树突状细胞融合瘤苗抗胶质瘤的实验研究

目的观察树突状细胞（dendritic cells，DC）融合瘤苗防治C6胶质瘤的疗效，对其抗肿瘤作用机制进行初步探讨。方法采用PEG化学融合方法制备融合瘤苗，流式细胞技术分选瘤苗，对融合瘤苗进行免疫组化和功能学鉴定；立体定向制备大鼠颅内C6肿瘤模型，荷瘤后5d经尾静脉注射10^7融合瘤苗、10^7DC以及100μl PBS，分别设为A、B、C三组，采用Log—rank对数秩检验进行生存分析，对肿瘤标本进行病理学检查。结果实验中DC具有典型的树突状结构，OX62特异性标志物阳性表达；融合瘤苗GFAP—FITC免疫荧光检查阳性；Log—rank生存分析数据对数秩检验表明A组与B、C组比较均有统计学意义（P〈0．01）；A组晚期死亡大鼠（〉31d）HE染色见较多的炎性细胞浸润，CD8^＋Mcab免疫组化染色阳性。结论PEG法可有效制备DC／C6融合瘤苗，融合瘤苗能够有效的发挥抗肿瘤效果，CD8^＋T细胞参与颅内抗胶质瘤免疫反应。     

自体树突状细胞肿瘤疫苗治疗脑胶质瘤的临床初步观察

目的 本研究自体树突状细胞肿瘤疫苗治疗人类脑胶质瘤的临床效果，并探讨其应用前景。方法 将41例病理证实的脑胶质瘤患分为3组，试验组9人接受自体树突状细胞肿瘤疫苗治疗，阳性对照组17人接受全肿瘤组织匀浆疫苗治疗，阴性对照组15人，手术后仅接受放疗。结果 随访结果显示，试验组中位数生存时间大于22个月，阳性对照组为16个月，二均高于阴性对照组(7个月)。生存分析示3组间的生存曲线分布差异有显性意义。结论 自体树突状细胞肿瘤疫苗和全肿瘤组织匀浆疫苗可抑制脑胶质瘤的复发和进展，从而有效地延长脑胶质瘤患的生存时间，且前较后具有更好的疗效，有良好的临床应用前景。     

胶质瘤树突状细胞融合疫苗诱导抗肿瘤细胞毒性T淋巴细胞

在本研究中,我们检测树突状细胞(DC)与胶质瘤细胞U87融合是否会产生融合细胞,并确定此融合细胞是否会于体外诱导产生胶质瘤细胞U87特异性的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。一、材料与方法1. 培养产生树突状细胞:从基因型为HLAA0201的健康人外周血中得到的单核细胞。分离CD14 单核细胞,重悬于10mlX-VIVO15培养液中,加入GM-CSF和IL-4。第5天,移走一半培养液,并加入相同体积的含有细胞因子GM-CSF和IL-4的新鲜培养液。第7天,应用冷的Hanks液收集DC并将其用做抗原递呈细胞。2. 树突状细胞的表型分析:在培养的第7天,流式细胞仪(FCM)检…     

凝胶侵袭模型对胶质瘤细胞体外侵袭力研究的应用初探

目的 初步探讨凝胶侵袭模型用于人胶质瘤细胞体外侵袭力研究的可行性,观察普通培养的胶质瘤细胞与胶质瘤干细胞在凝胶侵袭模型中侵袭力的差异,为胶质瘤的体外研究寻求新的实验手段.方法 经纯化的Ⅰ型和Ⅲ型胶原与MEM培养基混合制备凝胶液,将原代培养的胶质瘤细胞经悬滴法制成的细胞球和胶质瘤干细胞所形成的细胞球种植于其中,每个细胞球含(10-15)×103个细胞,在添加含有不同药物浓度基质金属蛋白酶抑制剂GM6001(0、25、50、75、100μmol/L)的相应培养基中培养4 d,测量不同药物浓度组肿瘤细胞侵袭距离及其差异.结果 不同处理组胶质瘤细胞在凝胶侵袭模型中生长良好,最初的细胞球形态呈规则圆形,随着时间的推移肿瘤细胞侵袭距离逐渐增加;且对GM6001的抑制作用表现出不同程度的剂量依赖性,以75 μmol/L GM6001对普通培养的胶质瘤贴壁细胞的侵袭抑制作用最为明显(均P=0.000);而25μmol/L GM6001对胶质瘤干细胞球的侵袭抑制作用最显著(P=0.002,0.012,0.000).结论 凝胶侵袭模型适用于普通贴壁培养的胶质瘤细胞和胶质瘤干细胞球.     

