的可能性.方法 选用胚胎期(ED)12.5～17. 5 d的CMV43CT胎鼠,经HE染色,观察心脏的形态学变化.对生后不久死亡的CMV43CT纯合转基因小鼠在显微镜下进行大体解剖,观察心脏外形的变化并切片行HE染色.通过FCR方法鉴定基因型,普通C57BL6/SJ小鼠作为对照组.结果所有对照组胎鼠和CMV43CT杂合胎鼠均未见心脏畸形.见62只纯合胎鼠中有14只心脏畸形,占22.6%,主要为圆锥干发育畸形和室间隔缺损.其他畸形包括:心管环化异常及心室肌发育不良.12只生后不久死亡的CMV43CT纯合转基因小鼠大体解剖后发现均有室间隔裂和流出道囊等心脏畸形.切片染色发现左、右室流出道梗阻、房间隔缺损、室间隔缺损、心肌异常肥厚及心肌发育不良等畸形.结论 CMV43CT转基因小鼠存在以圆锥干发育异常为主的心血管畸形,可作为研究先天性心脏病的动物模型.     

ConA引起小鼠肝损伤实验研究

目的探讨conA引起免疫性肝损伤机实验条件。方法测定两个浓度，不同时间点ConA尾静脉注射后小鼠转氨酶水平及肝、脾病理变化。结果15mg／kgConA尾静脉注射后8h，血清转氨酶升高，但病检无明显改变；20mg／kgConA尾静脉注射，脾指数6h达峰值，10h肝脏病理变化显著，转氨酶水平达峰值。结论20mg／kgConA小鼠尾静脉注射6h后脾病变达高峰，10h可引起显著性肝损害。     

Tet—onAdvanced调控Amelotin基因表达成釉细胞系的建立

目的应用Tet-OnAdvanced。基因表达系统构建由强力霉素（D0x）诱导Amelotin基因表达的成釉细胞系,为进一步研究Amelotin基因的生物学功能奠定基础。。方法通过fIT—PCT法从出生后7d的小鼠牙胚中克隆得到Amelotin的全长基因,测序正确后将其亚克隆入pTRE-Tight裁体中,利用Tet—onAdvanced基因表达系统先后将调控质粒pTet—OnAdvanced和反应质粒pTRE-Tight-Amelotin转入成釉细胞,分别用G418和潮霉素进行筛选．克隆扩增得到可诱导表达Amelotin基因的成釉细胞系j用RT-PCR法检测不同Dox浓度下转染成釉细胞中Amelotin基因的表达。结果连续两个回合的转染及筛选后获得了引入pTet-onAdvanced系统的细胞系,能够高诱导低背景表达Amelotin,在强力霉素诱导48h可从使Amelotin的表达显著增加,强力霉素在一定浓度范围内可以诱导Amelotin的表达呈剂量依赖性增加。结论成功构建了受强力霉素调控的双重稳定表达Amelotin．成釉细胞系,为进一步研究Amelotin与釉质矿化之间的关系奠定了基础。     

慢病毒载体法制备红色荧光蛋白转基因小鼠

目的利用慢病毒介导的转基因方法制备红色荧光蛋白(mRFP)转基因小鼠,并建立转基因小鼠的技术平台。方法将携带mRFP基因的慢病毒注入ICR鼠单细胞受精卵卵周隙以感染受精卵,胚胎移植进假孕母鼠以获得仔代鼠,然后应用小动物活体成像仪、体视荧光显微镜和PCR等鉴定并获得mRFP转基因鼠。结果移植卵周隙注射有慢病毒的胚胎40枚给2只假孕母鼠,共获得仔鼠6只;利用体视荧光显微镜检测mRFP表达,在蛋白水平证实6只F0代中,2只(R3和R4)鼠耳高表达mRFP,其余的弱表达mRFP(R1、R2和R5)或荧光强度(R6)与野生型ICR鼠无明显差别,而DNA水平检测证实,6只F0代中,5只(R1、R2、R3、R4和R5)基因组中整合有外源转基因hUb-mRFP,预示基因型鉴定结果很好验证了体视荧光显微镜鉴定结果。此外,mRFP转基因首建鼠基因组中整合的mRFP基因可稳定遗传和表达。结论建立了慢病毒法快速制备转基因小鼠的技术平台,这为针对不同基因建立相应转基因小鼠以实现恒定或条件性的转基因过表达或RNA干涉(RNAi),并进而在体内解析相应基因功能和建立人类疾病模型等奠定了坚实基础。     

建立转bcl-xL基因小鼠的研究

目的 建立转bcl—xL基因小鼠，继而传代建系，用于缺血性脑血管疾病的研究。方法 采用显微注射法，将人bcl—xL基因注入民明小白鼠受精卵获得子代鼠，然后作PCR、Southern—blot、mRNA、Western—blot检测以获得阳性鼠。结果 实验中注射受精卵1654枚，移植卵数1448枚，受体鼠49只，怀孕鼠7只，子代鼠13只，整合4只并均有表达。注射受精卵的存活率87．54％，受精卵的总存活率0．78％，受体鼠的怀孕率14．28％，整合效率30．77％，总有效率为0．24％。结论 获得了转bcl—xL基因小鼠，但转基因的效率较低，表达不稳定。     

转人组织蛋白酶K基因鼠系的PCR检测

目的用PCR技术检测转人组织蛋白酶K基因鼠系,筛选携带目的基因的阳性小鼠。方法用PCR技术,对显微注射后出生的转人组织蛋白酶K基因小鼠、首建鼠的F1、F2、F3及F2代与野生型ICR小鼠的回交后代进行检测。结果共检测显微注射后出生的小鼠25只,阳性为1只,阳性率为4%;检测F1、F2、F3代小鼠分别为60、77和69只,阳性仔鼠数为35、56和63只,阳性率分别为550%、727%和913%;对回交后代进行检测,未见纯合的F2代小鼠。结论外源基因(人组织蛋白酶K基因)已经整合到小鼠的染色体上,并且按孟德尔遗传定律中的分离定律进行遗传。