三维共培养免髓核细胞诱导骨髓间充质干细胞分化

背景:在椎间盘组织工程研究领域,种子细胞主要有髓核细胞与骨髓间充质干细胞.髓核细胞来源有限,取材不便,增殖能力差,体外培养困难.目的:利用海藻酸盐微球模拟的三维环境下,将兔髓核细胞与骨髓间充质干细胞共培养,观察骨髓间充质干细胞的分化情况.设计、时间及地点:细胞观察实验,于2007-12/2008-10在华中科技大学同济医学院附属同济医院骨科实验室进行.材料;4月龄健康新西兰大耳白兔6只,购自华中科技大学同济医学院动物实验中心.方法:应用密度梯度离心法及贴壁法分离纯化兔骨髓间充质干细胞,应用Ⅱ型胶原酶消化法及贴壁法分离培养兔椎间盘髓核细胞.取传至第3代骨髓间充质干细胞,用脂质体介导法将绿色荧光蛋白质粒转入,经G418筛选后,分为2组:单独培养组将转染后的骨髓间充质干细胞单独培养,共培养组将其与髓核细胞按1:1比例于海藻酸盐凝胶微球中进行共培养.共培养14 d后,溶解海藻酸盐凝胶珠,通过流式分选收集骨髓间充质干细胞.主要观察指标:利用RT-PCR法和Westernblot技术检测骨髓间充质干细胞中Ⅱ型胶原、聚集蛋白聚糖的表达.结果:共培养14 d后,共培养组有Ⅱ型胶原、聚集蛋白聚糖mRNA及蛋白的表达,而单独培养组均呈阴性表达.结论:通过三维共培养,兔椎间盘髓核细胞能够在体外诱导骨髓间充质干细胞向髓核样细胞方向分化.     

纳米晶胶原基骨修复材料与兔骨髓间充质干细胞体外复合培养

背景:纳米晶羟基磷灰石胶原基骨修复材料具有与天然骨成分接近,结构和形貌图谱分析与天然骨相似,生物相容性好等特点,且材料多孔,孔径较大、孔隙率及孔隙交通率高,符合作为骨组织工程支架材料的要求.目的:观察兔骨髓间充质干细胞与纳米晶胶原基骨修复材料体外复合培养的结合程度.设计、时间及地点:体外观察实验,于2006-03/09在江苏大学医学院细胞实验室完成.材料:健康雄性新西兰大白兔1只,1月龄.纳米晶胶原基骨修复材料由清华大学材料系提供.方法:体外分离培养、纯化兔骨髓间充质干细胞,取第3代骨髓间充质干细胞与纳米晶胶原基骨体外复合培养.主要观察指标:①兔骨髓间充质干细胞生长形态及生长曲线.②复合培养5,10 d后扫描电镜观察二者复合程度.③复合培养5,10 d时纳米晶胶原基骨修复材料上结合的细胞数量.结果:兔骨髓间充质干细胞贴壁生长,增殖速度快,生长曲线符合Logistic生长曲线,兔骨髓间充质干细胞与纳米晶胶原基骨体外复合培养,在第5,10天进行扫描电镜观察,发现10 d时黏附于纳米晶胶原基骨上的骨髓间充质干细胞数明显高于5 d时黏附的细胞数,差异有显著性意义(P<0.01).结论:兔骨髓间充质干细胞与纳米晶胶原基骨体外复合培养结合程度较高.     

骨髓间充质干细胞成骨分化中血管内皮生长因子和骨形态发生蛋白2的表达☆

背景:有研究表明血管内皮生长因子可促进内皮细胞增殖、分化和迁移,而骨髓间充质干细胞经诱导分化后细胞自身的血管内皮细胞生长因子及骨形态发生蛋白2如何表达,却鲜见报道. 目的:观察兔骨髓间充质干细胞成骨诱导分化过程中血管内皮细胞生长因子和骨形态发生蛋白2的表达. 方法:取第3代新西兰大白兔骨髓间充质干细胞,1 d后将细胞分为两组:对照组不更换培养基;诱导组加入成骨诱导培养基进行成骨诱导,流式细胞仪检测其表面抗原.RT-PCR和Western-Blot检测细胞成骨分化过程中血管内皮细胞生长因子和骨形态发生蛋白2的表达. 结果与结论:兔骨髓间充质干细胞成骨诱导后,细胞形态由长梭形逐渐变为短梭形,多角形,最后成集落层叠生长;在诱导过程中,碱性磷酸酶活性逐渐增高,与对照组比较有显著性差异(P<0.05);诱导7 d时Ⅰ型胶原免疫细胞化学染色、14时骨钙素免疫细胞化学染色、21 d时钙化结节染色阳性;RT-PCR和Western-Blot结果显示两组均有骨形态发生蛋白2和血管内皮细胞生长因子表达,诱导后第7,14,21天表达比较,差异有显著性意义(P<0.05),第7天,两者表达最强.说明兔骨髓间充质干细胞分离、提取操作简便易行,且有较强的生长增殖能力,可诱导分化为成骨细胞.其在成骨诱导过程中,骨形态发生蛋白2和血管内皮生长因子表达均先增强后减弱,血管内皮细胞生长因子表达可能对血管生成有促进作用.     