胶质瘤的免疫治疗

脑胶质瘤的免疫治疗,尤其是以树突状细胞为基础的主动免疫治疗在基础研究和临床试验中均已显示出良好的疗效.免疫治疗可能成为除手术、化疗和放疗以外治疗胶质瘤和防止肿瘤复发的手段.     

热诱导凋亡胶质瘤细胞致敏树突状细胞疫苗的制备与鉴定

目的 制备热诱导凋亡胶质瘤细胞致敏树突状细胞疫苗,探讨其增强树突状细胞抗原递呈、诱导细胞毒性T淋巴细胞产生更强肿瘤细胞杀伤作用的机制.方法 采用改良Inaba法,在重组小鼠粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(rmGM-CSF)和重组小鼠白细胞介素-4(rmIL-4)作用下,体外诱导扩增小鼠骨髓来源的树突状细胞,电子显微镜和流式细胞术检测其生物学特征;分别以不同加热温度处理U251细胞,制备凋亡U251细胞致敏树突状细胞疫苗,3H-TdR掺入法和MTT法检测T淋巴细胞增殖能力和活化细胞毒性T淋巴细胞杀伤率.结果 在rmGM-CSF和rmIL-4作用下,小鼠骨髓来源细胞体外培养6～7 d即可诱导出树突状细胞,经倒置相差显微镜和电子显微镜证实细胞表面呈典型树突状结构;流式细胞术检测证实其表达特异性表面标记物CD11c,同时表达功能相关性抗原CD80、CD86和MHCⅡ.倒置相差显微镜和流式细胞术确定热诱导U251细胞凋亡的最佳条件为:44℃处理3 h再常规培养12 h,凋亡U251细胞可更好地负载树突状细胞,负载的树突状细胞可以激发T淋巴细胞增殖,诱导活化细胞毒性T淋巴细胞具有更强的杀伤肿瘤细胞的能力.结论 在rmGM-CSF和rmIL-4作用下,经体外成功制备的小鼠骨髓来源的树突状细胞,可热诱导凋亡胶质瘤细胞敏敏树突状细胞疫苗于体外有效激发T淋巴细胞增殖,诱导细胞毒性T淋巴细胞产生较强的杀伤肿瘤细胞能力.     

苯丁酸钠诱导分化治疗可移植性人脑胶质瘤实验研究

目的 探讨诱导分化剂苯丁酸钠与化疗药顺铂联合治疗可移植性人脑胶质瘤的剂量及疗效。方法 将低分化人脑胶质瘤体外细胞系SHG-44-9移植于裸小鼠,制作可移植性实体瘤模型后,用不同剂量的苯丁酸钠单独或与顺铂联合治疗,观察实体瘤的体积、组织细胞形态和胶质纤维酸性蛋白表达量的变化。结果 当苯丁酸钠增加至300mg·kg-1,每天2次腹腔注射时,肿瘤生长明显受抑（P<0.001）,组织细胞形态和胶质纤维酸性蛋白表达与对照组相比显示其分化程度增高,但与顺铂联用未显示出疗效的增加。结论 苯丁酸钠具有明显的促进人脑胶质瘤细胞分化的作用。     

肿瘤干细胞致敏的树突状细胞对脑胶质瘤细胞免疫的影响

目的 研究肿瘤干细胞(BTSCs)致敏的树突状细胞(DCs)疫苗对颅内荷瘤小鼠的治疗作用.方法 无血清培养基中加入表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子,将C6胶质瘤细胞诱导成胶质瘤干细胞,以此致敏大鼠骨髓来源的树突状细胞制备疫苗;立体定向建立大鼠颅内C6胶质瘤模型,分为A、B、C、D四组.每组分别经尾静脉注射1×107BTSCs致敏的DCs(DCs-BTSCs)、1×107 C6胶质瘤细胞致敏的DCs(DCs-C6)、1×107DCs及PBS,Kaplan-Meier法对大鼠生存情况进行分析,大鼠脑组织标本行HE染色及免疫组化分析.结果 胶质瘤干细胞CD133+及nestin染色阳性;DCs具有典型的树突状结构,特异性标志OX62+表达阳性;生存时间A组较其他组明显延长,Log-rank检验差异有统计学意义(P＜0.05);A组HE染色炎性细胞浸润最多,免疫组化可见较多的CD8+T淋巴细胞.结论 肿瘤干细胞致敏的树突状细胞疫苗能明显提高机体对胶质瘤的免疫力,其作用优于胶质瘤细胞致敏的树突状细胞疫苗,为树突状细胞疫苗的临床应用提供了新的依据.

