猪牙乳头细胞的体外培养及生物学特性研究

目的:培养新生猪的牙乳头细胞,探讨其传代细胞的生物学特性。方法:选择刚出生1￣3d的新生猪,取出磨牙胚,分离牙乳头,用酶消化法培养猪牙乳头细胞,并用波形丝蛋白和细胞角蛋白鉴定细胞来源。观察细胞的生长规律,通过免疫组化染色检测Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、牙本质涎蛋白(DSP)等的表达情况。结果:猪牙乳头细胞在体外培养时生长良好,波形丝蛋白染色阳性而细胞角蛋白染色阴性,细胞中Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、DSP呈阳性表达。结论:通过酶消化法,可以体外扩增培养猪牙乳头细胞,细胞为间充质来源,其传代细胞在合成胶原及DSP的能力上与体内牙乳头细胞相似,提示猪牙乳头细胞可能具备作为牙髓-牙本质复合体再生研究种子细胞的潜能。     

钟状期牙胚来源的猪牙乳头细胞培养

目的 观察新生猪牙胚的发育情况并培养猪牙乳头细胞,对传代细胞的生物学特性进行研究.方法 选择3日龄新生猪,分离牙胚,通过组织学、免疫组化等研究牙胚的发育情况.分离牙乳头组织,酶消化法培养牙乳头细胞并鉴定;观察细胞生长特性,通过牙本质涎蛋白、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原免疫组化染色比较体内外细胞的生物学性状.结果 新生猪磨牙尚未萌出,其中第二磨牙为典型的钟状期牙胚.分离培养的牙乳头细胞在体外生长良好,经鉴定细胞来源于间充质组织,免疫组化表明,牙本质涎蛋白和Ⅰ型胶原表达阳性,Ⅲ型胶原表达阴性.结论 新生猪可以提供处于钟状期的牙胚,通过酶消化法可成功培养猪牙乳头细胞,第3代细胞的生物学特性与体内细胞有一定相似性,可用于进一步深入研究.     

骨髓基质细胞的体外培养和成骨方向的诱导分化

目的:体外分离狗的骨髓基质细胞,诱导其成骨分化并鉴定成骨活性.方法:体外分离培养狗的骨髓基质细胞,传代培养中加入10-8rnol/L地塞米松、50 μg/ml维生素C和10mmol/L β-甘油磷酸钠进行诱导分化,进行细胞形态和增殖观察,矿化结节Von Kossa染色,细胞碱性磷酸酶染色和Ⅰ型胶原免疫组化染色检测其成骨活性.结果:骨髓基质细胞经诱导后表现出明显的成骨活性,体外矿化结节Von Kossa钙染色阳性;传代细胞碱性磷酸酶染色阳性,酶活性＞80%,Ⅰ型胶原免疫组化染色强阳性.结论:体外分离培养的骨髓基质细胞中含有骨源性前体细胞,传代细胞具有较强的成骨潜能.     

大鼠牙乳头细胞体外培养和矿化的实验研究

目的　观察体外培养的大鼠第一磨牙牙乳头细胞的生物学特征。方法　大鼠第一磨牙牙乳头细胞培养 ,免疫组织化学染色、钙盐染色。结果　培养的大鼠牙乳头细胞表达Ⅲ型胶原、纤维黏连蛋白、碱性磷酸酶 ,当细胞培养于含 5mmol/Lβ-磷酸甘油钠和 5 0 μg/mlL -维生素C的培养液中时 ,细胞可形成矿化的胞外基质。结论　培养的大鼠牙乳头细胞保留体内的某些特征 ,并可用于研究牙髓组织的钙化调节。     

体外培养人牙囊细胞Ⅰ型胶原与纤维粘连蛋白的表达

目的：通过体外培养人牙囊细胞，研究Ⅰ型胶原与纤维粘连蛋白在细胞中的表达，探讨其在牙齿萌出过程中转化为牙周膜细胞的机制。方法：取12岁患者因正畸需要拔除埋藏阻生牙齿的牙囊，组织块法进行人牙囊细胞的培养，通过免疫组织化学染色技术观察Ⅰ型胶原及纤维粘连蛋白在牙囊细胞中的表达及定位。结果：培养的人牙囊细胞呈梭形、卵圆形及多角形，形似成纤维细胞。在牙囊细胞中Ⅰ型胶原和纤维粘连蛋白的表达呈阳性，定位于细胞的胞质中，围绕细胞核周围染色较强，细胞核内染色阴性。结论：体外培养人牙囊细胞具有成纤维细胞的特性，具有合成与分泌Ⅰ型胶原与纤维粘连蛋白的能力。     