兔激素性股骨头坏死模型骨髓间充质干细胞的培养

背景:自体干细胞移植治疗已经成为目前组织工程和再生医学研究的重点。但对于兔激素性股骨头坏死模型自体骨髓移植中骨髓间充质干细胞的体外培养研究鲜有报道。目的:抽提兔激素性股骨头坏死模型的骨髓间充质干细胞,并行体外扩增和表型鉴定。方法:取成年大耳白兔10只,对照组2只不给任何药物;模型组8只每周2次臀肌注射甲基强的松龙8mg/kg制备兔激素性股骨头坏死模型。体外分离培养骨髓间充质干细胞;应用流式细胞仪分别检测第4代骨髓间充质干细胞表面抗原CD29、CD34、CD44的表达。结果与结论:经过大量激素作用后,MR灌注成像及病理切片结果显示兔激素性股骨头坏死模型组造模成功。模型组原代骨髓间充质干细胞4h内仅有少量细胞贴壁,12d左右细胞铺满瓶底的85%-90%,传代培养生长良好;第4代骨髓间充质干细胞生长曲线呈典型S型,第4-7天处于高速增殖期,与对照组生长曲线相近;经流式细胞术鉴定,第4代骨髓间充质干细胞表面抗原CD34表达呈阴性,CD29,CD44表达呈阳性,证明所培养的细胞为较纯的骨髓间充质干细胞。提示兔激素性股骨头坏死模型的骨髓间充质干细胞具有较强的生长和增殖能力,可用于干细胞标记及进一步自体移植治疗。     

Ⅰ型胶原修饰聚乳酸聚乙醇酸微球支架上骨髓间充质干细胞的黏附和成骨分化

背景:组织工程骨成骨功能终末细胞需要骨髓间充质干细胞在体外加以诱导或在体内以基因转染等技术加以诱导。目的:研究Ⅰ型胶原修饰的聚乳酸聚乙醇酸微球支架上骨髓间充质干细胞黏附和成骨分化的能力。方法:制备聚乳酸聚乙醇酸微球支架,分离纯化雌性SD大鼠骨髓间充质干细胞。将培养至第3代骨髓间充质干细胞与未经处理的聚乳酸聚乙醇酸微球及Ⅰ型胶原修饰的聚乳酸聚乙醇酸微球共同培养14d,观察细胞在不同支架表面的黏附生长。结果:扫描电镜及FDA-PI染色发现,骨髓间充质干细胞可在聚乳酸聚乙醇酸微球支架上生长,而与未修饰的聚乳酸聚乙醇酸微球相比骨髓间充质干细胞更容易在Ⅰ型胶原修饰的聚乳酸聚乙醇酸微球上黏附增殖。Ⅰ型胶原修饰的聚乳酸聚乙醇酸微球有利于骨髓间充质干细胞的黏附、增殖,并且有一定诱导干细胞成骨分化的能力。     

