炎性痛小鼠脑内3种环氧合酶亚型的变化及不同选择性环氧合酶抑制剂的镇痛效应比较

目的:比较炎性疼痛小鼠脑内环氧合酶1、环氧合酶2及环氧合酶3的表达变化,以及选择性环氧合酶抑制剂单独或联合应用后的镇痛效应。方法:实验于2004-03-01/12-20在第四军医大学药理教研室完成。138只小鼠足底注射甲醛溶液诱导炎性痛。①用54只小鼠放射免疫分析及54只小鼠反转录聚合酶链反应评估脑环氧合酶1、环氧合酶2及环氧合酶3在甲醛溶液注射前、注射后1,12h,1,3,7,14,30,60d的变化(升高表示疼痛增强)。②30只小鼠随机分成5组,每组6只。对照组灌胃生理盐水0.3mL;SC-560组灌胃SC-560(环氧合酶1选择性抑制剂)300μg/kg;NS-398组灌胃NS-398(环氧合酶2选择性抑制剂)150μg/kg;吲哚美辛组灌胃吲哚美辛(低选择性环氧合酶抑制剂)300μg/kg;以上各组灌胃1次/d,连续2个月。NS-398+SC-560组前1个月灌胃NS-398300μg/kg,后1个月灌胃SC-560150μg/kg,1次/d。应用行为学测定各组动物在甲醛溶液注射前、注射后1,12h,1,3,7,14,30,60d对热痛刺激的反应时间(延长表示热痛敏感性下降)。结果:①甲醛溶液注射前、后环氧合酶的表达:108只小鼠环氧合酶2在注射后12h,3d升高显著(P<0.05),环氧合酶1在注射后14d,30d,60d升高显著(P<0.05)。在整个观察时限内环氧合酶3的表达无明显变化。②对热痛刺激的反应时间:注射甲醛溶液的30只小鼠均出现对热痛刺激反应时间的明显缩短。与对照组相比,NS-398+SC-560组反应时间明显较长。NS-398组动物在注射后1,12h,1,3d对热痛刺激反应时间明显延长。SC-560组动物在整个观察过程中均未出现热痛刺激反应时间的改变。吲哚美辛组对热痛刺激反应时间明显短于NS-398+SC-560组而长于SC-560组。结论:与单纯使用环氧合酶1或环氧合酶2抑制剂相比,早期应用环氧合酶2抑制剂结合后期应用环氧合酶1抑制剂对炎性痛有更好的镇痛效应。     

炎性痛小鼠脑内3种环氧合酶亚型的变化及不同选择性环氧合酶抑制剂的镇痛效应比较

目的：比较炎性疼痛小鼠脑内环氧合酶1、环氧合酶2及环氧合酶3的表达变化，以及选择性环氧合酶抑制剂单独或联合应用后的镇痛效应。方法：实验于2004—03—01／12—20在第四军医大学药理教研室完成。138只小鼠足底注射甲醛溶液诱导炎性痛。①用54只小鼠放射免疫分析及54只小鼠反转录聚合酶链反应评估脑环氧合酶1、环氧合酶2及环氧合酶3在甲醛溶液注射前、注射后1，12h，1，3，7，14，30，60d的变化(升高表示疼痛增强)。②30只小鼠随机分成5组，每组6只。对照组灌胃生理盐水0．3mL；SC-560组灌胃SC-560(环氧合酶1选择性抑制剂)300μg／kg；NS-398’组灌胃NS-398(环氧合酶2选择性抑制剂)150μg／kg；吲哚美辛组灌胃吲哚美辛(低选择性环氧合酶抑制剂)300μg／kg；以上各组灌胃1次／d，连续2个月。NS-398+SC-560组前1个月灌胃NS-398300μg／kg，后1个月灌胃SC-560150μg／kg，1次／d。应用行为学测定各组动物在甲醛溶液注射前、注射后1，12h，1，3，7，14，30，60d对热痛刺激的反应时间(延长表示热痛敏感性下降)。结果：①甲醛溶液注射前、后环氧合酶的表达：108只小鼠环氧合酶2在注射后12h，3d升高显著(P&;lt;0．05)，环氧合酶1在注射后14d，30d，60d升高显著(P&;lt;0．05)。在整个观察时限内环氧合酶3的表达无明显变化。②对热痛刺激的反应时间：注射甲醛溶液的30只小鼠均出现对热痛刺激反应时间的明显缩短。与对照组相比，NS-398+SC-560组反应时间明显较长。NS-398组动物在注射后1，12h，1，3d对热痛刺激反应时问明显延长。SC-560组动物在整个观察过程中均未出现热痛刺激反应时间的改变。吲哚美辛组对热痛刺激反应时间明显短于NS-398+SC-560组而长于SC-560组。结论：与单纯使用环氧合酶1或环氧合酶2抑制剂相比，早期应用环氧合酶2抑制剂结合后期应用环氧合酶1抑制剂对炎性痛有更好的镇痛效应。     