Abstract：

Objective To investigate the effect of dendritic cells pulsed with brain tumor stem cells which are used to treat on intracranial glioma.MethodWe obtained murine brain tumor stem cells by growing C6 cells in epidermal growth factor/basic fibroblast growth factor without serum.Dendritic cells isolated from rat bone marrow were pulsed with BTSCs.Rat brain glioma models were established by stereotactic technique.107 DCs pulsed with BTSCs and C6 were injected through tail vein in group A and group B respectively.The same number of DCs and the same volume PBS were applied to group C and group D.The survival time of rats was analyzed by Log- rank survival analysis.Tumor samples were examinedwithHE staining and immunohistochemistry.Methods BTSCs expressedCD133 + and nestin.DCs appeared typical long dentrite in morphology and expressed OX62+ markers.The survival analysis showed group A was statistically significant in constrast to the other goups (P<0.05).The tumors in group A have the most inflammation and CD8 + T lymphocytes.Concluion DCs loading with BTSCs lysates can provide a higher level of immunity protect against gliomas than those loading with C6 cells,which provide a new method in the immuntherapy of brain glioma.     

人脑胶质瘤肿瘤干细胞的培养及鉴定

目的:从人胶质瘤中分离并鉴定肿瘤干细胞。方法:用神经干细胞无血清培养方法从胶质瘤中分离出具有单细胞克隆能力的细胞球,通过核型分析证明其肿瘤特性,用MTT法检测单克隆细胞增殖能力,应用免疫组织化学的方法检测克隆细胞nestin抗原和分化后相关神经细胞特异性抗原的表达。结果:所获得的细胞球具有连续克隆的能力,nestin抗原阳性,并具有肿瘤核型,分化后的细胞表达星形胶质细胞和神经元特异性抗原。结论:成功培养出脑胶质瘤肿瘤干细胞,该细胞具有自我更新、多向分化和很强的增殖能力等干细胞的特征。     

抗人脑胶质瘤单克隆抗体的制备及识别抗原的提取

目的：制备新的抗人脑胶质瘤单克隆抗体（monoclonal antibody,McAb)，并提取其识别抗原。方法：以人脑恶性胶质瘤细胞系SHG－44为抗原免疫Balb/c小鼠，通过杂交瘤技术获得稳定分泌抗胶质瘤McAb的杂交瘤细胞株。以酶联免疫吸附测定及免疫组化等方法研究McAb的特性。通过亲和层析法提取该McAb识别的抗原。结果：得到1株稳定分泌抗体、效价高的杂交瘤细胞株，命名为SU－2000。鉴定表明该McAb属IgGl亚类，效价高，特异性高。识别的抗原位于胞膜，可能属于神经外胚层抗原；通过亲和层析法成功地提取出该抗原，十二脂硫酸3钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳证实提取的抗原纯度高，分子量约为75kDa。结论：SU－2000 McAb及其识别抗原可进一步用于相关实验研究。     

树突状细胞瘤苗抗脑胶质细胞瘤作用体外实验研究

目的通过体外实验探讨应用树突状细胞制备的肿瘤疫苗抗脑胶质瘤的作用机制.方法培养大鼠树突状细胞,冻融法制备胶质瘤抗原,以肿瘤抗原致敏树突状细胞而制备胶质瘤疫苗.将实验动物分为4组,分别将胶质瘤疫苗、树突状细胞、生理盐水注入正常大鼠体内,到达预定时间取出大鼠脾脏,四噻唑蓝(MTT)法检测大鼠淋巴细胞活性.结果一次输入胶质瘤疫苗的正常大鼠的淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤活性明显低于3次输入胶质瘤疫苗的正常大鼠;比较输入培养8 d的树突状细胞和输入生理盐水的大鼠,其淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤活性无统计学差异.结论应用树突状细胞制备胶质瘤疫苗可明显激活体内抗肿瘤免疫反应.     