微载体技术与普通方法成骨诱导培养人骨髓间充质干细胞的比较

目的:比较微载体法与普通培养瓶法成骨诱导培养人骨髓间充质干细胞,建立一种大量、快速获得骨组织工程种子细胞的方法。方法:实验于2003-12/2004-10在西南医院中心实验室完成。取在西南医院检查的15名健康自愿者骨髓组织进行梯度离心,采用普通培养法培养。将普通培养瓶培养的第3代人骨髓间充质干细胞分别应用搅拌式生物反应器和微载体成骨诱导培养,分别于培养的第2,4,6,8,10,12,14天检测诱导培养细胞的碱性磷酸酶活性,观察细胞增殖情况,作出生长曲线,比较两种方法细胞增殖速度(收获细胞数除以接种细胞数,为细胞扩增倍数,以之除以培养天数为增殖速度)。结果:①微载体法成骨诱导培养人骨髓间充质干细胞的增殖动力学并与普通法的比较:培养微载体法接种24h后约87%的人骨髓间充质干细胞细胞贴附于微载体并铺展,3d后生长加速,10～11d后细胞生长达最大值,最终细胞收获密度为接种时的15～20倍,微载体法诱导培养人骨髓间充质干细胞的速度是普通培养法的3～5倍,两者差异有显著性(P<0.01)。②微载体法成骨诱导培养人骨髓间充质干细胞的碱性磷酸酶活性并与普通成骨诱导培养法比较:两种方法成骨诱导培养人骨髓间充质干细胞的碱性磷酸酶活性均在培养的第12天达最大值。微载体成骨诱导细胞的碱性磷酸酶活性与普通成骨诱导方法差异无显著性(P>0.05)。结论:应用微载体技术可以成功地进行人骨髓间充质干细胞的成骨诱导,更快地扩增,利于满足骨组织工程量和质的需要。     

重组腺病毒介导增强型绿色荧光蛋白基因转染兔骨髓间充质干细胞

背景:目前仍没有合适的标记方法追踪观察兔骨髓间充质干细胞组织修复及基因治疗的效果.目的:观察重组腺病毒介导增强型绿色荧光蛋白基因在兔骨髓间充质干细胞中的表达,及转染后干细胞活性的变化,以寻找稳定标记兔骨髓间充质干细胞的方法. 设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008-03/05在南京市第一医院骨科干细胞实验室完成. 材料:健康2月龄纯种新西兰大白兔4只,由南京医科大学实验动物基地提供.重组腺病毒Ad5/F35-EGFP为北京本元正阳基因有限公司产品. 方法:用密度梯度离心法分离纯化兔骨髓间充质干细胞,贴肇法纯化扩增.取传至第4代细胞,流式细胞仪检测细胞标志的表达,消化离心重悬后进行计数,平均分成5组,每组细胞数5.0×105个,接种于25 m2培养瓶,空白组加入50 μL的PBS液,剩余4组加入重组腺病毒Ad5/F35-EGFP进行转染,感染复数(MOI)分别为10,20,50,100,继续传代培养.主要观察指标:骨髓间充质干细胞的生长状态及表面标志鉴定,转染后骨髓间充质干细胞增强型绿色荧光蛋白的表达及活性变化.结果:原代培养48 h后见细胞贴壁,8 d时细胞铺满瓶底80%以上,绝大多数呈梭形,传代后细胞增殖速度加快,三四天即可传代,第4代细胞CD29和CD44呈阳性表达,CD34与CD45呈阴性表达.转染后24 h可见绿色荧光,7 d时荧光最强,细胞转染率与感染复数值的呈线性增长关系,至49 d时仍可见绿色荧光.转染后0,7,14,28,49 d,感染复数=50组的骨髓间充质干细胞数量均与空白组基本相似(P均>0.05),即转染后细胞增殖能力无明显变化. 结论:重组腺病毒载体能高效标记骨髓间充质干细胞,感染复数为50时较为理想,增强型绿色荧光蛋白基因可持续表达49 d,且标记后不影响骨髓间充质干细胞的增殖活性.     

心肌内注射碱性成纤维细胞生长因子对兔骨髓间充质干细胞自体移植的影响

目的:了解骨髓间充质干细胞(mesenchymalstemcells,MSCs)在心肌梗死的缺血心肌微环境中转化为心肌细胞并改善心功能的可行性,及同时心肌内注射碱性成纤维细胞生长因子(basicfibroblastgrowthfactor,bFGF)对此过程的影响。方法:将21只兔结扎左前降支制作急性心肌梗死模型,骨穿抽取骨髓,分离培养扩增MSCs。随机分成3组,术后2周进行心肌梗死瘢痕内移植5-溴脱氧尿嘧啶(bromodeoxyuridine,BrdU)标记的MSCs(加或不加bFGF)(MSCs组、MSCs+bFGF组),对照组注射培养基。心肌梗死手术前、手术后3d及移植后4周做超声心动图检测心功能,处死动物取左室标本作冷冻切片,采用免疫荧光法鉴定植入细胞,并检测VIII因子相关抗原以测量毛细血管密度。结果:两细胞移植组左室切片中均可见BrdU染色阳性细胞即植入细胞。对照组未见BrdU染色阳性细胞。VIII因子阳性内皮细胞计数表明MSCs组及MSCs+bFGF组毛细血管密度分别为每高倍视野29±8和31±6,显著高于对照组(21±5)(F=11.971,P<0.01),超声心动图检测证实MSCs组及MSCs+bFGF组移植后4周射血分数显著大于对照组(F=5.850,P<0.05),两细胞移植组间上述各项差异无显著性意义(P>0.05)。结论:缺血心肌内注射MSCs可依赖组织微环境转化为心肌细胞修复梗死心肌,促进血管新生从而改善心功能,可     