体外诱导培养大鼠牙乳头细胞碱性磷酸酶和Ⅰ型胶原的表达

目的:观察体外诱导培养的大鼠牙乳头细胞碱性磷酸酶和I型胶原蛋白合成的变化。方法:原代培养法获得大鼠牙乳头细胞,在条件培养基中进行诱导培养,在不同时间进行钙结节染色,ALP染色和定量测定,ELISA法和RT-PCR法测定细胞I型胶原蛋白的量和mRNA表达水平。结果:体外诱导培养的大鼠牙乳头细胞形成含钙化物的细胞结节,体外培养至12d的诱导组细胞ALP高于对照组(P<0.05),细胞内I型胶原表达量高于对照组(P<0.05),且I型胶原mRNA表达水平上调(P<0.05);培养15d后诱导组细胞分泌的I型胶原高于对照组(P<0.05)。结论:大鼠牙乳头细胞在体外分化的过程中碱性磷酸酶活性明显增高,矿化能力增强,并不断合成和分泌I型胶原形成胞外基质。     

颌骨骨髓基质细胞与牙周膜细胞的生物学特性比较

目的:比较颌骨骨髓基质细胞与牙周膜细胞的基本生物学特性。方法:分离颌骨来源骨髓基质细胞和牙周膜细胞,进行改良体外原代培养。倒置显微镜观察细胞生长及克隆形成情况;CCK-8检测细胞生长曲线;免疫荧光染色检测STR0-1表达;成脂诱导后检测脂滴形成,矿化诱导后检测碱性磷酸酶的变化并用RT-PCR检测7、14 d成骨相关基因OCN的表达水平。结果:两种细胞体外培养均呈成纤维样细胞外形,能克隆生长,均具有活跃的增殖能力;两种细胞STR0-1表达阳性;成脂诱导后可见脂滴形成;矿化诱导后骨髓基质细胞的碱性磷酸酶活性较强,而且OCN基因表达较早且较强。结论:颌骨来源骨髓基质细胞具有较强的增殖及成骨分化能力,具有干细胞特性,可能是有较大临床应用潜力的组织工程种子细胞。     

人牙囊细胞的分离培养和生物学特性

目的：应用酶消化法体外培养人牙囊细胞并研究其生物学特性。方法：分离合法引产人胚胎乳牙胚的牙囊组织，消化法获得人牙囊细胞，HE染色观察细胞形态、免疫组织化学染色技术检测波形丝蛋白、Ⅰ型胶原表达，RT—PCR检测细胞的骨钙素、骨涎蛋白、碱性磷酸酶的表达。结果：原代培养的人牙囊细胞呈成纤维细胞形态，有部分一上皮成分混杂，经纯化后可排除；在牙囊细胞中Ⅰ型胶原和波形丝蛋白的表达呈阳性，定位于细胞的胞质中；RT—PCR结果显示骨涎蛋白、骨钙素、碱性磷酸酶表达。结论：体外培养的人牙囊细胞具有成纤维细胞的特性，具有合成Ⅰ型胶原的能力；不同程度表达Ⅰ型胶原、骨钙素、骨涎蛋白、碱性磷酸酶等矿化相关蛋白。     

犬牙周膜干细胞体外分离培养和鉴定的实验研究

目的体外分离培养犬牙周膜干细胞,并对其进行生物学鉴定。方法采用有限稀释法进行犬牙周膜细胞克隆筛选,获得单细胞克隆来源细胞,检测其克隆形成率,并采用免疫组织化学染色、碱性磷酸酶染色、苏木精-伊红染色以及生长因子分化诱导等方法观察其生物学特性。结果1）克隆化分离培养的犬牙周膜干细胞呈集落状生长,增殖快,克隆形成率为0.95％。2）苏木精-伊红染色见细胞呈成纤维样,体积小、核大,有较多的双核细胞。3）碱性磷酸酶染色阳性。4）细胞表型组化鉴定波形丝蛋白、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原阳性,间充质干细胞表面标志STRO-1染色阳性,角蛋白染色阴性。5）在含β-磷酸甘油钠、维生素C、地塞米松的矿化液中,细胞被诱导分化为成骨细胞,碱性磷酸酶活性增强,Ⅲ型胶原染色阴性,能形成矿化结节,细胞表达成骨细胞特异的骨涎蛋白,在含β-羟基乙醇的培养液中,被诱导分化为神经细胞样细胞。结论克隆化分离培养的犬牙周膜干细胞具有很强的克隆形成能力,具有间充质干细胞表型和多向分化潜能。     

