Sumf2条件性基因剔除小鼠模型的建立及初步表型分析

目的建立Sumf2条件性基因剔除小鼠模型,为整体水平研究Sumf2基因的生物学功能创造条件。方法运用生物信息学,采用ET克隆、同源重组、显微注射等技术成功建立Sumf2条件性基因剔除小鼠模型,并通过该模型与Ella-cre转基因小鼠交配,获得Sumf2基因剔除小鼠模型,通过PCR、RT-PCR、WesternBlot等方法在不同水平验证Sumf2基因的表达;对该小鼠模型进行初步的表型分析。结果经胚胎干细胞打靶,获得19个正确同源重组的克隆,重组效率为20％：阳性克隆经囊胚注射,获得2只嵌合体雄鼠;嵌合雄鼠与C57BL／6J小鼠交配,获得28只灰鼠,经PCR鉴定16只为杂合子小鼠,阳性率为57％;与Ella—ere转基因小鼠交配,获得了Sumf2基因剔除小鼠模型,DNA、RNA及蛋白水平证明该基因已成功剔除;初步的表型观察未发现Sumf2基因剔除小鼠生长发育、血常规及血生化指标等出现异常改变。结论成功建立Sumf2条件性基因剔除小鼠模型,该基因纯合缺失未发现明显的生长发育异常,为进一步的基因功能研究奠定了基础。     

GLUT4-Cre转基因模型建立与Cre酶特异性表达

目的建立骨骼肌和脂肪组织特异性表达Cre重组酶基因的转基因小鼠,以期在上述组织细胞中实现相关基因的条件性剔除.方法选择人葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)基因的启动子驱动Cre重组酶的特异性表达,利用基因重组技术,构建GLUT4-Cre转基因表达质粒.通过显微注射法将该质粒导入小鼠受精卵细胞核,获得的新生鼠经PCR和Southern杂交方法进行基因型的分析鉴定,常规方法培育、传代转基因鼠.用RT-PCR和免疫组化法对Cre酶在阳性转基因鼠体内mRNA和蛋白表达水平进行检测.结果获得5只阳性转基因首建鼠,其中3只已建系并稳定传代.在脑、脂肪组织中检测到Cre基因表达,而心肌、骨骼肌及肝脏组织中未检出转基因表达.结论成功构建了在脑、脂肪组织中特异性表达Cre的转基因鼠,为研究与2型糖尿病、胰岛素抵抗等相关的条件性基因剔除小鼠模型的建立奠定了基础.     

GLUT4-Cre转基因模型建立与Cre酶特异性表达

目的：建立骨骼肌和脂肪组织特异性表达Cre重组酶基因的转基因小鼠，以期在上述组织细胞中实现相关基因的条件性剔除。方法：选择人葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)基因的启动子驱动Cre重组酶的特异性表达，利用基因重组技术，构建GLUT4-Cre转基因表达质粒。通过显微注射法将该质粒导入小鼠受精卵细胞核，获得的新生鼠经PCR和Southern杂交方法进行基因型的分析鉴定，常规方法培育、传代转基因鼠。用RT-PCR和免疫组化法对Cre酶在阳性转基因鼠体内mRNA和蛋白表达水平进行检测。结果：获得5只阳性转基因首建鼠，其中3只已建系并稳定传代。在脑、脂肪组织中检测到Cre基因表达，而心肌、骨骼肌及肝脏组织中未检出转基因表达。结论：成功构建了在脑、脂肪组织中特异性表达Cre的转基因鼠，为研究与2型糖尿病、胰岛素抵抗等相关的条件性基因剔除小鼠模型的建立奠定了基础。     

FGFR2条件性敲除载体的构建及中靶ES细胞的筛选与鉴定

目的　构建成纤维细胞生长因子2型受体(Fibroblastgrowthfactorreceptor 2,FGFR2)条件性敲除载体,并对中 靶ES细胞进行筛选与鉴定,为最终建立FGFR2条件性敲除小鼠模型,研究FGFR2在小鼠骨骼、肺脏等组织、器官发育过程 中的作用打下基础。方法　在分析小鼠FGFR2基因组DNA序列结构的基础上,设计并构建了条件性敲除小鼠FGFR2外 显子7、8的基因打靶载体,采用电穿孔法在ES细胞中进行了打靶重组,G418与Ganciclovir被用于对电转的ES细胞进行正 负筛选,最后对ES细胞克隆进行了Southern与PCR鉴定。结果　将所构建的条件性打靶载体通过电穿孔转染入表达重组 酶(Cre)的AmI细菌,经PCR、酶切和测序鉴定,Cre酶能正确将条件性打靶载体的外显子7、8和选择性标记Neo基因经重 组剔除,电转了基因敲除载体的ES细胞经正负筛选后共挑取克隆83个;经5′端探针Southern杂交鉴定,发现4株阳性克 隆;该4株克隆再经3′端探针Southern杂交鉴定,发现2株阳性克隆;最后经Southern和PCR检测发现1株ES细胞克隆仍 保留外显子7、8两侧的loxP序列。结论　FGFR2条件性基因敲除ES细胞已成功构建。     