蛛网膜下腔移植磁标骨髓间充质干细胞治疗脊髓损伤

背景:干细胞移植可以重建中枢神经系统的结构和功能,近年来引起了广泛的关注。目的:探讨超顺磁性氧化铁标记骨髓间充质干细胞对兔脊髓损伤神经功能恢复的作用。方法:采用密度梯度离心法和贴壁法体外分离培养兔骨髓间充质干细胞。制作兔脊髓损伤模型,并在蛛网膜下腔置管以备移植。将实验白兔随机分为3组:标记组移植超顺磁性氧化铁标记细胞;未标记组移植未标记细胞;对照组不移植细胞只注射PBS液。结果与结论:两移植组在细胞移植14d后运动功能BBB评分高于对照组,差异有显著性意义(P<0.05);但两组间差异无显著性意义(P>0.05)。细胞移植后1,7,14,21,28,35d,脊髓损伤区域局部组织上出现大量含蓝色铁颗粒的细胞。经蛛网膜下腔移植标记骨髓间充质干细胞可定向迁移到脊髓损伤区域,并能促进脊髓损伤神经功能恢复。     

骨髓间充质干细胞成骨分化中血管内皮生长因子和骨形态发生蛋白2的表达

背景：有研究表明血管内皮生长因子可促进内皮细胞增殖、分化和迁移,而骨髓间充质干细胞经诱导分化后细胞自身的血管内皮细胞生长因子及骨形态发生蛋白2如何表达,却鲜见报道。目的：观察兔骨髓间充质干细胞成骨诱导分化过程中血管内皮细胞生长因子和骨形态发生蛋白2的表达。方法：取第3代新西兰大白兔骨髓间充质干细胞,1d后将细胞分为两组：对照组不更换培养基;诱导组加入成骨诱导培养基进行成骨诱导,流式细胞仪检测其表面抗原。RT-PCR和Western-Blot检测细胞成骨分化过程中血管内皮细胞生长因子和骨形态发生蛋白2的表达。结果与结论：兔骨髓间充质干细胞成骨诱导后,细胞形态由长梭形逐渐变为短梭形,多角形,最后成集落层叠生长;在诱导过程中,碱性磷酸酶活性逐渐增高,与对照组比较有显著性差异（P〈0.05）;诱导7d时Ⅰ型胶原免疫细胞化学染色、14时骨钙素免疫细胞化学染色、21d时钙化结节染色阳性;RT-PCR和Western-Blot结果显示两组均有骨形态发生蛋白2和血管内皮细胞生长因子表达,诱导后第7,14,21天表达比较,差异有显著性意义（P〈0.05）,第7天,两者表达最强。说明兔骨髓间充质干细胞分离、提取操作简便易行,且有较强的生长增殖能力,可诱导分化为成骨细胞。其在成骨诱导过程中,骨形态发生蛋白2和血管内皮生长因子表达均先增强后减弱,血管内皮细胞生长因子表达可能对血管生成有促进作用。     