新生大鼠牙乳头细胞的体外培养和矿化特征

目的：观察体外培养的新生大鼠牙乳头细胞的生物学特征。方法：体外培养出生1d大鼠磨牙牙乳头细胞，进行组织学染色，透射扫描电镜观察。结果：体外培养的新生大鼠牙乳头细胞能形成细胞克隆，第3代细胞在含2mmol／L β-甘油磷酸钠、50mg／L抗坏血酸、10^-8moL/L地塞米松的培养液中培养7～8d后可呈现复层生长，培养14～16d后细胞结节中出现矿化，茜素红染色呈阳性反应；透射电镜观察细胞内出现大量含有致密小体的基质小泡样超微结构。结论：发育阶段较早的大鼠牙乳头细胞具有增殖和矿化能力。     

人牙乳头细胞体外矿化特征及其分化表型的表达

目的：观察人牙乳头细胞体外矿化特征。方法：组织块法培养人牙乳头细胞,取第三代细于矿化液中长期培养,检测不同培养时间细胞碱性磷酸酶（alkaline phospha tase,ALP)活性,骨钙素（osteocalcin,OC)活性,且倒置显微镜观察细胞生长。结果：体外培养的牙乳头细胞呈现以下表现特征：复层增长,胞外基质分泌与矿化结节形成。在β-GP和L－抗坏血酸存在条件下培养第14天细胞内ALP活性开始升高而OC在21d才开始升高,有细胞外基质分泌,但未见矿化。35d产生特异性牙本质矿化结节。42天以后,OC、ALP活性降低。结论：培养的人牙乳头细胞具有成牙本质细胞某些表型,可在体外形成牙本质或牙本质样矿化物质,可作为研究牙本质形成机制的实验模型。     

大鼠骨髓间充质干细胞与脂肪间充质干细胞生物学特性的比较

目的:本研究旨在比较同一个体来源的脂肪间充质干细胞(Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells,ADSCs)和骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)的生长特点和诱导分化能力。方法:取7～10 d SD大鼠的脂肪和骨髓,体外分离、纯化脂肪和骨髓来源间充质干细胞,分别从细胞形态、生长动力学、表面标志、分化潜能等方面进行鉴定和比较。结果:脂肪间充质干细胞的增殖速度明显大于骨髓间充质干细胞(P<0.05),两种细胞所表达的表面蛋白标志物基本相似,但脂肪间充质干细胞表面蛋白标志CD106呈阴性,而骨髓间充质干细胞CD106呈阳性。在成软骨分化中脂肪间充质干细胞弱表达Ⅱ型胶原,而骨髓间充质干细胞不表达。第5、10、15、20代ADSCs及BMSCs经成骨诱导后茜素红染色均呈阳性且有"矿化"结节形成,碱性磷酸酶活性以第5代最强,随着细胞代次的递增,碱性磷酸酶活性呈递减趋势。结论:ADSCs较BMSCs更易于分离培养及体外扩增,诱导条件下成骨、成脂、成软骨能力较强,适合作为再生医学的种子细胞。     

体外培养的SD大鼠类成牙骨质细胞生物学性状初步探讨

目的：对SD大鼠磨牙牙骨质的类成牙骨质细胞分泌碱性磷酸酶，骨钙素以及形成矿化结节的能力进行初步研究。方法：对12周龄SD大鼠第一磨牙类成牙骨质细胞进行骨钙素免疫组化染色和碱性磷酸酶活力测定，并利用茜素红S，检测在条件培养基下细胞形成钙化结节的情况；利用计算机图像分析仪对细胞骨钙素免疫组化染色切片进行光密度定量分析。结果：骨钙素在体外培养的类成牙骨质细胞中被强烈表达，而碱性磷酸酶在类成牙骨质细胞中几乎无活性。类成牙骨质细胞形成钙化结节茜素红S染色阳性。结论：体外培养的类成牙骨质细胞表达矿化相关蛋白，但几乎没有碱性磷酸酶活性，钙化条件下，能在体外形成钙化结节。     

Evaluation of Cannabinoids on the Odonto/Osteogenesis in Human Dental Pulp Cells In Vitro