TAFA2基因剔除小鼠模型的建立

目的 建立TAFA2基因剔除小鼠模型,为在体研究TAFA2基因的生物学功能及其与中枢神经系统发生、发育的关系创造条件. 方法 运用生物信息学手段确定小鼠TAFA2基因组的序列,设计基因剔除策略,构建基因剔除载体pBR322-MK-MCS-TAFA2,以电穿孔方法将基因剔除载体导入ES细胞,用G418和Ganciclovoir进行正负筛选,获得双抗性克隆,PCR鉴定出正确同源重组的ES细胞克隆. 结果 同源重组的ES细胞注入小鼠囊胚后获得嵌合体小鼠,嵌合体小鼠与C57BL/6J小鼠交配后获得Aguoti（野生型）毛色的小鼠41只,其中14只为TAFA2基因剔除杂合子小鼠,阳性率为34.1%.在雌、雄杂合子小鼠交配的后代中获得纯合子小鼠,初步的表型观察未发现TAFA2基因剔除小鼠出现异常改变. 结论 已成功建立了TAFA2基因剔除小鼠模型,其中纯合子小鼠未出现胚胎致死现象.     

成熟成骨细胞中敲除基因fgfr1小鼠的制备

目的 制备在成熟成骨细胞中敲除基因fgfr1的特定细胞阶段性基因敲除小鼠.方法 从美国NIH引进SPF级fgfr1条件性基因敲除(fgfr1flox/flox)小鼠,进行饲养、繁殖和PCR鉴定;fgfr1flox/flox小鼠与在成熟成骨细胞表达Cre重组酶的OC-Cre小鼠交配,获得在成熟成骨细胞中敲除一个基因拷贝的杂合子小鼠;杂合子小鼠之间交配,或者杂合子小鼠与fgfr1flox/flox小鼠交配,可以获得在成熟成骨细胞中敲除fgfr1基因的小鼠fgfr1△/△/OC-CreTG/ .结果 成功制备在成熟成骨细胞中敲除fgfr1的细胞特异性敲除小鼠.结论 成功引进fgfr1flox/flox小鼠,应用合理的基因条件性敲除繁殖策略,获得在成熟成骨细胞中敲除fgfr1的基因敲除小鼠.     

Lck-Cre×Perp^flox/flox条件敲除小鼠的繁育及基因型鉴定

目的 制备Cre-LoxP重组酶系统调控下的T淋巴细胞Perp基因条件性敲除的纯合子小鼠并进行鉴定,为进一步在整体动物水平研究Perp基因在T细胞发育以及在自身免疫疾病发病中的作用提供研究平台.方法 将引进的Perp条件敲除小鼠和T淋巴细胞特异性表达Cre重组酶的Lck-Cre小鼠分别进行繁殖和鉴定,然后将两种小鼠进行杂交并对其子代小鼠的基因型进行鉴定,其子代基因型为Lck-Cre×Perpflox/flox的小鼠即为本实验所构建的T细胞Perp基因特异性敲除的纯合子小鼠.结果 Lck-Cre×Perp^flox/flox的纯合子小鼠被繁殖成功并准确鉴定.Lck-Cre×Perp^flox/flox小鼠脾脏CD3-细胞的Perp基因的RNA及蛋白表达水平与Lck-Cre×Perp^＋/＋小鼠相比显著降低.结论 本研究利用Cre-LoxP技术成功构建了T细胞特异性敲除Perp基因的纯合子小鼠,为进一步研究Perp基因在T淋巴细胞发育以及自身免疫性疾病发病中的作用提供了优良的工具.     