大鼠骨髓间充质干细胞的纯化、冻存及成瘤性分析

背景：骨髓间充质干细胞在骨髓中的含量极低,体外的长期培养过程中易丧失干细胞潜能以及体内移植后安全性等问题的存在,限制了骨髓间充质干细胞在临床上的广泛应用。目的：探索体外分离纯化、冻存大鼠骨髓间充质干细胞的最适方法,并观察以此方法培养的骨髓间充质干细胞移植体内后是否具有成瘤性。方法：分别采用差速贴壁结合24h首次换液、24h首次换液、48h首次换液的方法纯化培养骨髓间充质干细胞,筛选最适纯化方法进行后续实验。配制含体积分数为10%,20%,30%,40%,50%胎牛血清的细胞冻存液冻存细胞,复苏后计算细胞存活率,测定复苏后细胞的生长曲线及成脂诱导能力。将第3,15代骨髓间充质干细胞进行裸鼠肌肉、肝脏局部注射体内移植,45d后取注射部位行病理组织标本检查。结果与结论：差速贴壁结合24h首次换液法所获得骨髓间充质干细胞纯度最高,而细胞增殖能力与其他两组无明显差别,因此选用该方法纯化骨髓间充质干细胞,然后进行传代培养;含体积分数为30%血清冻存液既可保证细胞活性与增殖能力,又可保证干细胞特性及多向分化潜能。骨髓间充质干细胞传至15代仍保持间充质干细胞特性,骨髓间充质干细胞移植入裸鼠肝脏45d后仍可在肝脏局部存活,生长状态与体外培养相似,无异型性及向周围浸润生长,提示体外长时间培养15代以内的骨髓间充质干细胞可在裸鼠体内存活且无成瘤性。     

重组慢病毒载体转染羊骨髓间充质干细胞及成骨基因表达量的变化简

背景：碱性成纤维细胞生长因子具有促进骨髓基质细胞分裂增殖作用,而骨形态发生蛋白2在诱导新骨形成方面有重要的研究意义。目的：分析骨形态发生蛋白2和碱性成纤维细胞生长因子基因单独和联合转染对体外培养的骨髓间充质干细胞的增殖和骨向分化的影响,比较Ⅰ型胶原蛋白、骨钙蛋白、骨桥蛋白等非特异性成骨基因于转染前后骨髓间充质干细胞相对表达量的差别,为构建组织工程骨的种子细胞做理论依据。 方法：构建碱性成纤维细胞生长因子、骨形态发生蛋白2慢病毒载体,分别转染羊骨髓间充质干细胞,得到碱性成纤维细胞生长因子组、骨形态发生蛋白2组、联合组、对照组细胞,提取RNA后采用实时定量PCR的方法检测Ⅰ型胶原蛋白、骨钙蛋白、骨桥蛋白等非特异性成骨基因的mRNA水平相对表达量的变化。 结果与结论：对照组、碱性成纤维细胞生长因子、骨形态发生蛋白2及联合组4组间非特异性成骨基因表达量存在明显差异（P ＜0.05）,且碱性成纤维细胞生长因子和骨形态发生蛋白2具有交互作用（P ＜0.05）,碱性成纤维细胞生长因子、骨形态发生蛋白2联合组的Ⅰ型胶原蛋白和骨钙蛋白基因表达量明显高于其他3组,且差异有显著性意义（P ＜0.05）;但是骨桥蛋白基因中差异无显著性意义（P ＞0.05）。体外实验结果显示联合转染组中的Ⅰ型胶原蛋白、骨钙蛋白、骨桥蛋白等非特异性成骨基因mRNA水平相对表达量较多,该组细胞的成骨功能最强,适合作为组织工程骨的种子细胞。     

碱性成纤维生长因子和人重组骨形态发生蛋白2诱导分化兔骨髓间充质干细胞

背景:骨髓间充质干细胞依赖特定的生长和分化因子能分化为骨、软骨、脂肪等不同组织。人重组骨形态发生蛋白2有明显的骨诱导作用,能诱导未分化的骨髓间充质干细胞不可逆地形成骨与软骨,并最终导致新骨生成;碱性成纤维生长因子亦参与调控骨髓间充质干细胞的软骨与骨的分化。目的:观察碱性成纤维生长因子和人重组骨形态发生蛋白2对兔骨髓间充质干细胞增殖和分化的影响,以便寻求合适的骨形成诱导方法以代替常规的成骨培养体系。设计:随机对照实验。单位:解放军第四军医大学唐都医院骨肿瘤研究所。材料:培养的兔骨髓间充质干细胞。方法:实验于2004-06/12在第四军医大学唐都医院骨肿瘤研究所暨全军骨科中心完成。①体外培养的兔骨髓间充质干细胞分别经3种不同的生长因子(100μg/L人重组骨形态发生蛋白2,100μg/L碱性成纤维生长因子,100μg/L人重组骨形态发生蛋白2加100μg/L碱性成纤维生长因子)和成骨培养体系处理。②其增殖和分化通过四甲基偶氮唑盐比色法,碱性磷酸酶、骨钙素检测和钙结节VonKossa染色观察。主要观察指标:通过检测增殖率和碱性磷酸酶活性比较不同生长因子对兔骨髓间充质干细胞增殖和分化的影响。结果:①人重组骨形态发生蛋白2能促进兔骨髓间充质干细胞的增殖和分化,特别是其分化。②碱性成纤维生长因子能刺激兔骨髓间充质干细胞的增殖,与对照组相比,细胞增值率提高近100%;虽然对兔骨髓间充质干细胞分化无明显影响,但其能促进人重组骨形态发生蛋白2对兔骨髓间充质干细胞分化。结论:碱性成纤维生长因子和人重组骨形态发生蛋白2是兔骨髓间充质干细胞有效的分化因子,两者在体外都能促进兔骨髓间充质干细胞的增殖和分化。碱性成纤维生长因子和人重组骨形态发生蛋白2能协同作用加速骨诱导及骨形成,可以用作分化骨组织工程中的种子细胞。     