树突状细胞的培养及其诱导的神经胶质瘤体外杀伤作用研究

目的　研究负载肿瘤抗原的树突状细胞 (DCs)活化的特异性细胞毒性T淋巴细胞 (CTLs)对神经胶质瘤细胞的体外杀伤效应 ,探讨其用于临床治疗的可行性。方法　体外原代培养 12例胶质瘤细胞 ,冻融法获取胶质瘤细胞抗原 ,联合应用粒细胞 /巨噬细胞集落刺激因子、白细胞介素 4和肿瘤坏死因子 α等 ,对人外周血单核细胞进行体外诱导来获取DCs并负载肿瘤抗原 ,激活自体T淋巴细胞 ,制备特异性CTLs,MTT法检测对胶质瘤细胞的体外杀伤效应。结果　负载胶质瘤抗原的DCs激活的CTLs对胶质瘤细胞有明显的杀伤作用 ,显著高于K5 6 2细胞对照组 ,并且杀伤率随着效靶比的增加而增加。结论　从人外周血中诱导的DCs负载胶质瘤抗原后 ,激活的CTLs在体外对胶质瘤能产生高效的杀伤作用 ,为临床应用DCs瘤苗奠定基础     

干细胞样抗原提高树突状细胞介导胶质瘤免疫治疗的体外研究

目的 比较胶质瘤干细胞样抗原与非干细胞样抗原致敏树突状细胞(DCs)疫苗对胶质瘤的体外作用.方法 体外用无血清法和血清法培养恶性胶质瘤细胞,有限稀释法检测其克隆形成率;冻融法获取相应胶质瘤抗原;GM-CSF、IL-4体外诱导人外周血单核细胞获取DCs,与抗原孵育后再激活T淋巴细胞,同位素法检测效应细胞对胶质瘤细胞的杀伤率;流式细胞术检测DCs表面分子变化以及非贴壁细胞中T细胞比例的变化.结果 无血清培液中的胶质瘤细胞具有更高的克隆形成率(P<0.01);DCs经不同抗原刺激后HLA-A、HLA-DR、CD80、CD86表达上调(P<0.01);非贴壁细胞与DCs共培养后T细胞比例明显增高;干细胞样抗原激活的效应细胞对非干细胞样细胞和干细胞样细胞杀伤率分别为(70.2±5.13)%和(56.7±7.81)%(P<0.001),而非干细胞样抗原活化的效应细胞相应的杀伤率为(36.6±6.45)%和(9.05±3.49)%(P<0.001).结论 无血清培养液中的胶质瘤细胞具有更强的增殖能力,胶质瘤干细胞样抗原较传统抗原具有更强的抗原性,为进一步提高胶质瘤DCs疫苗疗效奠定基础.     

肿瘤RNA冲击致敏树突状细胞治疗G422胶质母细胞瘤的实验研究

目的 研究G422肿瘤细胞RNA体外冲击致敏的树突状细胞（DC）回输诱导体内产生保护性免疫反应及对颅内荷瘤小鼠的免疫治疗效应，探讨以DC为基础的疫苗对脑胶质瘤治疗的可行性。方法 提取G422胶质母细胞瘤RNA冲击致敏DC制成疫苗，分别进行免疫保护和免疫治疗的体内实验，以及细胞毒性T淋巴（CTL）体外诱导及活性检测，并与PBS，未经致敏的DC，G422肿瘤细胞RNA组进行对照。结果 疫苗能诱导产生针对G422肿瘤抗原特异性CTL，具有非常显著性差异（P＜0．01），接种疫苗后的小鼠能抵抗G422的再次攻击（P＜0．01），疫苗组生存期较对照组延长（P＜0．05）。结论 肿瘤RNA体外冲击致敏DC，然后将之回输免疫接种至颅内荷瘤小鼠能显著地诱导机体产生抗原特异性CTL，激活抗肿瘤T细胞，具有免疫保护和免疫治疗作用，为DC疫苗免疫治疗胶质瘤提供了实验基础及理论依据。     

