miR-542-3p对骨肉瘤细胞侵袭能力的影响以及靶基因预测

【】目的 明确miR-542-3p抑制骨肉瘤细胞系HOS以及SAOS2细胞侵袭能力,建立生物信息学miR-542-3p靶基因调控网络,并探讨其潜在作用靶点。方法 使用miR-542-3p mimics 转染HOS以及SAOS2细胞,进行Transwell小室细胞侵袭能力测定。利用基因表达共享数据库GEO联合GEO2R平台,获取并分析miRNA-542-3p与miR-neg转染的U2OS细胞的基因表达谱数据及差异表达基因,进而使用miRNA预测数据库及Cytoscape软件,预测并建立miR-542-3p靶基因调控网络。qPCR验证mir-542-3p转染HOS以及SAOS2细胞后,部分预测目标靶基因的mRNA表达水平变化。结果 mir-542-3p 转染组骨肉瘤细胞的侵袭能力较对照组明显降低(P<0.05)。数据库差异基因分析表明,miRNA-542-3p与miR-neg转染的U2OS细胞的表达差异基因共417个,其中185个基因表达下调。实时定量PCR结果显示,Targetsacn以及MiRanda数据库预测靶基因中,miR-542-3p转染细胞组的ILK, TBPL1和ETS1表达水平显著低于对照组(P<0.05)。结论 miR-542-3p通过下调ILK, TBPL1以及ETS1显著抑制骨肉瘤细胞的侵袭能力。     

miR-542-3p对骨肉瘤细胞侵袭能力的影响及其靶基因预测

目的 明确miR-542-3p对骨肉瘤细胞系HOS和SAOS2细胞侵袭能力的影响,通过生物信息学建立miR-542-3p靶基因调控网络,并探讨其潜在作用靶点。方法 使用miR-542-3p mimics转染HOS和SAOS2细胞,同时设立正常组（未转染）及阴性对照组（转染miR-neg mimics）,Transwell小室试验检测转染后细胞的侵袭能力。通过美国国立生物信息中心（NCBI）基因表达共享数据库（GEO）联合GEO2R平台,获取并分析miRNA-542-3p与miR-neg转染的U2OS细胞的基因表达谱数据及其差异表达基因,进而使用miRNA预测数据库及Cytoscape软件,预测并建立miR-542-3p靶基因调控网络。实时荧光定量PCR验证miR-542-3p转染HOS和SAOS2细胞后,部分预测目标靶基因的mRNA表达水平变化。结果 miR-542-3p干预组HOS和SAOS2细胞的侵袭能力较正常组和阴性对照组明显降低（P均＜0.05）。数据库差异基因分析表明,miR-542-3p与miR-neg转染的U2OS细胞的表达差异基因共有417个,其中185个基因表达下调。miRNA预测数据库预测的266个靶基因中,有14个与差异基因分析中得到的表达下调基因重合。实时荧光定量PCR分析得出,ILK、TBPL1、ETS1这3个预测靶基因在miR-542-3p干预组中的表达水平显著低于阴性对照组,差异均有统计学意义（P均＜0.05）。结论 miR-542-3p通过下调ILK、TBPL1、ETS1显著抑制骨肉瘤细胞的侵袭能力。     

肿瘤坏死因子-α对膀胱癌细胞系中核转录因子kB的表达及对其调控基因的影响

目的：探讨膀胱癌细胞系中核转录因子－kB(NF-kB)及其调控基因的表达以及药物刺激对其的影响。方法：免疫细胞化学检测p65、p50、p52、c-Rel、RelB、IkBα、增殖细胞核抗原（PCNA）的蛋白表达水平，逆转录－聚合酶链反应（RT－PCR）检测p65、p50、p52、c-Rel、RelB、IkBα、CyclinD1、白细胞介素（IL）－8、PCNA的mRNA水平。采用人类肿瘤坏死因子－α（TNF-α，20μg/L）刺激细胞观察检测指标的变化。结果：在EJ、T24细胞系中均见p65、p50、p52、c-Rel、RelB、IkBα、PCNA等的蛋白和mRNA表达，以及CyclinD1、IL－8的mRNA表达，TNF-α(20μg/L）刺激后，NF－kB家族成员的核易位增加，各指标的mRNA表达水平也有不同程度的增强。结论：膀胱癌细胞系中可见NF－kB家族的表达，TNF－α刺激后其调控基因的表达增强。     