Tex101条件性基因敲除小鼠模型的建立和表型鉴定

目的建立Tex101（Testis expressed gene101）条件性基因敲除小鼠模型并进行表型鉴定。方法构建针对小鼠Tex101基因2、3号外显子的重组载体,通过电穿孔的方法转染胚胎干细胞（ES细胞）,用正负筛选法筛选阳性ES细胞并进行PCR鉴定。利用显微注射把发生正确同源重组的ES细胞注射进C57BL／6J小鼠囊胚,移人受体小鼠子宫。将得到的嵌合体小鼠与C57BL／6J雌鼠交配获得Tex101-LoxP转基因小鼠。该小鼠与EⅡa—Cre转基因小鼠杂交,通过子代自交获得Tex101条件性基因敲除（cKO）小鼠并进行初步分析。结果得到2只Tex101cKO雄鼠。冰冻切片观察发现Texl01cKO雄鼠睾丸形态和大小与野生型小鼠相比无明显差异。结论成功建立了Tex101条件性基因敲除小鼠模型,并初步验证了该基因对雄性小鼠睾丸大小和形态无明显影响,为进一步研究Tex101基因功能奠定了基础。     

登革2型病毒NS1-NS2a基因真核表达载体的构建及鉴定

目的 构建登革2型病毒NS1-NS2a基因真核表达质粒.方法 RT-PCR扩增NSI-NS2a基因片段后,将其克隆人真核表达载体pReceiver-M01a;过PCR、酶切、测序和间接免疫荧光染色鉴定重组质粒.结果 经PCR扩增、酶切和测序验证,重组质粒构建正确,命名为pRe-NS1-NS2a;重组质粒转染Vero细胞后,间接免疫荧光染色显示细胞质中有登革2型病毒特异性蛋白的表达.结论 成功构建了真核表达质粒pRe·NS1-NS2a.     

神经系统SARM1条件性敲除小鼠的构建及其应用

目的：构建SARM1基因在神经细胞中条件性敲除小鼠模型,为探究SARM1基因在神经系统中的功能提供研究工具。方法：运用ES细胞打靶的方式构建SARM1flox/flox转基因小鼠,并将其与表达Nestin-Cre重组酶的工具鼠进行杂交以产生神经元特异性SARM1基因敲除小鼠。然后使用PCR对敲除小鼠进行基因型鉴定,使用Western blot验证基因敲除效果。通过对小鼠进行旷场与高架十字迷宫试验来评估小鼠的情绪行为和焦虑水平。结果：SARM1蛋白主要表达于中枢神经系统,在神经元中高表达。PCR结果表明,成功构建了神经元特异性SARM1基因敲除小鼠。Western blot结果显示,与正常小鼠对比,SARM1Nestin-CKO小鼠的脑组织中SARM1蛋白表达显著降低（P＜0.05）,并且SARM1基因敲除不影响小鼠的正常生长发育,也不影响脑组织的一般形态和神经细胞的数量。同时发现该条件性敲除小鼠不存在明显的焦虑样表型。结论：成功构建了SARM1基因在神经细胞中特异性敲除的小鼠动物模型,可为探讨SARM1基因在神经精神疾病中的作用提供重要研究平台。     

神经干细胞特异性PPARγ基因敲除小鼠模型的制备与鉴定

目的制备与鉴定神经干细胞特异性PPARγ基因敲除小鼠模型。方法将引进的2种转基因小鼠B6.PPARγloxp/loxp、B6.
Nestin-Cre 进行饲养并杂交繁殖,将子一代小鼠与B6.PPARγloxp/loxp 小鼠回交获得子二代小鼠,提取子二代小鼠的基因组
DNA,利用PCR方法扩增Cre 和loxp 基因片段,并进行琼脂糖凝胶电泳检测。选取基因型为B6.PPARγloxp/loxp.Nestin-Cre
（KO）的小鼠即为神经干细胞特异性敲除PPARγ的敲除小鼠,另选基因型为B6.PPARγloxp/loxp（loxp）作为对照组小鼠。应用
RT-PCR、实时荧光定量PCR方法鉴定神经干细胞特异性敲除PPARγ的敲除小鼠。结果敲除小鼠在基因鉴定时可以扩增得到
PPARγloxp和Cre两个条带,在mRNA表型检测时脑内PPARγ表达显著低于对照组小鼠。成功获得神经干细胞敲除PPARγ基
因的敲除小鼠。所购2种转基因小鼠均有繁殖能力,其繁殖符合孟德尔遗传规律。结论基于loxp-Cre系统成功构建神经干细
胞特异性敲除PPARγ的基因敲除小鼠,为进一步的神经系统疾病的治疗及其机制研究提供模型基础。
     