NS-398对骨肉瘤细胞趋化功能的抑制作用及其机制研究

[目的]观察特异性环氧合酶抑制剂NS-398对骨肉瘤细胞株(MG-63)体外趋化和侵袭能力及VEGF-A表达的影响,以探讨特异性COX-2抑制剂对骨肉瘤体外转移能力的作用及机制.[方法]用趋化小室研究NS-398对肿瘤细胞趋化和侵袭能力的影响;用RT-PCR检测COX-2、VEGF-A在MG-63细胞的表达及NS-398对其的影响.[结果]NS-398可明显抑制MG-63细胞的趋化和侵袭能力,同时可降低VEGF-A的表达,但并不影响其COX-2的表达.[结论]COX-2抑制剂NS-398能抑制骨肉瘤细胞的转移,其机制与抑制肿瘤细胞的VEGF-A生成有关,有望成为抗肿瘤新药.     

阿托伐他汀对高糖诱导的系膜细胞凋亡的影响

目的探讨不同浓度阿托伐他汀对大鼠系膜细胞凋亡的影响。方法体外培养大鼠永生系膜细胞,分为5组:对照(C)组;高糖(30mmol/L)(H)组;高糖(30mmol/L)+阿托伐他汀(10-7 mmol/L)(H+A1)组;高糖(30mmol/L)+阿托伐他汀(10-6 mmol/L)(H+A2)组;高糖(30mmol/L)+阿托伐他汀(10-5 mmol/L)(H+A3)组。采用Annexin V-FITC和PI双染法检测细胞凋亡。采用caspase-3活性检测试剂盒检测系膜细胞caspase-3活性。结果与C组相比,H组系膜细胞凋亡率明显增加,caspase-3活性明显增加,差异有统计学意义(P0.05)。与H组相比,高糖加不同浓度阿托伐他汀组细胞凋亡率明显降低,caspase-3活性明显降低,差异有统计学意义(P0.05),且呈浓度依赖。结论阿托伐他汀可以通过caspase途径抑制醛固酮诱导的大鼠系膜细胞凋亡。     