p53对胃癌细胞BGC823中Survivin基因表达的影响

目的 探讨p53基因对胃癌细胞株BGC823中Survivin基因表达的影响及其作用机制。方法 应用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和Western blot技术检测胃癌细胞株BGC823中Survivin和p53基因表达情况；利用质粒pcDNA3．0-rpS3转染该细胞株。应用实时聚合酶链反应（PCR）和Western blot检测细胞在培养后不同时间点Survivin mRNA和蛋白表达水平。结果 确认了胃癌细胞株BGC823中Survivin和突变型p53基因的表达。受野生型p53质粒转染的胃癌细胞在培养16和24h后，Survivin mRNA和蛋白质水平呈明显下降趋势。结论 野生型p53在转染胃癌细胞株BGC823后可显著抑制后者Survivin基因的转录和表达。     

微小RNA-23a-3p负调控Runx2基因抑制骨髓间充质干细胞成骨分化诱导绝经后骨质疏松的研究

目的:观察微小RNA(miR)-23a-3p通过调控Runx2基因对骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨分化的影响。方法:绝经后骨质疏松症(PMOP)患者及正常的女性志愿者各30例,检测两组血清中miR-23a-3p表达水平。建立雌性小鼠骨质疏松模型后提取BMSCs,将miR-23a-3p inhibitor和miR-阴...     

胰腺癌PC-3细胞株外源性p14ARF抑癌基因表达与内源性p53表达水平的关系

目的　探讨外源性 p1 4ARF基因表达于胰腺癌PC 3细胞后与另一重要细胞周期调控蛋白 p53表达水平的相互关系。 方法　将含人 p1 4ARFcDNA的重组质粒通过脂质体介导转染入胰腺癌PC 3细胞中 ,并筛选出阳性克隆 ,逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)、Westernblot法检测PC 3细胞转染前后p1 4ARF的mRNA及蛋白的表达 ,同时用Westernblot分析其内源性 p53蛋白表达水平的变化。噻唑蓝 (MTT)比色法测定PC 3细胞在转染前、后的生长曲线变化。结果　胰腺癌PC 3细胞中p1 4ARF基因缺失。外源性 p1 4ARF基因成功转染入PC 3细胞并获得 1 4× 1 0 3大小的p1 4蛋白表达 ,且内源性 p53蛋白表达水平在转染后明显增高。PC 3细胞在导入 p1 4ARF基因后第 1天及第 5天的生长抑制率分别为 2 2 %及 2 6 % ,两者差异有显著性 (P <0 .0 5)。结论　p1 4ARF基因可上调胰腺癌PC 3细胞的内源性p53蛋白表达水平 ,从而发挥其细胞周期阻滞功能。     

Survivin基因在胰腺癌组织中的表达及与bcl-2和p53蛋白表达的关系

目的探讨Survivin基因在胰腺癌中的表达及与bcl 2、p5 3蛋白表达的相互关系。方法用RT PCR法检测 4 9例胰腺癌、5例慢性胰腺炎和 12例正常胰腺组织中SurvivinmRNA的表达 ,免疫组织化学法检测胰腺癌中bcl 2、p5 3蛋白表达。结果SurvivinmRNA在胰腺癌中表达率为76 % ,在慢性胰腺炎及正常胰腺组织中不表达 (P <0 0 5 )。Survivin基因表达与胰腺癌的分化程度、临床分期及淋巴结转移无相关性 (P >0 0 5 )。Survivin基因表达与bcl 2蛋白表达不相关 ,与p5 3蛋白表达显著相关。结论Survivin基因在胰腺癌中过度表达 ,提示该基因对胰腺癌发生和发展起重要作用 ;抑癌基因p5 3的失活与Survivin基因的表达可能在胰腺癌的发生中起协同作用。     

