肾癌抑制性消减文库构建及差异表达基因鉴定

目的：应用抑制性消减杂交技术筛选人肾癌差异表达基因。方法：以786-0和HK-2为消减杂交对象构建人肾癌抑制性消减文库,挑选阳性克隆进行测序及Genbank BLAST分析。结果：文库包含362个有插入片段的阳性克隆,随机分析50个克隆,其中2个为新基因,另48个源于36个已知基因,这些差异表达基因与肿瘤细胞的转录、翻译、增殖、凋亡、代谢、信号转导、血管新生、膜受体表达异常等有关。结论：该文库质量可靠,筛选出包括低峰度和新基因在内的肾癌差异表达基因,为进一步研究肾癌发生、发展机制奠定了基础。     

ox-LDL特异性人血管平滑肌细胞cDNA消减文库的构建

目的:构建ox-LDL特异性人血管平滑肌细胞cDNA消减文库。方法:35％ug/ml ox-LDL刺激培养的人血管平滑肌细胞,利用消减杂交技术,构建cDNA消减文库,并运用蓝白斑筛选和影印杂交进一步确定文库克隆的特异性。结果:成功构建ox-LDL特异性血管平滑肌细胞cDNA消减文库,约2000个白色克隆。影印杂交后共获82个差异表达克隆。结论:消减文库的构建为进一步克隆ox-LDL特异性基因cDNA片段和全长奠定了基础。     

肾癌组织消减文库的构建与肾癌特异表达基因克隆

目的 构建人肾癌组织与正常肾组织差异表达的cDNA消减文库,从文中克隆鉴定出肾癌特异性表达的基因奠定基础。方法 应用抑制性消减杂交技术,分别从肾癌及正常肾组织中提取poly(A) RNA;依次合成单链及双链cDNA,分别与2种不同的接头衔接,再与正常肾cDNA进行2次消减杂交及2次抑制性PCR;将产物T／A载体连接接构建成功cDNA消减文库。结果 构成功具有高消减效率的人肾癌组织cDNA消减文库,文库扩增后得到350个阳性克隆,其中95％克隆均含50－400bp插入片段。结论 应用抑制性消减杂交技术所构建的人肾癌组织cDNA消减文库为进一步大批量筛选、克隆肾癌特异性表达的基因奠定了基础。     

抑制性消减杂交技术克隆肾癌差异表达基因

目的 应用抑制性消减杂交技术构建人吕组织与正常肾组织差异表达的ｃＤＮＡ消减文库，并从中克隆鉴定出蛑癌特异性表达的新基因。方法 分别从肾癌及正常肾组织中提取ｍＲＮＡ并合成ｃＤＮＡ，经酶切后将肾癌ｃＤＮＡ分为两组，分别与两种不贩接头衔接，再与正常肾组织（ｃＤＡＮ）进行两次的消减杂交及两次抑制性ＰＣＲ产物与Ｔ／Ａ载体连接构建成功ｃＤＮＡ消减文库，并转染大肠杆菌进行文库扩增，随机挑取克隆进行酶切、测序分析     

应用抑制性消减杂交方法构建斑秃毛乳头差异表达基因文库

目的：构建斑秃区与正常毛囊毛乳头细胞（DPC）差异表达的cDNA正向和反向消减杂交文库，为从中克隆鉴定出斑秃特异性表达和生长期DPC特异性表达的基因奠定基础。方法：应用抑制性消减杂交技术，分别从斑秃区DPC及正常头皮DPC提取总mRNA；依次合成单链及双链cDNA，分别与2种不同的接头连接，再进行正向和反向的2次消减杂交及2次抑制性PCR，将产物与T／A载体连接构建cDNA消减文库。结论：构建成功具有高消减效率的斑秃区及正常头皮DPC cDNA消减文库，文库扩增后得到120个阳性克隆，其中90个克隆含有100－500bp插入片段，结论：应用抑制性消减杂交技术所构建的斑秃区及正常头皮DPC cDNA消减文库，为进一步批量筛选，克隆斑秃区及正常头皮DPC特异性表达的基因奠定了基础。     

膀胱移行细胞癌差异表达基因的克隆与鉴定

应用抑制消减杂交(ssH)构建膀胱移行细胞癌差异表达的消减文库，再应用Dot blot方法筛选出差异表达的基因，为研究膀胱癌发生、发展提供实验依据。现报告如下。     

联合应用SSH和cDNA表达谱芯片筛选肝星状细胞早期活化的相关基因

目的 利用抑制消减杂交（suppression subtractive hybridization，SSH）和cDNA表达谱芯片筛选早期活化的肝星状细胞（hepatic stellate cell，HSC）和大鼠正常肝脏组织、轻度肝纤维化组织、重度肝纤维化组织中差异表达的基因。方法 从SSH构建的大鼠轻度肝纤维化、重度肝纤维化2个差异cDNA文库中挑选1000条上调显著的基因，与正常大鼠4136条基因克隆制作成一张芯片，筛选早期活化的肝星状细胞相关基因。结果 获得与HSC早期活化相关的上调基因有202条，下调基因有80条，其中血清和糖皮质激素调节蛋白激酶（serum and glucocorticoid sensitive kinase，SGK）在正常大鼠基因克隆和2周及8周SSH上调差异基因中均呈上调信号。结论 联合应用SSH和cDNA表达谱芯片是筛选和鉴定不同样本中差异表达基因的快速、经济和有效的方法；SGK可能作为多种细胞信号传导通路和细胞磷酸化级联反应的一个功能性交汇点，参与了肝星状细胞的早期活化和信号传导。     