凋亡肿瘤细胞抗原致敏的树突状细胞瘤苗治疗大鼠颅内胶质瘤的实验研究

目的观察凋亡肿瘤细胞抗原致敏的树突状细胞(dendriticcell,DC)瘤苗对颅内胶质瘤免疫治疗的效果。方法通过立体定向接种建立Wistar大鼠C6胶质瘤动物模型;从大鼠骨髓分离DC前体细胞,经重组大鼠粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(rrGM-CSF) 白细胞介素4(rrIL-4)诱导培养、扩增获得功能性DCs;DCs经采用热诱导凋亡的C6胶质瘤细胞体外致敏后皮下回输荷瘤大鼠体内,1次/周,共5次。观察荷瘤大鼠的存活期,MRI观察颅内肿瘤生长情况,循环血中CD8 T淋巴细胞水平及体外细胞毒反应、增殖反应均以流式细胞仪检测。结果经过治疗的荷瘤大鼠生存期明显延长,MRI显示实验组大鼠肿瘤被明显抑制,外周血中CD8 T淋巴细胞比例增加,体外细胞毒试验提示经凋亡肿瘤细胞抗原致敏的DC瘤苗可以诱导针对C6胶质瘤的特异性细胞毒性T淋巴细胞,并且未观察到自身免疫反应的发生。结论经凋亡肿瘤细胞抗原致敏的DC瘤苗对于颅内胶质瘤是一种安全有效的治疗方法。     

树突状细胞治疗脑胶质细胞瘤实验研究

目的研究树突状细胞疫苗瘤内注射对胶质瘤的治疗作用.方法建立大鼠C6脑胶质瘤皮下和颅内肿瘤模型,通过第一组为瘤内注射树突状细胞(DC)、第二组为腹部皮下注射DC、第三组为对照组,观察肿瘤生长情况和大鼠生存时间,比较细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的活性,并进行病理学检查.结果治疗组大鼠表现为肿瘤生长部分抑制,生存时间明显延长,与对照组比较,有极显著差异(P<0.01),瘤内注射DC和腹部皮下注射C6冻融抗原致敏DC,两治疗组间无显著性差异(P＝0.60);CTL杀伤活性增强,和对照组比较有显著性差异(P<0.05).双侧皮下种植的肿瘤治疗一侧后,生长均受到抑制,并逐渐缩小.结论瘤内注射DC治疗脑胶质瘤是一种新的、有效的免疫治疗策略.     

靶向脑胶质瘤干细胞的树突状细胞疫苗治疗恶性脑胶质瘤的体外实验研究

目的 研究应用脑胶质瘤干细胞抗原制备的树突状细胞(DC)疫苗对胶质瘤细胞的杀伤作用.方法 反复冻融法获得源于胶质瘤细胞系U251中的肿瘤干细胞的胞溶物,和源于小鼠间充质干细胞的DC共培养,获得胶质瘤干细胞疫苗.流式细胞仪检测疫苗表面标志变化;CCK-8法检测其促T细胞增殖能力以及对胶质瘤细胞的靶向杀伤作用;ELISA法检测培养基中干扰素-γ的含量.用热处理U251细胞制备的DC疫苗作为对照组.结果 与对照组相比,脑胶质瘤干细胞疫苗的CD80、CD86、CD11c和MHC Ⅱ等表面标志表达显著提高,具有更强的促T细胞增殖能力(P＜0.01),对U251细胞特异性靶向杀伤率随效靶比的提高而增加,最高为(78.508±4.156)％,相应的干扰素-γ分泌水平也达到最高.结论 胶质瘤干细胞疫苗能更有效地诱导特异性细胞毒性T细胞,表现出更强的抗肿瘤特性.     

负载hTERTC27基因的树突状细胞对胶质瘤细胞的杀伤效应

目的 探讨负载hTERTC27基因的树突状细胞(dendritic cells,DCs)治疗胶质瘤的可行性.方法 利用重组腺病毒(recombinant adenovirus,Adv)将hTERTC27基因转染到DCs,Western blot杂交鉴定hTERTC27蛋白的表达.实验分为3组:hTERTC27转染的DCs,单纯强化绿荧光蛋白(EGFP)转染的DCs和单纯的DCs.CCK8法检测各组DCs对淋巴细胞的增殖作用及诱导的细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocytes,CTL)对胶质瘤细胞U87的杀伤活性,ELISA法检测T细胞上清中白介素-2(IL-2)和干扰素-γ(IFN-γ)的表达.结果 hTERTC27转染的DCs组对T细胞的增殖作用以及T细胞上清IL-2、IFN-γ的浓度均高于其余两组,当效靶比为40∶1时,这组T细胞对U87的杀伤率(50.4% ± 2.95%),也明显高于EGFP转染DCs组(38.0% ± 1.81%)以及单纯DCs组(33.7% ± 2.03%)(P ＝ 0.001).结论 hTERTC27基因转染的DCs能诱导CTL反应,对端粒酶阳性的U87具有显著的杀伤效应.