基于Cre/loxP系统的糖皮质激素受体基因条件性打靶嵌合鼠的获得

目的:应用Cre/loxP系统建立诱导型糖皮质激素受体(GR)基因剔除小鼠模型,为在体内直接进行GR基因的研究提供条件.方法:针对GR基因第2外显子构建诱导型目标载体,将打靶载体电穿孔转染胚胎干细胞(embryonic stem cell,ES),经Southern杂交筛选发生正确同源重组的ES细胞,囊胚注射法制备嵌合体并进行生殖系检测及纯化建系.结果:成功构建了针对GR基因第2外显子的诱导型目标载体,转染ES细胞获得了工程化的ES细胞,经囊胚注射获得了由工程化的ES细胞和体细胞共同发育而来的嵌合体小鼠.结论:基于Cre/loxP系统的GR基因条件性打靶嵌合鼠的获得,为得到理想的诱导型GR基因剔除小鼠模型奠定了基础.     

Unc13基因胰岛β细胞条件性敲除小鼠模型的构建和鉴定

目的 构建Cre重组酶系统调控的Unc13基因胰岛β细胞条件性敲除小鼠,为Unc13基因在胰岛素分泌中扮演的角色和作用机制的体内实验研究提供更特异的动物模型。方法 运用CRISPR/Cas9技术构建Unc13^flox/flox转基因小鼠,将其与胰岛β细胞特异性表达Cre重组酶（Ins2-cre）工具鼠进行杂交,采用聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）和测序等方法对其子代小鼠的基因型进行鉴定,并对该基因敲除（knock out,KO）小鼠及其同窝野生（wild type,WT）小鼠的体质量、糖耐量、胰岛素分泌水平进行测定。结果 成功构建胰岛β细胞特异性Unc13基因条件性敲除小鼠（以下简称为Unc13 KO鼠）。进一步研究显示Unc13 KO鼠与WT鼠相比,体质量无明显变化,但糖耐量受损,胰岛素第一时相分泌下降。结论 成功构建了Unc13基因胰岛β细胞条件敲除小鼠动物模型,为探讨Unc13基因在糖尿病发生、发展中的作用提供研究平台。     

睾丸特异性表达GFP小鼠的繁殖及其表型鉴定

目的 繁殖睾丸特异性表达绿色荧光蛋白（GFP）小鼠,为进行小鼠生殖系统的研究提供有效的工具。方法 将Ddx4-cre转基因雄鼠与Rosa26mT/mG转基因雌鼠交配,通过Cre/loxP重组系统产生睾丸特异性表达GFP小鼠,利用分子、病理及活体成像的方法,从器官、细胞、分子水平上对该鼠进行表型鉴定。结果 分子水平的结果表明在这种小鼠的睾丸组织中发生了Cre酶介导的特异性基因重组;从器官水平上可以看到在这种小鼠的睾丸组织中具有GFP的表达;睾丸冰冻切片及精子荧光观察显示GFP主要表达于次级精母细胞、精子细胞和精子中。结论 睾丸特异性表达GFP小鼠繁殖成功。     

逆转录病毒转导的重组酶Cre在体外对LoxP标记的小鼠骨髓细胞DNA重组

目的：研究逆转录病毒体系转导的重组酶Cre在体外对LoxP标记的基因组进行重组的能力．方法：用逆转录病毒表达Cre，体外感染条件性基因剔除(即LoxP标记的基因)小鼠来源的原代培养的骨髓细胞．从被感染的骨髓细胞中提取基因组DNA，利用PCR的方法显示LoxP标记的基因组长度的剪切前后改变，从而反映Cre在体外对LoxP标记的基因组的重组力．结果：被表达有Cre的逆转录病毒感染后的骨髓细胞，其特定的基因组长度发生了预期的变化，被标记的片段部分发生缺失．结论：在体外，用逆转录病毒体系转导重组酶Cre能够有效地对LoxP标记的基因组进行重组．为用这一方法在体外研究特异基因对细胞生物学行为的影响奠定基础。     

