多瘤病毒MT基因真核表达载体的构建

目的：构建携带多瘤病毒MT癌基因的真核细胞表达载体。方法：从野生型多瘤病毒上取其nt4632至nt1560片段克隆到pUC19上,再将该片段定点插入pEGFP1的HindⅢ和CcoR Ⅰ位点间,构建携带多瘤病毒MT癌基因的真核表达载体pPyMT-GFP。经线性化,将重组体导入鼠皮肤成纤维细胞中,G418选择培养,得到抗性细胞克隆。结果：构建的pPyMT-GFP质粒在鼠成纤维细胞中有稳定表达,结论：来源于野生型多瘤病毒的PyMT基因在哺乳动物细胞中有稳定表达,其真核表达载体pPyMT-GFP可被进一步用于研究PyMT蛋白在血管瘤发生中的作用。     

人lrg真核表达载体的构建和初步分析

目的：在真核细胞中表达人lrg基因。方法：构建野生型人lrg的真核表达载体，体外转染肝癌细胞系HepG2，并进行稳定筛选。用Western Blot、SABC-FITC进行人lrg基因表达的鉴定。结果：成功构建了人lrg的真核表达载体pcDNA3．1( )／hlrg，Western Blot和SABC-FITC等实验表明该基因在HepG2中进行了表达。结论：在HepG2中稳定表达了pcDNA3．1( )／hlrg，为深入探讨人lrg基因的功能奠定了基础。     

头颈部肿瘤中FHIT基因的研究

FHIT基因是人染色体 3p14 .2分离出来的一个新的候选抑癌基因 ,在多种肿瘤中都有异常改变。本文就FHIT基因在头颈部肿瘤中的研究进展进行讨论     

头颈部肿瘤中FHIT基因的研究

FHIT基因是人染色体3p14.2分离出来的一个新的候选抑癌基因,在多种肿瘤中都有异常改变.本文就FHIT基因在头颈部肿瘤中的研究进展进行讨论.     

癌胚抗原基因真核表达载体的构建

目的：克隆人癌胚抗原（CEA）基因cDNA,构建pcDNA3．1-CEA真核表达载体。方法：采用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）技术,从人结肠癌细胞组织克隆出CEA基因片段,通过基因重组技术将该基因片段重组于pcD—NA3．1真核表达载体上,构建成pcDNA3．1-CEA重组质粒,分别用PCR扩增、酶切电泳分析及DNA测序的方法对重组DNA进行鉴定。结果：经PCR扩增,发现2.1kb的目的基因条带、双酶切电泳分析可见2．1kb的目的基因条带和5．4kb的载体条带、单酶切电泳分析可见0．9kb的条带和6．6kb的条带、DNA测序证实载体中的目的基因序列与CEA的cDNA序列完全相同。结论：本实验成功地克隆了CEA基因并构建了其真核表达质粒,为进一步研究CEA真核表达载体抗肿瘤的实验打下基础。     

釉成熟蛋白真核表达载体的构建及其在293T细胞中的表达

目的:构建釉成熟蛋白真核表达载体peDNA3.1-Amelotin,并观察其在293T细胞中的表达情况.方法:以出生后6d的昆明小鼠下颌磨牙中提取的总RNA为模板,设计合成特异性引物,通过RT-PCR法扩增小鼠的釉成熟蛋白[Amelotin(GenelD:71421)],包括编码区全长在内的部分cDNA序列,克隆到pMD18-T克隆载体,酶切鉴定正确;然后亚克隆至pcDNA3.1真核表达载体中,双酶切鉴定及测序正确.将构建的重组载体磷酸钙法转染293T细胞,检测Amelotin的表达情况.结果:成功克隆了Arnelotin基因编码区全长序列;构建出重组真核表达载体pcDNA3.1-Amelotin,磷酸钙法转染后可检测到Amelotin基因在293T细胞中的表达.结论:构建了重组pcDNA3.1-Amelotin真核表达载体,并成功表达,为进一步研究该蛋白的生物学活性奠定了基础.     