可诱导性真核表达载体pMD-KIP1的构建及其介导p27KIP1基因的表达

目的：研究p27^KIP1基因对肝癌细胞的细胞周期及细胞增殖的影响。方法：构建一种含0．6kb p27^KIP1 cDNA的可诱导性真核表达载体pMD-KIP1,通过外加100μmol/L Zn离子诱导目的基因的表达。脂质体转染法将p27^KIP1 cDNA转入肝癌细胞系HCC－9204中，免疫印迹分析以及逆转录－聚合酶链反应（RT－PCR）检测p27^KIP1基因在蛋白质和mRNA水平的表达；细胞活力实验显示转染p27^KIP1基因对细胞增殖的作用；流式细胞仪观察目的基因对该细胞的细胞周期的影响。结果：转染p27^KIP1的HCC－9204细胞在mRNA和蛋白质水平均有高水平p27^KIP1的表达。细胞活力检测显示在外加Zn离子48h后细胞生长被抑制35％；p27^KIP1的过表达能够显著地增加G1期的细胞数，由35．21％增加到68．28％（P＜0．01）。结论：本研究中所制备的可诱导性真核表达载体pMD-KIP1能有效介导p27^KIP1基因在HCC－9204细胞中的高表达，并使HCC－9204细胞的G1期延长，从而抑制细胞增殖。     

反义-miR221/222上调p27~(kip1)抑制胶质瘤生长的研究

微小RNA(microRNA或miRNA)是长度约21～25核苷酸的非编码RNA,在转录后水平对其靶基因的表达进行负调控~[1].国外已在体外实验中证实miR221/222可以通过抑制p2727~(kip1)表达促进肿瘤细胞生长~[3,4]     

核小体结合蛋白调控Survivin基因对前列腺癌DU145凋亡的作用

目的探讨抑制人核小体结合蛋白1（NSBP1）基因后促进非激素依赖性前列腺癌细胞系DU145凋亡的作用机制。方法通过慢病毒lentivirus-NSBP1转染非激素依赖性前列腺癌细胞系DU145后,MTT法观察细胞活性变化,流式细胞仪检测细胞的凋亡情况,应用Western-blot技术检测NSBP1、Survivin蛋白的变化情况。结果抑制NSBP1表达水平后非激素依赖性前列腺癌细胞系DU145细胞活性降低,凋亡增加,同时Survivin蛋白的表达也随之降低。结论通过慢病毒转染抑制NSBP1的表达可以促进非激素依赖性前列腺癌细胞系DU145凋亡,NSBP1可能是通过调控Survivin基因的变化影响细胞的增值凋亡。     

miR-542-3p对肝癌细胞恶性生物学行为的影响及机制探讨

目的 探讨microRNA-542-3p(miR-542-3p)在人肝癌细胞系及组织中的表达水平及其对肝癌细胞增殖、侵袭转移能力的影响.方法 采用RT-PCR检测miR-542-3p在肝癌细胞系(HCCLM3、Hep3B、Huh7、SMMC-7721、MHCC-97H、MHCC-97L)以及人正常肝细胞LO2中的表达;...     

miRNA-135a在肝癌组织中的表达及临床意义

目的 探讨mi RNA-135a(mi R-135a)在肝癌组织中的表达及其临床意义。方法 采用实时荧光定量PCR检测20例肝癌组织及其癌旁组织中mi R-135a的表达水平,并通过脂质体介导的方法将mi R-135a模拟物(mi R-135a mimics)转染肝癌细胞株Hep G2,采用实时荧光定量PCR测定转染后细胞中mi R-135a的表达水平;通过平板克隆实验和MTT法分别检测转染后细胞克隆形成率和存活率的变化,并对mi R-135a调控相关靶细胞的基因表达水平进行检测,观察mi R-135a在肝癌细胞维持正常功能中的作用。结果 通过对20例肝癌组织及其癌旁组织中mi R-135a的表达水平进行检测,结果 mi RNA-135a的表达在正常组织中相对更高,且两组之间存在显著性差异(P0.05);与阴性对照组比较,转染mi R-135a mimics后Hep G2细胞中mi R-135a表达水平显著提高(P0.05),而形成单克隆能力和细胞存活率均显著下降(P0.05),同时转染组细胞中与mi R-135a细胞调控相关靶基因FOS、PI3、Jak2、Stat3的m RNA表达量相较于NC组均显著降低(P0.05),表明mi R-135a表达提高后抑制细胞形成单克隆能力并降低存活率。结论 mi R-135a在正常组织和肝癌组织中差异表达,同时当mi R-135a表达提高时抑制肝癌细胞形成单克隆能力和降低细胞存活率,表明mi R-135a可能通过一些相关靶基因直接或间接调控Hep G2肝癌细胞的存活,在肝癌的发生过程中可能起到作用,mi R-135a可能成为临床治疗肝癌和预后的重要靶点。     

