胚胎性别免疫鉴定

异配子型动物具有异配子特异性抗原即H-Y抗原或H-W抗原,胚胎性别免疫鉴定就是建立在这个事实基础上的。H-Y抗原存在于细胞表面,为含有半乳糖残基的糖蛋白。然而,H-Y抗原是一种次要组织相容性抗原,其免疫原性极弱,使制备的H-Y抗血清滴度很低,给胚胎性别免疫鉴定带来了困难。     

用雄性特异性抗体和雄性特异性引物PCR技术鉴别胚胎性别的实际应用展望

人们一直进行试验,试图将携带Y染色体精子从携带X染色体精于中分离出来。在此之前,还未建立分离精子的准确方法。采用染色体分析鉴别性别的胚胎已进行过移植试验。 本文将讨论哺乳动物胚胎H-Y的抗原活性和胚胎细胞Y染色体上的SRY(性别决定区)基因,以及使用H-Y抗体或PCR(聚合酶链式反应)扩增雄性特异性引物的方法鉴别这些胚胎性别的可行性。     

性别决定机制——H-Y抗原学说及其它

一、H-Y抗原:雄性决定学 说和存在的问题 将近交系小白鼠(例如C57BL/6J)雄鼠的皮肤移植给同系雌鼠,可产生弱的排斥反应。于是,人们认为在Y染色体上存在控制遗传差异表达的组织相容性-Y(组织相容性Y或H-Y)抗原,并由此而提出决定睾丸分化的因子是H-Y抗原这种假说。但1982年以来,陆续对这一学说提出反驳,下面将讨论该学说可否存在的问题。     

H-Y单抗检测方法初探

优化间接ELISA条件 ,提高灵敏度 ,建立检测H -Y抗体的检测方法。利用纯系BALB/c公鼠免疫同系母鼠 ,制备H -Y单抗。间接免疫荧光法鉴定胚胎性别 ,PCR方法验证准确率。结果表明 :在 1 8枚H -Y阳性胚胎中 ,有 1 5枚雄性胚胎 ,3枚雌性胚胎 ,准确率为 83%。在 1 6枚H -Y阴性胚胎中 ,有 1 5枚雌性胚胎 ,1枚雄性胚胎 ,准确率为 94%。     

用聚合酶链反应可准确鉴定移植前牛胚胎的性别

聚合酶链反应(PCR)技术是胚胎性别鉴定的一大突破。我们发展了先进的PCR技术,用于移植前牛胚胎的性别鉴定,用两个特异的雄性Y染色体重复序列为标靶,以PCR方法对DNA进行扩增。我们进一步扩增了出现在雄性和雌性中的牛重复序列。这一方法极其准确,结果无一差错,可用于90％以上的牛半胚性别鉴定。     

阴道内注入H-Y抗血清确定家兔性别

Eichwald等报告过雄性小鼠的皮肤同基因移植片常为雌鼠所排斥。这表明存在着一种受Y染色体影响的抗原。由于该抗原与细胞介导的免疫应答有关,故称为小鼠的H-Y抗原(histocompatibility-Y)。有人用补体介导的细胞毒性试验检出了小鼠精子的H-Y抗原。免疫电镜的研究发现,H-Y抗原集中在小鼠精子的顶体部位。从C57BL/6J小鼠附睾和输精管收集的精子,经H-Y抗血清和马的补体处理后再行人工授精,结果显著地提高了雌性小鼠产出数。     

用PCR鉴定性别的绵羊胚胎移植试验

采用deletion-enrichment的方法建立富含绵羊Y染色体DNA文库,筛选出特异克隆,经序列分析,合成一对引物,用PCR扩增Y染色体上特异片段约130bp。在实验室,用初步建立的PCR鉴定胚胎性别技术,对已知性别的6只公绵羊和5只母绵羊的血液样品进行性别鉴定,准确率为100％。在内蒙古牧区生产现场,用研究成功的简易胚胎取样技术和胚胎取样过程中的防污染措施,从绵羊胚胎切取一定数量的细胞经PCR性别鉴定后移植于受体母羊,移植成功18只受体母羊,共怀25只羔羊,有20只羔羊的实际性别与胚胎性别鉴定结果一致,准确率为80％(20/25),其中,公羔与鉴定为雄性胚胎的符合率为87.5％(7/8);母羔与鉴定为雌性胚胎的符合率为76.5％(13/17)。     

母牛早期妊娠检查的免疫学方法

从遗传学角度讲,胚胎与母体总是有差别的。胚胎具有组织相容性主要复合体基因所决定的抗原,其中有些抗原来自供体公畜的精液,因而胚胎抗原与母体抗原不同,少量胚胎抗原进入血液,就会引起互补抗体形成。试验证明在妊娠早期,母畜免疫系统合成具有胚胎抗原受体的物质。 在笔者的验试里,这些免疫体可见于卵母细胞受精后15—18天的母牛。免疫体检出滴定度不高。因而在需检出大量蛋白质的反应中,如在沉淀反应中不能发现。     