多瘤病毒MT基因真核表达载体的构建

目的 :构建携带多瘤病毒MT癌基因的真核细胞表达载体。方法 :从野生型多瘤病毒上取其nt46 32至nt15 6 0片段克隆到pUC19上 ,再将该片段定点插入 pEGFP1的HindⅢ和EcoRI位点间 ,构建携带多瘤病毒MT癌基因的真核表达载体 pPyMT GFP。经线性化 ,将重组体导入鼠皮肤成纤维细胞中 ,G418选择培养 ,得到抗性细胞克隆。结果 :构建的pPyMT GFP质粒在鼠成纤维细胞中有稳定表达。 结论 :来源于野生型多瘤病毒的PyMT基因在哺乳动物细胞中有稳定表达 ,其真核表达载体 pPyMT GFP可被进一步用于研究PyMT蛋白在血管瘤发生中的作用     

转化生长因子-β1shRNA真核表达载体的构建

目的 构建转化生长因子β1（TGF-β1）的短发夹状RNA（shRNA）表达系统，为人涎腺粘液表皮样癌的治疗提供新的方法。方法 根据Genebank提供的TGF-β1 mRNA序列，设计短链寡核苷酸，化学合成后经退火形成双链DNA片段，克隆到pWH1载体中，用酶切方法对重组体进行鉴定；最后将构建的TGF-β1特异性shRNA表达载体转染涎腺粘液表皮样癌细胞，通过RT-PCR、免疫组化观察其对细胞TGF-β1 mRNA和蛋白水平表达的影响。结果 经酶切、连接后构建的质粒称之为pWH1-TGF-β1。酶切证实成功构建了TGF-β1 shRNA表达载体，RT-PCR和免疫组化结果显示其能够在mRNA和蛋白水平抑制细胞内TGF-β1的表达。结论 成功构建的TGF-β1特异性shRNA表达载体具有阻断TGF-β1表达的功能，可能为涎腺粘液表皮样癌治疗提供有效的方法和手段。     

ADAM28基因原核表达载体的构建和在大肠杆菌中的融合表达

目的:利用消减杂交技术克隆出牙齿发育相关基因ADAM28。方法:本研究为构建ADAM28基因的原核表达载体,在大肠杆菌中诱导其表达并纯化出ADAM28蛋白;采用反转录-多聚酶链式反应(RT-PCR)扩增出ADAM28基因的蛋白编码序列,克隆到中间载体pMD18-TVector中产生pMD18-T-ADAM28,再经双酶切得到ADAM28片段定向克隆到pGEX-4T-1载体中,构建融合表达载体pGEX-4T-ADAM28;在大肠杆菌中利用IPTG进行诱导表达,得到GST-ADAM28融合蛋白,并经SDS-PAGE电泳初步纯化。结果:①成功构建融合表达载体pGEX-4T-ADAM28,并经酶切鉴定、PCR鉴定和测序验证显示插入的ADAM28序列正确,阅读框架完整,未发现突变。②得到初步纯化的GST-ADAM28融合蛋白。经IPTG诱导后出现一条约35.3×103的新蛋白带。结论:ADAM28基因编码蛋白质能够在原核细胞中表达并纯化,为进一步研究该蛋白质的功能打下基础。     

mcpr1基因的真核表达载体的构建与鉴定

目的 :构建腭裂相关基因mcpr1与pcDNA3 .1/V5 HisB融合的高效真核表达载体 ,为研究mcpr1基因的功能奠定基础。方法 :根据mcpr1基因的核苷酸序列 ,设计并合成引物 ,通过PCR方法 ,从包含有mcpr1基因全长的克隆载体T easy/mcpr1中 ,扩增出该基因外显子片段 ,将扩增产物连接到真核表达载体pcDNA3 .1/V5 HisB中。对该重组体进行PCR和酶切鉴定 ,以及测序验证。结果 :以重组体为模板扩增出40 0bp左右的特异性基因片段 ,与mcpr1基因片段大小一致 ,酶切鉴定也显示有 40 0bp左右的基因片断。测序结果显示与已知基因序列一致。结论 :成功构建mcpr1基因的真核表达载体 ,为下一步研究mcpr1基因的功能奠定了基础。     