IntroductionCannabinoids possess anti-inflammatory, analgesic, and osteogenic effects in different cell types and tissues. The null hypothesis is delta-9-tetrahydrocannabinol (THC) might induce dental tissue repair and regeneration. The aim of this study was to investigate the effect of THC on human dental pulp cell (HDPC) viability and biomineralization as well as the molecular mechanism of THC-induced odonto/osteogenic differentiation of HDPCs.MethodsThe toxicity of THC on HDPCs was determined by 3-(4,5-dimethylthiazolyl-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide assay. The odonto/osteogenic differentiation marker genes of HDPCs were assessed by real-time polymerase chain reaction with or without THC treatment. HDPC biomineralization was examined by collagen synthesis and calcium nodule deposition. The molecular mechanism of THC on HDPCs was investigated by examining the mitogen-activated protein kinase (MAPK) signaling pathway via blocking cannabinoid receptor type 1 or 2 receptors.ResultsWe found that THC had no inhibition of HDPC vitality in the testing concentration (0–100 μmol/L). THC showed biphasic effects on HDPC proliferation. At a low dose (<5 μmol/L), THC considerably increased HDPC cell division. HDPC proliferation reduced with higher THC concentrations (>5 μmol/L). The expression of odonto/osteogenic marker genes were up-regulated in the presence of cannabinoids. These were confirmed by increased collagen synthesis and mineralized calcium nodule formation in the cannabinoid group. The effect of THC-induced odonto/osteogenesis occurred via MAPK signaling.ConclusionsTHC was biocompatible to HDPCs by promoting their mitogenic division in a biphasic pattern depending on the concentration. THC induced HDPC odonto/osteogenic differentiation through the activation of MAPK mediated by CB1 and CB2 receptors. Cannabinoids may play an important role in the HDPC regeneration process and potentially be used as a pulp-capping agent.     

大鼠成牙骨质细胞的体外培养及其生物学特性的实验研究

目的 :探讨体外培养源于大鼠磨牙牙骨质的成牙骨质细胞 (cementoblast ,CMB)的可行性 ,以期建立能排除牙周其它细胞干扰的CMB体外实验模型。方法 :使用组织块结合酶消化的二步法 ,分别培养来自牙骨质的CMB ,来自牙槽骨的成骨细胞 (osteoblast ,OB)和来自牙周韧带 ( periodontalligament ,PDL)的成纤维细胞。然后对所培养的细胞分别进行骨钙素免疫组化染色和碱性磷酸酶 (ALP)活力测定 ,并利用茜素红S ,检测在条件培养基下细胞形成矿化结节的情况。结果 :3种牙周细胞都可从约 12周大鼠第一磨牙根周获得进行原代培养。骨钙素在体外培养的CMB和成骨细胞中被强烈表达 ,在PDL成纤维细胞 (PDLC)中几乎不表达。成骨细胞ALP活性最强 ,在成纤维细胞中适中 ,在CMB中几乎无活性。CMB形成矿化结节茜素红S染色阳性。结论 :CMB可以在体外成功培养 ,并可与牙槽骨OB、PDLC相区别。CMB在形态和蛋白表达等很多地方与成骨细胞相似 ,如表达矿化相关蛋白等 ,但它几乎没有ALP活性 ;矿化条件下 ,能在体外形成矿化结节     

骨髓细胞体外成骨能力的实验研究

通过体外矿化条件观察培养兔骨髓细胞的成骨能力，结果显示（１）第３代骨髓细胞碱性磷酸酶染色，７％－８％阳性；（２）倒置显微镜下观察，细胞传代５－６ｄ后，长满培养瓶的底部，约１０ｄ开始叠层生长，为局灶状，中央出现较多颗粒样改变。     

人恒牙牙髓干细胞体外定向诱导分化为成骨细胞的研究

目的:研究人恒牙牙髓组织来源的牙髓干细胞在体外分化为成骨细胞的能力,探讨其作为骨组织工程种子细胞的可行性.方法:从正畸治疗减数拔除的恒前磨牙中分离牙髓组织,应用酶消化法获得牙髓细胞.单抗Stro-1标记、免疫磁珠阳性分选系统分选获得牙髓干细胞,第3代牙髓干细胞用成骨向诱导培养基向成骨细胞诱导分化.用碱性磷酸酶染色和Vo...     

碱性成纤维细胞生长因子对人牙髓细胞增殖和分化的作用

目的 探讨碱笥成纤维细胞生长因子（ｂａｓｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ,ｂＦＧＦ）对培养人牙髓细胞增殖和分化的效应。方法 采用四唑盐法、^3Ｈ－ＴｄＲ掺入法、图象分析,检测重组人ｂＦＧＦ（ｈｂＦＧＦ）对细胞ＤＮＡ、胶原蛋白、纤维为连蛋白、碱笥磷酸酶、骨形成蛋白合成和凝集素表达的影响。结果 ｈｂＦＧＦ浓度在１～１０μｇ／Ｌ时显著促进细胞增殖,浓度为１～１００μｇ／Ｌ）,Ⅰ型胶原