基因工程技术制备抗IL-2蛋白抗体Fab片段及其鉴定方法的建立

目的利用基因工程技术制备人源性抗IL-2蛋白的可溶性Fab抗体片段,并鉴定其抗原结合活性及特异性。方法用固相化的IL-2蛋白从人天然噬菌体抗体库中筛选出表达抗IL-2蛋白Fab抗体片段的阳性克隆,酶切及连接反应构建可溶性表达噬菌粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中,IPTG诱导表达,并用SDS-PAGE鉴定抗体表达情况、ELISA鉴定其抗原结合活性和特异性。结果成功筛选并表达了抗IL-2蛋白的Fab段抗体,在SDS-PAGE中形成47kD的条带,Western blot证明为抗人Fab段抗体;ELISA证实该抗体片段具有良好的抗原特异性和抗原结合活性,与牛血清白蛋白、IL-4无交叉反应。结论成功表达并鉴定了人源性抗IL-2蛋白的可溶性Fab片段,构建了一种制备基因工程抗体的有效途径,为基因工程抗体在肿瘤免疫治疗方面的临床应用研究奠定了基础。     

影响牛PCR胚胎性别鉴定雌性准确率的因素分析

本试验对影响牛性别鉴定雌性胚胎产犊准确率的因素进行了研究。结果表明:胚胎质量对产犊准确率有显著影响。取样大于等于5个细胞组的产母犊准确率高于取样1~4个细胞组,二者差异极显著。取样细胞活性对胚胎性别鉴定的准确率有显著影响。电泳条带清晰程度对性别鉴定准确率有极显著影响,而胚胎发育阶段和取样时有无透明带对产犊牛准确率无显著影响。     

艰难梭菌谷氨酸脱氢酶的表达及抗原性分析

目的：构建艰难梭菌（CD）谷氨酸脱氢酶（GDH）的原核表达载体,表达重组蛋白并鉴定其抗原活性。方法以 CD 的 ATCC43255菌株基因组 DNA 为模板,通过 PCR 法扩增 GDH 全长基因片段,构建原核表达载体并转化到大肠杆菌中,IPTG 诱导表达 GDH 蛋白,并用 Ni 柱进行纯化。利用 CD 抗原检测试剂盒对 GDH 抗原区段的抗原性进行鉴定。结果构建的原核表达载体 pET-28a／GDH 可在大肠杆菌中成功表达,获得的 GDH 抗原能与相应抗体产生特异性反应。结论原核表达的 CD 的 GDH 抗原具有很好的抗原活性,为进一步制备相应抗体并建立CD 的 GDH 抗原的免疫检测方法奠定了基础。     

抗丙型肝炎病毒核心蛋白单链抗体的制备及免疫组织化学研究

目的 制备丙型肝炎病毒核心蛋白单链抗体并进行免疫组织化学研究。方法以大肠杆菌表达的重组丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白为固相抗原,利用抗原抗体亲和性结合的原理,从半合成的人源可变区噬菌体抗体库中经过3轮“吸附-洗脱-扩增”的筛选过程及酶联免疫吸附试验(ELISA)和DNA序列分析,获得HCV核心蛋白的人源单链抗体;用该抗体对7721转染全长HCV cDNA后筛选的阳性克隆细胞中的HCV核心蛋白抗原进行免疫组化鉴定。结果 ELISA结果表明,制备的HCV核心蛋白人源单链抗体能与HCV核心蛋白抗原特异性结合;免疫组化结果表明,该抗体能够特异性识别HCV核心蛋白抗原,与正常肝细胞无交叉反应。结论此法制备单链抗体方法简便,周期短,可为HCV核心蛋白病原的检测提供新的检测手段。     

用雄性DNA探针鉴定奶牛胚胎性别

用特定的Y-染色体DNA探针对进入子宫的胚胎进行鉴定,已鉴定的冷冻胚胎,随后解冻并进行移植,移植后60天解剖取出胎儿确定鉴定结果。特定的雄性DNA探针是从基因库中分离的三种不同雄性基因克隆提取的。它们的识别是通过与过量的母牛基因组DNA预先杂交,以有效地去掉常染色体和X染色体序列的DNA进行的。选择这三种     

酶标抗体的制备及细胞内病毒和立克次体抗原的检出

用三种不同方法提取的抗体IgG与辣根过氧化物酶按戊二醛一步法和二步法制备酶标抗体。酶标抗体经免疫化学和免疫组织化学鉴定,初步认为可供光学显微镜检出细胞内病毒和立克次体抗原应用。乙型脑炎病毒感染小白鼠脑石蜡切片间接法酶标抗体染色的结果表明:脑干神经核和皮层海马回等部位的感染神经元的胞体、轴突及树突内均可检出棕黄色颗粒样抗原-抗体反应沉淀物。斑点热立克次体自然感染蜱血淋巴涂片的直接法和间接法酶标抗体染色均显示阳性反应。     