促凋亡分子Bad真核表达载体构建及其在人基底细胞癌细胞中的表达

目的:克隆Bcl-2相关促凋亡基因Bad的全长编码序列,构建Bad基因的真核表达载体并在人基底细胞癌细胞系(A431)中表达,为研究该基因在人基底细胞癌治疗中的作用奠定基础。方法:根据已发表的Bad基因的核苷酸序列设计并合成引物,用Hela细胞抽提的RNA进行逆转录聚合酶链反应(RT-PCR),扩增产物用XhoI和EcoRI双酶切后定向克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1-myc中,用限制性内切酶酶切重组质粒pcDNA3.1-myc-Bad并对其DNA测定序列。用脂质体法将pcDNA3.1-myc-Bad导入人基底细胞癌细胞系A431中,G418选择培养,Western blot及SABC-FITC分析鉴定其表达。瞬时转染A431细胞,通过细胞计数和集落形成实验观察其对A431细胞生长的影响。结果:RT-PCR扩增出长500bp的特异性片段,经克隆至pcDNA3.1-myc后酶切鉴定证实,并测序表明序列与GenBank报道完全一致。pcDNA3.1-myc-Bad在A431细胞中有表达并可影响细胞生长,与对照组有明显差异。结论:成功克隆了Bad的编码序列,构建了其真核细胞表达载体pcDNA3.1-myc-Bad,并在瞬时转染肿瘤细胞后观察到细胞生长受抑制。     

趋化因子受体CXCR4 shRNA真核表达载体的构建

目的：构建趋化因子受体（CXCR4）特异的RNA干扰质粒载体。方法：根据GenBank数据库提供的CXCR4基因核苷酸序列,选择设计能转录短发夹状RNA（short hairpin RNAs,shRNA）的DNA序列,并与pWH1质粒载体连接,用酶切的方法进行鉴定;将构建成功的特异性表达载体（pWH1-CXCR4）稳定转染至人涎腺黏液表皮样癌Mc3细胞系,并应用RT-PCR和流式细胞术对细胞CXCR4的表达进行检测。结果：与Mc3细胞和转染空白质粒pWH1 Mc3细胞相比,转染pWH1-CXCR4表达载体的Mc3细胞CXCR4 mRNA和蛋白的表达明显降低。结论：构建的CXCR4特异性shRNA表达载体可有效的沉默CXCR4基因,为进一步研究CX-CR4表达对涎腺黏液表皮样癌增殖和转移的意义及治疗涎腺黏液表皮样癌奠定了基础。     

变形链球菌表面蛋白真核表达质粒pcDNA3／pacA及pcDNA3／pacP免疫动物实验研究

目的：探讨变形链球菌表面蛋白真核表达质粒pcDNA3/pacA及pcDNA3/pacP作为基因疫苗,在BALB／c小鼠中的特异性体液免疫应答。方法：将真核表达质粒pcDNA3/pacA及pcDNA3/pacP分别肌注免疫BALB／c小鼠,用间接ELISA法检测小鼠血清抗PAc抗体滴度。结果：真核表达质粒pcDNA3/pacA免疫组的6只小鼠于首次免疫的第4周全部出现抗体阳转,真核表达质粒pcDNA3/pacP免疫组6只中有4只在第4周出现抗体阳转。结论：真核表达质粒pcDNA3/pacA和pcDNA3/pacP肌注免疫BALB／c小鼠可诱导体液免疫应答。     