兔激素性股骨头坏死模型骨髓间充质干细胞的培养

背景：自体干细胞移植治疗已经成为目前组织工程和再生医学研究的重点。但对于兔激素性股骨头坏死模型自体骨髓移植中骨髓间充质干细胞的体外培养研究鲜有报道。目的：抽提兔激素性股骨头坏死模型的骨髓间充质干细胞,并行体外扩增和表型鉴定。方法：取成年大耳白兔10只,对照组2只不给任何药物;模型组8只每周2次臀肌注射甲基强的松龙8mg/kg制备兔激素性股骨头坏死模型。体外分离培养骨髓间充质干细胞;应用流式细胞仪分别检测第4代骨髓间充质干细胞表面抗原CD29、CD34、CD44的表达。结果与结论：经过大量激素作用后,MR灌注成像及病理切片结果显示兔激素性股骨头坏死模型组造模成功。模型组原代骨髓间充质干细胞4h内仅有少量细胞贴壁,12d左右细胞铺满瓶底的85%-90%,传代培养生长良好;第4代骨髓间充质干细胞生长曲线呈典型S型,第4-7天处于高速增殖期,与对照组生长曲线相近;经流式细胞术鉴定,第4代骨髓间充质干细胞表面抗原CD34表达呈阴性,CD29,CD44表达呈阳性,证明所培养的细胞为较纯的骨髓间充质干细胞。提示兔激素性股骨头坏死模型的骨髓间充质干细胞具有较强的生长和增殖能力,可用于干细胞标记及进一步自体移植治疗。     

兔骨髓间充质干细胞分离培养后的活力检测

背景：目前分离纯化骨髓间充质干细胞多采用单一的方法,对扩增培养过程中细胞活力的变化没有较为系统而全面的评估。目的：探索体外分离培养和纯化兔骨髓间充质干细胞的方法,并对细胞的活力进行检测。方法：采用密度梯度离心联合贴壁筛选的方法分离纯化兔骨髓间充质干细胞,从形态学、细胞表型和成骨成脂能力方面进行鉴定;并从细胞生长曲线、贴壁率和克隆形成率3个方面评估细胞活力。结果与结论：原代细胞多呈梭形和圆形,48h后大部分细胞贴壁,8-10d细胞融合达80%-90%,传代周期为3-5d;流式检测显示CD14、CD34和CD45表达阴性,CD29、CD44和CD90表达阳性;成骨诱导茜素红染色可见明显的钙结节,成脂诱导油红O染色可见大量脂肪细胞;细胞生长曲线、贴壁率及克隆形成率的结果表明第1代和第3代细胞的活力优于第5代细胞。结果说明密度梯度离心联合贴壁筛选的方法能够有效的分离纯化骨髓间充质干细胞,并能较好的保持其生物功能,在扩增传代过程中,细胞活力会有不同程度的下降。     