中药复方制剂消可宁对高糖诱导大鼠肾小球系膜细胞增殖的影响

目的:观察中药复方制剂消可宁对高糖培养的大鼠肾小球系膜细胞增殖的抑制作用。方法:实验于2004-04/11在南京医科大学第一附属医院内分泌代谢研究中心细胞培养研究室完成。①中药复方制剂消可宁(由制大黄、制附子、生黄芪组成,南京军区南京总医院制剂科生产,药品批号:院临(2003)第01017号,规格为90mL/袋)。大鼠系膜细胞株HBZY-1购自武汉大学中国典型培养物保藏中心。②将购入的系膜细胞株消化培养,取培养4～8代的细胞,吸去培养瓶中的上清液,消化离心后混匀,锥虫蓝染色观察细胞活性。③不同刺激时间系膜细胞增殖实验设立3组,正常糖浓度组每孔加入5.6mmol/L葡萄糖溶液200μL,高糖对照组每孔加入30mmol/L葡萄糖溶液200μL,高糖 消可宁组每孔加入30mmol/L葡萄糖与0.06g/mL消可宁混合液200μL,6孔/组。各组分别于培养24,48,72h后向板孔中加5g/L的4-甲基偶氮四唑蓝20μL,于酶标仪492nm波长处检测吸光度值。④不同浓度消可宁刺激高糖环境下系膜细胞增殖实验设立7组,高糖对照组每孔加入30mmol/L葡萄糖溶液200μL,消可宁20,40,60,80,120,200g/L组每孔加入30mmol/L葡萄糖 对应浓度的消可宁混合液200μL,6孔/组。培养72h后各组向板孔中加5g/L的4-甲基偶氮四唑蓝20μL,同法检测吸光度值。结果:①系膜细胞活性观察:原代培养的4～8代系膜细胞,经锥虫蓝染色,着色的死亡细胞数<5%,未着色活细胞数>95%。②不同刺激时间各组系膜细胞增殖情况的比较:与正常糖浓度组比较,高糖对照组于高糖刺激24h即可促进系膜细胞的增殖,且这种作用在刺激48h时最为明显,至72h细胞数量开始减少,但仍明显高于正常糖浓度组(0.527±0.047,0.659±0.018,P<0.05)。与高糖对照组比较,高糖 消可宁组在24h内并未表现出抑制系膜细胞增殖的作用,而刺激48h后显示出抑制趋势,但差异无显著性意义,于72h后表现出较强的抑制系膜细胞增殖的效应(0.659±0.018,0.538±0.023,P<0.05)。③不同浓度消可宁刺激对高糖环境下系膜细胞增殖的影响:刺激72h后与高糖对照组比较,20,40g/L的消可宁能够部分阻止系膜细胞的增殖;60,80g/L的消可宁则表现出明显阻止高糖对系膜细胞的过度刺激作用,且随着浓度的增加,抑制作用逐渐增强;浓度升至120g/L时出现细胞脱落死亡,高达200g/L时则不见存活的细胞。结论:消可宁能够有效抑制高糖诱导的系膜细胞增殖,可能是其早期防治糖尿病肾病的细胞学基础。     

黄芪皂甙对大鼠肾小球系膜细胞增殖及周期的影响

目的:从细胞水平观察黄芪皂甙对大鼠肾小球系膜细胞增殖及细胞周期的影响,拟验证黄芪皂甙对系膜细胞增殖影响与其浓度的相关性.方法:实验于2006-12/2007-07在辽宁医学院生理实验室完成.取高糖培养的第4～7代大鼠肾小球系膜细胞,随机分为对照组,黄芪皂甙50,100,200mg/L组4组,分别给予等量的高糖培养液及50,100,200mg/L黄芪皂甙,在给药后培养48 h,用MTT比色法检测细胞增殖程度,流式细胞仪检测细胞周期.结果:①MTT法显示培养48 h后,黄芪皂甙50,100,200mg/L组的吸光度值A490nm低于对照组(P＜0.01),且随黄芪皂甙浓度增加而递减.②流式细胞仪检测显示培养48h后,黄芪皂甙50,100,200mg/L组的G0/G1值高于对照组(P＜0.01),且随黄芪皂甙浓度增加而递增.结论:在一定质量浓度范围(50～200 mg/L)内,黄芪皂甙可抑制肾小球系膜细胞增殖,阻止细胞周期进程.     

选择性COX-2抑制剂NS-398对人胃腺癌细胞增殖和凋亡的影响

目的通过COX-2抑制剂NS-398对胃癌培养细胞系SGC7901增殖及凋亡影响的研究证实非甾体类抗炎药（NSAID。）可在体外抑制胃癌细胞的生长。方法应用MTT法检测NS-398对胃癌细胞SGC7901细胞增殖的影响；应用流式细胞仪、透射电镜检测NS-398对胃癌细胞SGC7901细胞凋亡的影响。结果MTT结果显示NS-398对胃癌细胞均抑制作用，并随剂量的增加及作用时间延长，其抑制作用要明显增加；透射电镜观察发现未经NS-398作用的胃癌培养细胞的细胞核和细胞器亚微结构清晰，核模完整，而经不同浓度的舒林酸和尼美舒利作用后细胞呈现典型的凋亡形态学变化，并可见凋亡小体形成；流式细胞仪结果显示不同浓度的NS-398作用SGC7901细胞72h后，均可出现亚G1峰，呈剂量依赖关系诱导胃癌细胞凋亡，并呈浓度依赖性改变的细胞周期分布，一方面增高G0／G期细胞比例，另一方面降低S期和G2／M期细胞比例。结论NS-398可抑制胃癌SGC7901细胞的增殖；NS-398促进胃癌SGC7901细胞的凋亡；NS-398抑制胃癌的机制可能是通过抑制胃癌细胞COX-2的活性，从而抑制前列腺素E2的释放而抑制胃癌细胞的生长。     