SRY基因与性别鉴定技术

本文综述了性别决定基因 (SRY)研究历程 ,SRY基因的结构、功能、表达特性及其它对性别控制研究和性别鉴定技术发展的作用 ,在此基础上产生了相关的分子生物学性别鉴定方法 ,如PCR法、核酸杂交法、原位杂交法等 ,并讨论了这些方法在胚胎性别鉴定、性别控制研究中的优越性     

大肠癌噬菌体抗体库的构建及抗CEA抗体的筛选

目的构建及初步鉴定大肠癌噬菌体抗体Fab呈现库,筛选人CEA单克隆抗体,并进行序列分析。方法分离大肠癌患者外周血淋巴细胞,提取淋巴细胞总RNA,逆转录成cDNA。用PCR扩增人全套抗体基因片段,克隆于pComb3载体,再经电穿孔转化大肠杆菌XL1-Blue菌株,形成噬菌体抗体库。以固相化CEA抗原淘筛抗体库,ELISA鉴定噬菌体抗体。其中一个阳性克隆进行测序。结果逆转录PCR分别扩增出约680bp大小的κ、λ和Fd基因。PCR产物和载体经纯化、双酶切后进行连接转化,成功地构建了人源性Fab抗体基因库,库容量达2.1×107,Fab基因重组率为50%。以单抗捕获的CEA抗原淘洗4轮,出现特异性富集,阳性克隆经直接ELISA和交叉反应ELISA实验证实具有良好的抗CEA抗原特异性。DNA测序表明该抗体重链属IgG亚类并含有一条IgL亚类的轻链。结论成功构建了大肠癌患者自然致敏抗体Fab段噬菌体呈现库,从中获得可与CEA抗原结合的噬菌体抗体,由此为大肠癌早期诊断及基因治疗提供了一种新的思路和方法。     

人-鼠杂合Fab噬菌体抗体库的建立

目的 建立人-鼠杂合Fab噬菌体抗体库,经过扩增和筛选,得到目的抗体。方法自肝癌患者外周血单个核细胞中扩增全套人抗体Fd片段基因,分别克隆入含嵌合轻链的展示载体pComb3和pComb3X中,建立人鼠杂合．Fab噬菌体抗体库。然后利用肝癌抗原HAb18GE进行筛选,并对抗体库的扩增和筛选条件进行优化。结果pComb3展示抗体库在37℃进行扩增挽救时存在明显的目的片段重组丢失现象。pComb3X展示抗体库在不同的扩增条件下均未发现明显的重组丢失现象。经过4轮筛选后,噬菌体展示抗体ELISA显示,鉴定克隆与原核表达GST及无关蛋白存在明显交叉反应,而改用诱导表达细菌裂解上清进行ELISA鉴定可以抑制交叉反应的发生。结论通过建立杂合Fab抗体库,并对扩增和筛选条件进行优化,作者获得了目的抗体。     

精子性别化对乳牛性别控制的研究试验

试验于1991年在华南农业大学实验乳牛场进行,初步成功地获得了乳牛雌性控制率达81.8％的国内外先进水平,计有10头乳牛产犊:2雄、9雌,其中1头产异性双犊。研究试验结果包括三个方面:一是研制成具有一定的纯度和工作效价的H-Y抗血清;二是这种H-Y抗血清IgG确实存在有抑制牛Y染色体精子的基因抗体;三是掌握H-Y抗血清IgG与牛精液发生“感作”和导致正常受胎的技术方法。试验应用免疫遗传学原理,进一步证明H-Y抗血清IgG有抑制牛Y染色体精子的受精能力而获得较高的雌性控制率,具有很大的生物科学与经济价值。     

牛体外受精方法的研究进展

一、引言 本世纪70年代发展起来的牛胚胎移植技术在近年来得到了完善;冷冻胚胎、胚胎分割等技术也逐步规范化。但优秀母牛生产的胚胎不能象公牛精液可连续采集,多倍稀释。 近年来牛体外受精技术的进展给胚胎移植开辟了一个重要的胚胎源。另一方面,胚胎的核移植、基因注射及胚胎的性别鉴定等     

福氏2a痢疾菌多糖蛋白结合抗原的制备和免疫原性观察

提取福氏２ａ痢疾菌脂多糖中的多糖抗原与白喉类毒素共价交联，能增强多糖抗原对家兔的免疫原性，抗多糖抗体与抗载体蛋白抗体的反应规律基本一致，有二次免疫应答。抗血清能与福氏各型痢疾菌的脂多糖反应，与其它各群痢疾菌无交叉反应，其针对的主要抗原决定簇为福氏多糖骨架。