壳聚糖-明胶-碱性成纤维细胞生长因子三维大孔支架对骨髓间充质干细胞增殖的影响

背景:干细胞的分化潜能与培养条件有密切关系,改变支架材料的表面特性,三维结构,增加生长因子均可实现对干细胞增殖分化的控制.目的:制备适合骨髓间充质干细胞附着生长的、具有最佳孔隙率和孔隙结构的药物缓释组织工程支架--三维大孔支架,提供能促进多能干细胞生长的微环境.设计:重复测量设计.单位:广州中医药大学基础医学院解剖教研室.材料:实验所用健康成年 SD 大鼠由广州中医药大学实验动物中心提供.壳聚糖、碱性成纤维细胞生长因子购自Sigma公司.方法:实验于2003-03/2006-12主要在广州中医药大学基础医学院解剖教研室完成.采用冷冻干燥的方法,用不同比例的壳聚糖.碱性成纤维细胞生长因子-明胶依次混匀,通过控制冷冻、复温和干燥时间处理使其具有最佳孔隙率和孔结构,制备具缓释碱性成纤维细胞生长因子功能的三维大孔支架.取SD大鼠股骨和胫骨骨髓,分离、培养骨髓间充质干细胞并移植于缓释碱性成纤维细胞生长因子的三维大孔支架上进行三维培养,与无碱性成纤维细胞生长因子的支架对照.实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准.主要观察指标:用ELISA和扫描电镜观察支架的三维结构和缓释性能,用苏木精-伊红染色、MTT、细胞计数及扫描电镜方法观察缓释碱性成纤维细胞生长因子的三维大孔支架对骨髓间充质干细胞生长状态和细胞活力的影响.结果:含有碱性成纤维细胞生长因子的三维大孔支架有碱性成纤维细胞生长因子缓释性能,孔隙尺寸与不含碱性成纤维细胞生长因子的支架三维结构相比,差异无显著性意义(P＞0.05).含有碱性成纤维细胞生长因子的三维大孔支架能提高在支架上立体培养的骨髓间充质干细胞存活率,促进骨髓间充质干细胞黏附、增殖和活力,与不含碱性成纤维细胞生长因子的支架相比,差异有显著性意义(P＜0.05).结论:含有碱性成纤维细胞生长因子的三维大孔支架能缓释碱性成纤维细胞生长因子,有利于在支架上立体培养的骨髓间充质干细胞存活,为其在组织工程中的应用打下基础.     

Bio-Gide胶原膜对兔骨髓间充质干细胞增殖和成骨分化的影响

背景：相关实验表明Bio-Gide胶原膜与细胞有良好的生物相容性,但有关与其复合培养干细胞成骨分化能力的报道少见。 目的：观察Bio-Gide胶原膜对骨髓间充质干细胞增殖及成骨分化的影响。 方法：全骨髓贴壁法体外分离培养兔骨髓间充质干细胞,将第3代兔骨髓间充质干细胞分别接种于覆盖Bio—Gide胶原膜的培养板（实验组）与单纯培养板（对照组）培养。于培养1,4,7,14d利用CCK-8试剂盒检测细胞增殖;成骨分化诱导培养1,4,7,14d收集细胞培养液上清,检测细胞碱性磷酸酶活性。 结果与结论：两组细胞数量均随着培养时间的增加而不断增加,对照组培养7d细胞数量明显多于实验组（P〈0．05）,其他时间点组间比较差异无显著性意义。两组细胞碱性磷酸酶活性均随着培养时间的增加而不断增加,实验组成骨诱导14d细胞碱性磷酸酶活性高于对照组（P〈0．05）,其他时间点组间比较差异无显著性意义。表明Bio-Gide胶原膜可促进兔骨髓间充质干细胞的增殖及成骨分化。     

全骨髓贴壁法培养兔骨髓间充质干细胞体外定向成骨诱导分化及鉴定

背景：流式细胞仪分离法和免疫磁珠分离法对细胞活性影响较大,密度梯度离心法虽然能够获得纯度高的单核细胞,但由于多次离心可造成细胞的大量流失且对细胞活性有一定的影响使其应用值得商榷。目的：采用全骨髓贴壁法分离兔骨髓间充质干细胞进行成骨诱导分化及鉴定。方法：采用全骨髓贴壁法体外分离培养兔骨髓间充质干细胞,倒置显微镜下观察细胞形态学特征。在成骨诱导剂作用下,通过碱性磷酸酶染色试剂盒行碱性磷酸酶染色,I型胶原免疫细胞化学染色,VonKossa法及茜素红进行矿化结节染色以及电镜下检测兔骨髓间充质干细胞成骨诱导后的形态结构。结果与结论：经诱导后细胞出现与成骨细胞相似的形态学特征,碱性磷酸酶染色阳性,I型胶原免疫细胞化学染色,Von-Kossa法及茜素红矿化结节染色阳性。表明经成骨诱导剂诱导后全骨髓贴壁法体外分离纯化培养的兔骨髓间充质干细胞能向成骨细胞方向分化增殖。