消可宁对高糖状态下大鼠肾小球系膜细胞增殖的调控效应

背景:中药对早期糖尿病肾病有较好的防治作用,这一作用是基于中药有效成分的多样性而作用于糖尿病肾病不同靶点所引起的。目的:观察消可宁对高糖培养的大鼠肾小球系膜细胞增生的影响,并探讨其可能的作用机制。设计:对照观察。单位:南京医科大学第一附属医院内分泌科。材料:实验于2003-07/2004-05在南京医科大学第一附属医院内分泌代谢研究中心细胞培养研究室完成。大鼠系膜细胞株HBZY-1:购自武汉大学中国典型培养物保藏中心。方法:系膜细胞按说明进行传代培养备用。①不同刺激浓度分组:高糖 消可宁组(消可宁分别取20.0,40.0,60.0,80.0,120.0,200.0g/L);正常糖对照组,细胞液中葡萄糖浓度为5.6mmol/L;高糖对照组,细胞液中葡萄糖浓度为30mmol/L,分别刺激72h进行观察。不同刺激时间分组:正常糖对照组,细胞液中葡萄糖浓度为5.6mmol/L;高糖对照组,细胞液中葡萄糖浓度为30mmol/L;高糖 消可宁组,细胞液中葡萄糖浓度为30mmol/L,消可宁浓度为60g/L;3组分别在刺激24,48,72h给予观察。②将配置好的细胞悬液放入96孔培养板,每孔加200μL。培养板放置体积分数为0.05CO2,37℃孵箱24h后,取出弃上清,加入各组含不同药物及浓度的细胞液,每孔200μL。将96孔板放入37℃含体积分数为0.05的CO2空气和100%湿度培养箱中孵育。不同刺激浓度组别于72h后分别向板孔中加20μL4-甲基偶氮四唑蓝(5g/L),不同刺激时间组别于24,48,72h后分别向板孔中加20μL4-甲基偶氮四唑蓝(5g/L),之后均在37℃培养箱中温育4h,置镜下观察4-甲基偶氮四唑蓝掺入细胞内,吸出上清,加入150μL二甲基亚砜使用甲醇溶解,用平板摇床摇匀振荡30s,于酶标仪492nm波长读数,并记录吸光度值。主要观察指标:不同培养时间及不同消可宁培养浓度下系膜细胞增殖情况(吸光度值)。结果:①不同刺激时间各组系膜细胞增殖的情况:(下转第201页)高糖对照组刺激24,48,72h系膜细胞吸光度值分别为0.685±0.010,0.750±0.087,0.659±0.018,高于正常糖对照组(0.586±0.054,0.598±0.040,0.527±0.047,P<0.05),高糖对照组及正常糖对照组葡萄糖刺激系膜细胞48h吸光度值高于24h(P<0.05),刺激72h吸光度值低于48h,(P<0.05)。高糖 消可宁组药物刺激72h后系膜细胞吸光度值为0.538±0.023,低于高糖对照组(P<0.05)。②不同浓度消可宁刺激系膜细胞增生情况:消可宁自浓度为60.0g/L起,可明显的阻止高糖对系膜细胞的过度刺激作用,并随着浓度的增加,这种作用逐渐增强,但过高的浓度(120.0g/L)则出现细胞脱落死亡,极高的药物浓度(200.0g/L)则不见存活的细胞。结论:高糖培养的系膜细胞在消可宁刺激72h后表现出较强的抑制系膜细胞增殖的作用,在一定范围内呈剂量依赖的方式,但过高的药物浓度又表现出很强的细胞毒性。     