Pax-8基因在心脏发育中蛋白表达下调

目的：观察Pax-8基因在ALK3基因敲除小鼠心脏中的蛋白表达情况,探讨Pax-8基因在心脏发育中的作用。方法：基因芯片（microarray）和定量逆转录-聚合酶链反应测定ALK3基因的下游基因,免疫组化法检测13.5 d小鼠胚胎心脏特异性ALK3基因敲除小鼠胚胎中Pax-8蛋白的表达,连续病理切片及HE染色观察刚出生的Pax-8基因敲除小鼠的心脏形态。结果：在心脏特异的ALK3基因敲除小鼠中,转录因子Pax-8基因mRNA的表达水平上被下调7.1倍。免疫组化结果显示：13.5 d小鼠胚胎心脏特异性ALK3基因敲除的纯合子小鼠Pax-8基因在蛋白水平与杂合子相比也明显下调。Pax-8基因敲除小鼠纯合子有明显的室间隔和左心室肥厚,心脏呈球形。结论：Pax-8基因是ALK3基因的下游基因,与心脏发育有密切关系。     

Regulation of Fengxiaofang on Expression of Gene Gob-5 in Asthmatic Mice

Abstract: Objective To observe the regulation of Fengxiaofang on the expression of gene Gob-5 in ovalbumin-challenged asthmatic mice. Methods The murine model of allergic asthma established by ovalbumin was used. The model mice were treated experimentally with Fengxiaofang and Dexamethasone as a positive control. The quantitive expression of gene Gob-5 in lung of mice was detected by real-time quantitative PCR. Results The expression of gene Gob-5 in lung of mice was down-regulated by Fengxiaofang. In the experiment, there were no significant differences between the one-fold or ten-fold dosage groups and the normal control group. Gene Gob-5 expression in five-fold dosage was significantly lower than that in the normal control group. Conclusion Fengxiaofang has the effect of lowering the expression of gene Gob-5 which maybe related to the potency on asthmatic disease.     

Afp-cre-lacZ转基因小鼠的构建

目的 研究甲胎蛋白(Afp)阳性细胞的增殖分化在组织生长修复,肿瘤发生过程中的作用,建立Afp-CreERT转基因小鼠细胞示踪系统.方法 采用DNA雄原核显微注射方法获得Afp-CreERT转基因小鼠,筛选出合适的品系后,使之与Rosa26-lacZ工具小鼠杂交,获得Cre/lacZ双阳性的Afp-cre-lacZ转基因小鼠.结果 显微注射后,共出生小鼠56只,经PCR鉴定Cre阳性小鼠共4只,阳性小鼠传代后各为一系.筛选内源性Afp表达与Cre表达相对符合的品系作为Afp-CreERT转基因小鼠品系建系.Afp-CreERT转基因小鼠与Rosa26-lacZ工具小鼠杂交,经PCR鉴定后获得Cre/lacZ双阳性的Afp-cre-lacZ转基因小鼠.经实时PCR,X-gal染色,免疫荧光染色鉴定后得到Afp-cre-lacZ转基因小鼠细胞示踪系统,同时证实该系统能够正确示踪Afp表达阳性的细胞,同时也能够应用于肝损伤小鼠模型中.结论 成功构建了Afp-cre-lacZ转基因小鼠细胞示踪系统,为研究这类细胞的谱系发生提供了工具.     

高表达CYP2C8基因对动脉粥样硬化小鼠肿瘤坏死因子-α的影响

目的研究血管内皮高表达CYP2C8基因对动脉粥样硬化小鼠肿瘤坏死因子-α（TNF-α）表达的影响。方法以20周龄APOEKO＋/-CYP2C8Tg＋/-和CYP2C8Tg＋/-基因（血管内皮转CYP2C8＋/-基因）的小鼠为研究对象,相同基因背景和周龄的同窝APOEKO＋/-和C57BL/6小鼠设为对照。采用PCR技术鉴定小鼠CYP2C8＋/-基因;油红O染色检测APOEKO＋/-CYP2C8Tg＋/-、CYP2C8Tg＋/-、APOEKO＋/-和C57BL/6小鼠主动脉斑块形成面积;用Real-time PCR法检测各组小鼠的主动脉TNF-α基因表达水平;Western blot法分析各组小鼠主动脉TNF-α蛋白的表达情况;用ELISA法检测各组小鼠的血浆TNF-α水平。结果 APOEKO＋/-CYP2C8Tg＋/-和CYP2C8Tg＋/-小鼠主动脉斑块形成面积明显减少。Real-time PCR分析显示,高表达CYP2C8在主动脉中明显下调TNF-α基因的表达;Western blot分析结果显示,高表达CYP2C8在主动脉中明显下调TNF-α蛋白活性。在血清学上,高表达CYP2C8明显下调TNF-α水平。结论高表达CYP2C8基因能够降低动脉粥样硬化小鼠的TNF-α的活性。