微小RNA-148a对胃癌细胞MKN45增殖能力的影响及机制研究

目的：探讨微小RNA（miR）-148a对人胃癌细胞增殖的影响及可能机制。方法采用实时定量PCR技术检测60例胃癌组织及癌旁组织中miR-148a的表达水平。利用慢病毒包装建立稳定表达miR-148a的MKN45细胞系为转染组,未转染的MKN45细胞系为对照组。 CCK8法检测MKN45细胞的增殖情况,通过targetscan预测miR-148a的靶基因,Western-blot检测靶基因的表达水平。结果54例（90．0％,54/60）胃癌组织中miR-148a的表达量较癌旁组织下调,其中37例（61．7％,37/60）下降2倍以上;淋巴结转移、有无癌旁血管浸润及TNM分期Ⅲ～Ⅴ期者其表达量明显降低（P＜0．05）。转染miR-148a后3 d,MKN45细胞生长明显受抑,转染组吸光度值（0．978±0．091）明显低于对照组（1．182±0．074,P＝0．000）。转染组CDC25B（通过targetscan发现的miR-148a靶基因）蛋白表达较对照组明显降低。结论 miR-148a在胃癌组织中的表达明显低于癌旁组织;其具有抑制胃癌细胞增殖的作用,CDC25B可能是miR-148a发挥抑癌作用的靶基因。     

槲皮素对人肾癌细胞增殖、凋亡及stat3、survivin表达的影响

目的探讨槲皮素对人肾癌细胞增殖、凋亡及stat3、survivin表达的影响。方法在肾癌细胞体外培养的基础上,根据不同浓度槲皮素（20μmol／L、40μmol／L和80μmol／L）分别3组,即低、中、高浓度干预组;另设空白对照组。观察不同浓度的槲皮素对肾癌细胞增殖、凋亡及stat3、survivin的mRNA和蛋白表达的影响。采用MTT法检测槲皮素对细胞的毒性作用。用流式细胞仪检测细胞凋亡。Real Time PCR检测stag和survivin的mRNA表达,采用Western blot检测star3和survivin的蛋白表达。结果随作用时间延长和浓度增高,槲皮素对细胞增殖的抑制作用增强。各槲皮素干预组与空白对照组比较均具有统计学差异（P〈0．05）。在槲皮素作用48h时检测,槲皮素（20μmol／L）组细胞早期凋亡率为20．17％、槲皮素（40μmol／L）组细胞早期凋亡率为61．93％、槲皮素（80μmol／L）组细胞早期凋亡率为82．24％。各槲皮素干预组与空白对照组比较差异均有统计学意义（P〈0．05）。stat3与survivin mRNA之间呈直线相关关系（r=0．697,P=0．002）,且磷酸化staG（p-staG）和survivin蛋白也呈直线相关关系（r=0．748,P=0．003）。结论槲皮素可抑制肾癌细胞的增殖,诱导细胞凋亡,下调stat3和survivin的mRNA和蛋白表达。     