环氧化酶2抑制剂对体外缺氧大鼠心肌细胞凋亡的影响

目的观察体外培养心肌急性缺氧条件下环氧化酶-2(COX2)抑制剂与细胞凋亡间的关系.方法分离、培养Wistar大鼠心肌细胞.以第4～6代心肌细胞24份样本(每份1×105个细胞)随机分为正常对照组、单纯缺氧组、缺氧+COX-2抑制剂(NS-398,20 μmol/L)组及缺氧+阿司匹林(100 μg/L)组.缺氧前30 min加入干预药物或等量二甲亚砜.以蛋白质免疫印迹法检测心肌细胞中COX-1/2表达;流式细胞仪检测心肌细胞凋亡率;放射免疫法(RIA)检测心肌细胞培养液中6-酮-前列腺素F1α(6-ketoPGF1α)、血栓素B2(TXB2)含量.结果各组心肌细胞中COX-1表达差异无显著性;COX2表达均较正常对照组增高,阿司匹林与NS-398均不抑制COX2表达.心肌细胞凋亡率由高到低依次为缺氧+NS-398组、缺氧+阿司匹林组、单纯缺氧组和正常对照组;缺氧+NS-398组与其他各组间比较差异均有显著性(P均<0.05).各组心肌细胞培养液内TXB2水平由低到高依次为正常对照组、缺氧+NS-398组、缺氧+阿司匹林组和单纯缺氧组;缺氧+NS-398组与单纯缺氧组比较差异有显著性(P<0.05);6-keto-PGF1α水平由低到高依次为正常对照组、缺氧+NS-398组、缺氧+阿司匹林组和单纯缺氧组;缺氧+NS-398组与单纯缺氧组比较差异有显著性(P<0.05);TXB2/6-keto-PGF1α比值差异无显著性.结论急性缺氧可直接诱导培养心肌细胞表达COX-2,而COX-1表达不增加,缺氧使培养液内COX-2作用产物TXB2、6keto-PGF1α水平升高,此效应无中性粒细胞、巨噬细胞等炎症细胞参与.COX-2抑制剂NS-398可降低缺氧心肌培养液内TXB2、6-keto-PGF1α升高程度,但不改变TXB2/6keto-PGF1α比值.急性缺氧可直接诱导心肌细胞凋亡,NS398可显著增加缺氧培养心肌凋亡率,此效应不需要其他组织细胞参与.     

高糖对大鼠肾小球系膜细胞LPA3（edg-7）表达影响及姜黄素的干预作用

目的探讨高糖对大鼠肾小球系膜细胞增殖及其LPA3（edg-7）表达和姜黄素的干预作用。方法体外培养大鼠肾系膜细胞,同步后采用高浓度的葡萄糖（30mmol/l）联合不同浓度姜黄素进行干预处理。应用MqT测量高糖及不同浓度姜黄素干预后肾小球系膜细胞增殖活力。应用RT-PCR检测正常培养及高糖作用后大鼠肾小球系膜细胞LPA3（edg-7）的表达及不同浓度姜黄素对其表达的影响。结果高糖促进大鼠系膜细胞增殖,上调LPA3（edg-7）的表达。姜黄素可抑制高糖刺激引起的系膜细胞增殖,下调LPA3（edg-7）表达。当姜黄素浓度大于或等于10／μmol／L时,系膜细胞增殖明显受到抑制（P〈0．05）,且表现为浓度依赖性。在基础状态下,系膜细胞表达一定量的LPA3（edg-7）,经高糖刺激后,LPA3（edg-7）基因表达上调;姜黄素可下调高糖刺激引起的LPA3（edg-7）mRNA高表达,当姜黄素浓度为20μmol／L时能明显下调高糖刺激引起的系膜细胞LPA3（edg-7）基因表达（P〈0．05）,且随其浓度增高,抑制作用有增强趋势。结论姜黄素能抑制高糖刺激大鼠肾系膜细胞增殖并可下调高糖刺激引起的LPA3（edg-7）基因表达。LPA3（edg-7）基因表达与肾小球系膜细胞增殖成正相关,下调LPA3（edg-7）表达,可能为姜黄素抑制肾小球系膜细胞增殖的作用途径之一。