mtHSP70/HSV-TK双基因真核共表达质粒的构建

目的构建结核杆菌热休克蛋白70（mycobacterium tuberculosis heat-shock proteins 70,mtHSP70）和自杀基因单纯疱疹病毒-胸苷激酶（herpes simplex virus-thymidinekinase,HSV-TK）双基因真核共表达质粒pCMV-mtHSP70-IRES-TK。方法登录Genbank查询HSV-TK和mtHSP70基因mRNA序列,应用引物设计软件DNA club分别设计扩增HSV-TK和mtHSP70基因全长cDNA的特异引物。以pcDNA3-TK质粒或mtHSP70质粒DNA为模板,分别采用各自的引物,用prime STAR HS DNA Polymerase进行聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）,获得HSV-TK和mtHSP70基因cDNA片断,连接到T载体pMD18-T上,转化大肠杆菌TG1后用HSV-TK和mtHSP70基因的特异引物进行菌落PCR,确定含有阳性mtHSP70或HSV-TK重组质粒并将阳性pMD18T-TK重组质粒和pMD18T-mtHSP70重组质粒进行上、下游测序,测序结果与基因序列进行同源比较。选定正确的质粒用于HSV-TK和mtHSP70基因的亚克隆,构建质粒PCMV-mtHSP70-IRES-TK,所得阳性克隆摇菌后少量提取质粒,分别用NotⅠ单酶切及EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切进行酶切鉴定。结果构建的pCMV-mtHSP70-IRES-TK质粒分别用NotⅠ单酶切及EcoRⅠ/XhoⅠ双酶切进行酶切鉴定,酶切产物电泳见特异酶切图谱,确定为重组质粒pCMV-mtHSP70-IRES-TK。结论本实验为后续研究mtHSP70/HSV-TK双基因的协同抗肿瘤作用奠定了实验基础。     

microRNA-223过表达与抑制表达 慢病毒载体的构建及鉴定

目的 构建 microRNA-223过表达慢病毒载体及抑制表达慢病毒载体,并验证其过表达或抑制表达microRNA-223的效率。方法 设计针对microRNA-223前体的过表达基因片段及针对microRNA-223成熟体的反义片段,应用聚合酶链反应（PCR）调取目的基因及通过退火反应获得双链DNA寡聚核苷酸片段。并通过基因重组技术将目的 基因片段及反义片段分别克隆到GV229及GV232慢病毒载体中,进行PCR鉴定及DNA测序比对分析,构建相应的 microRNA-223过表达慢病毒载体及抑制表达慢病毒载体。利用荧光定量PCR法检测microRNA-223表达水平。结果 对阳性克隆进行PCR鉴定及DNA测序证明,microRNA-223过表达慢病毒载体及抑制表达慢病毒载体构建成功。microRNA-223过表达慢病毒载体能显著提高细胞中microRNA-223表达水平,microRNA-223抑制表达慢病毒载体能明显抑制细胞中microRNA-223表达水平。结论 成功构建microRNA-223过表达慢病毒载体及抑制表达慢病毒载体,为进一步研究microRNA-223对口腔癌发生发展的影响及其机制提供了稳定的细胞转染载体。     

牙龈卟啉菌牙龈蛋白酶K基因真核表达载体的构建和体外表达

目的：构建牙龈卟啉菌牙龈蛋白酶K基因的真核表达载体，并检测其在体外真核细胞中的表达情况。方法：利用基因重组技术构建牙龈卟啉菌牙龈蛋白酶K基因重组质粒pcDNA3.1( )-KGPcd，然后通过脂质体将pcDNA3.1( )-KGPcd瞬时转染COS7细胞，以RT-PcR和间接免疫荧光法检测重组质粒的转录水平和蛋白表达情况。结果：成功构建了牙龈蛋白酶K真核表达载体；转染的COS7细胞中可检测到目的蛋白的转录和表达。结论：成功构建了pcDNA3.1( )－KGPcd真核表达载体并在哺乳动物细胞中能够正确转录和表达，为下一步作为基因疫苗免疫动物提供了依据。     

鼠MyoD原核表达载体的构建及其在大肠杆菌的表达

目的：对鼠肌肉转录调节因子MyoD基因扩增、鉴定，利用大肠杆菌表达其成熟肽。方法：MyoD cDNA基因原始质粒转化，提取质粒，酶切鉴定。然后将基因克隆人大肠杆菌非融合表达载体pBV220，受控于启动子PRPL，重组质粒pBV-my以大肠杆菌DH5α为宿主菌，在42℃进行温度诱导。结果：序列酶切鉴定完全正确；含重组质粒的工程菌经诱导后在SDS—PAGE上出现一条新生蛋白带，相对分子质量为55ku，与预期成熟肽相对分子质量大小一致，约占菌体总蛋白的30％。结论：成功地鉴定了MyoD cDNA序列，通过基因克隆构建了其原核表达载体pBV-my，并在大肠杆菌中得到了高效表达。