survivin和环氧化酶-2在膀胱移行细胞癌组织中的表达及其相关性

目的 探讨膀胱移行细胞癌组织中凋亡抑制蛋白survivin和环氧化酶-2（cox-2）的表达与肿瘤生物学行为之间的关系及其二者的相关性。方法应用免疫组化Envision法，检测42例膀胱移行细胞癌组织标本和10例非肿瘤正常膀胱组织（正常对照组）中survivin和cox-2的表达。结杲42例膀胱移行细胞癌组织中survivin和COX-2表达的阳性率分别为78．6％和81．0％，正常对照组中均未见表达；survivin表达强度与肿瘤分期及复发呈正相关关系（P〈O．05），而与肿瘤分级无关（P〉O．05）；cox-2表达强度与肿瘤分级和分期呈正相关关系（P〈0．05），而与肿瘤复发无关（P〉0．05）；survivin和cox-2在膀胱移行细胞癌中的表达密切相关（rs=0．327，P〈0．05）。二者的表达与患者的性别、年龄、术时肿瘤的大小、数目及部位无关（P〉0．05）。结论Survivin和cox-2在膀胱移行细胞癌组织中普遍表达，且表达密切相关，二者可能在膀胱癌的发生、发展过程中起重要作用，并与浸润关系密切。     

长链非编码RNA肝细胞核因子1α反义链1对食管癌细胞增殖、迁移和凋亡的影响

目的观察长链非编码RNA肝细胞核因子1α反义链1(lnc HNF1A-AS1)对食管癌细胞增殖、迁移和凋亡的影响并探讨其作用机制。方法选取2017年8月至2019年11月于河南省人民医院行根治性切除术的食管鳞癌患者85例作为研究对象,采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测食管癌和癌旁组织lnc HNF1A-AS1的mRNA表达水平;构建短发卡RNA(shRNA)-Control和shRNA-HNF1A-AS1慢病毒稳定细胞系;采用生物信息学和双荧光素酶报告基因实验分析lnc HNF1A-AS1和miR-1-3p的靶向关系;采用细胞计数试剂盒(CCK-8)法检测shRNA-Control和shRNA-HNF1A-AS1细胞的增殖水平;采用Transwell检测shRNA-Control和shRNA-HNF1A-AS1细胞的迁移能力;采用原位缺口末端标记法(TUNEL)染色检测shRNA-Control和shRNA-HNF1A-AS1细胞的凋亡水平;采用蛋白质印迹法(Western blot)检测细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、程序性死亡因子10(PDCD10)的表达;组间比较采用t检验及χ2检验。结果食管癌组织(1.77±0.10)lnc HNF1A-AS1相对表达水平高于癌旁组织(0.39±0.02)(t=7.294,P<0.05),差异有统计学意义。生物信息学分析显示lnc HNF1A-AS1是miR-1的潜在作用靶点。shRNA-HNF1A-AS1细胞吸光度(A)值(0.51±0.03)低于shRNA-Control细胞A值(1.65±0.11),差异有统计学意义(t=4.904,P<0.05)。shRNA-HNF1A-AS1细胞[(62.08±5.96)个]的迁移数目低于shRNA-Control细胞[(150.44±10.21)个],差异有统计学意义(t=3.846,P<0.05)。shRNA-HNF1A-AS1细胞[(83.85±6.69)个]的凋亡数量高于shRNA-Control细胞[(25.92±4.08)个],差异有统计学意义(t=4.759,P<0.05)。shRNA-HNF1A-AS1细胞中Cyclin D1和PDCD10的蛋白相对表达水平(0.55±0.05、0.59±0.04)低于shRNA-Control细胞(1.68±0.09、1.80±0.11),差异有统计学意义(t=4.363、5.063,P<0.05)。miR-1-3p组细胞Cyclin D1和PDCD10的蛋白相对表达水平(0.38±0.04、0.44±0.05)低于shRNA-Control细胞(1.76±0.10、1.72±0.12),差异有统计学意义(t=5.176、4.729,P<0.05)。结论lnc HNF1A-AS1可能通过靶向下调miR-1-3p的表达,促进食管癌细胞的增殖和迁移,抑制食管癌细胞的凋亡。     

miR-139-5p对人肝癌细胞增殖和侵袭的影响

目的 探讨微小RNA(miRNA)-139-5p在肝癌组织中的表达及其对人肝癌细胞增殖、侵袭的影响和潜在的分子机制。方法 采用生物信息学方法,从GEO数据库中下载GSE36915数据集,进行差异miRNA分析,结合TCGA-LICH数据集中的生存数据,筛选与预后显著相关的miRNA。采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测miR-139-5p在肝癌及其癌旁组织中的表达。利用CCK-8实验、Transwell实验观察miR-139-5p对人肝癌细胞SK-Hep-1和SMMC-7721的表型变化。采用高通量测序检测过表达miR-139-5p的SK-Hep-1细胞中基因表达的变化,确定miR-139-5p调控的潜在的信号通路和靶基因,并采用免疫印迹实验和报告基因实验进行验证。结果 通过对GSE36915数据集进行分析,共鉴定到50个显著差异表达的miRNA。结合TCGA-LICH数据集中的生存数据,发现在差异最显著的20个miRNA中,miR-15b-3p、miR-1180-3p、miR-139-5p、miR-139-3p与预后显著相关,最终确定miR-139-5p为进一步研究对象。mi...     

山药多糖通过miR-98-5p/TGFβR1分子轴调控肝癌细胞凋亡的机制研究

目的探究山药多糖(CYPS)通过miR-98-5p/TGFβR1分子轴调控肝癌(HCC)细胞凋亡的分子机制。方法qPCR检测miR-98-5p在不同HCC细胞系中的表达情况,使用不同浓度的CYPS处理Huh-7细胞,CCK-8检测细胞增殖活力,Annexin V-FITC/PI流式细胞术检测细胞凋亡,Western blotting检测TGFβR1和细胞凋亡相关蛋白Caspase-3、Caspase-8、Bcl-2、Bax的表达,双荧光素酶报告基因系统验证miR-98-5p与TGFβR1的靶向关系。结果与人正常肝细胞HL-7702相比,miR-98-5p在HCC细胞系中表达升高(均P<0.05),且在Huh-7细胞中的表达高于其他HCC细胞(P<0.05);CYPS处理可明显抑制Huh-7细胞的增殖活力并诱导细胞凋亡(均P<0.05),且10-3 kg/L CYPS对细胞增殖活力的抑制作用比其他浓度明显。双荧光素酶报告基因实验证实,miR-98-5p靶向调控TGFβ1。与10-3 kg/L CYPS组相比,miR-98-5p mimics可下调10-3 kg/L CYPS对细胞增殖活力(P<0.05)的抑制作用和对细胞凋亡(P<0.01)的促进作用,CYPS+miR-98-5p mimics+pcDNA-TGFβR1组中细胞增殖活力与CYPS+miR-98-5p mimics组相比明显降低(P<0.05),细胞凋亡水平明显升高(P<0.01)。结论CYPS可下调miR-98-5p,促进TGFβR1的表达,抑制Huh-7细胞增殖并诱导细胞凋亡。     

Survivin和RASSF1A基因在大肠癌中的表达及其临床意义

为研究大肠癌组织中生存素(survivin)基因与Ras相关区域家族1A(RASSF1A)基因表达与大肠癌发生、发展的关系,利用逆转录PCR技术,测定60例大肠癌组织及20例癌旁组织中survivin基因与RASSF1A基因的mRNA表达情况;利用甲基化特异性PCR(MSP)技术对RASSF1A启动子甲基化情况进行了鉴...     

结直肠癌肝脏转移相关微小RNA224的研究

目的研究结直肠癌肝脏转移微小RNA（microRNA,miRNA）表达的差异以及相关特性。方法收集2009年4月至2010年11月期间首都医科大学附属复兴医院的10例伴或不伴肝脏转移的结直肠癌患者的肿瘤组织标本,应用miRNA芯片方法对2组样本的miRNA表达差异情况进行研究,并通过实时定量PCR对miRNA的芯片表达差异进行验证。结果芯片结果筛选出6种结直肠癌肝脏转移组较非转移组表达失调的miRNA（上调的miR-224、miR-1236和miR-622,下调的miR-155、miR-342-5p和miR-363）,选取显著上调（即差异信号值大于500）的miR-224进行实时定量PCR验证,结果与芯片实验结果相一致。结论 miR-224可能通过调节其靶基因而在结直肠癌肝脏转移中起重要作用,miR-224可能成为未来结直肠癌生物标记或治疗方法的一个研究方向。