应用抑制消减杂交和cDNA表达谱芯片筛选肝星形细胞持续活化的相关基因

目的：利用抑制消减杂交（suppression subtractive hybridization,SSH）和cDNA表达谱芯片筛选早期活化的肝星状细胞与大鼠正常肝脏组织、轻度肝纤维化组织、重度肝纤维化组织中差异表达的基因.方法：从SSH构建的大鼠轻度和重度肝纤维化中两个差异cDNA文库中挑选1 000条上调显著的基因,与正常大鼠4 136条基因克隆制作成一张芯片,筛选持续期活化的肝星状细胞相关基因.结果：获得与HSC持续活化相关的上调基因633条,下调基因715条,其中血清和糖皮质激素调节蛋白激酶（SGK）在正常大鼠基因克隆和2、8周SSH上调差异基因中均呈上调信号.结论：联合应用SSH和cDNA表达谱芯片是筛选和鉴定不同样本中差异表达基因的快速、经济和有效方法;SGK可能作为多种细胞信号传导通路和细胞磷酸化级联反应的一个功能性交汇点,参与了肝星状细胞的早期活化和信号传导.     

原发性肝细胞癌消减杂交文库构建及差异表达基因筛选

目的构建人原发性肝细胞癌（HCC）消减杂交文库，筛选差异表达基因。方法以癌组织为检测者（tester）、癌旁组织为参照者（driver），应用抑制性消减杂交（SSH）方法构建消减杂交cDNA文库，随机挑选56个阳性克隆进行鉴定、测序及同源性分析。结果文库获得130个阳性克隆，鉴定96％有200～1500bp插入片断。获得的35个基因中包括已知基因26个，功能未知基因5个，新基日4个。已知基因中包含酶、细胞信号转导、基因调控因子、转录调节因子、癌基因、抗凋亡因子及细胞的黏附与生长调节因子等相关基因。结论应用SSH方法成功构建HCC差异表达基因cDNA文库，筛选出低丰度和新基因在内的HCC差异表达基因。     

联合应用SSH和cDNA表达谱芯片筛选肝星状细胞早期活化的相关基因

目的利用抑制消减杂交(suppressionsubtractivehybridization,SSH)和cDNA表达谱芯片筛选早期活化的肝星状细胞(hepaticstellatecell,HSC)和大鼠正常肝脏组织、轻度肝纤维化组织、重度肝纤维化组织中差异表达的基因。方法从SSH构建的大鼠轻度肝纤维化、重度肝纤维化2个差异cDNA文库中挑选1000条上调显著的基因,与正常大鼠4136条基因克隆制作成一张芯片,筛选早期活化的肝星状细胞相关基因。结果获得与HSC早期活化相关的上调基因有202条,下调基因有80条,其中血清和糖皮质激素调节蛋白激酶(serumandglucocorticoidsensitivekinase,SGK)在正常大鼠基因克隆和2周及8周SSH上调差异基因中均呈上调信号。结论联合应用SSH和cDNA表达谱芯片是筛选和鉴定不同样本中差异表达基因的快速、经济和有效的方法;SGK可能作为多种细胞信号传导通路和细胞磷酸化级联反应的一个功能性交汇点,参与了肝星状细胞的早期活化和信号传导。     

Construction of the subtractive cDNA library of injured adult and fetal rabbit skins

Objective: Early gestational mammalian fetuses possess the amazing ability to heal cutaneous wounds in a scarless fashion. Over the past years, scientists have been working to decipher the mechanisms underlying this regenerative repair. The remarkable phenotypic differences between fetal and adult healings behoves us to learn their characteristics in genetics, which represents potentially important mechanisms involved in wound repair observed in fetal versus adult tissues. In this sense, it is reasonable to construct subtractive cDNA library for future research. Methods: Middle laparotomy and hysterotomy were performed on pregnant rabbits at 20-day gestation to expose the fetal back, and a longitudinal incision through the skin was made on the back of the fetus. The traumatized fetal skin was harvested 12 hours post-operation, the fetus control and traumatized adult skin specimens were taken at the same time. dscDNA was synthesized from total RNA of skin samples with SMART technology. Taking one of the three samples as Tester respectively and the other two as Drivers, we obtained 1 forward and 2 reverse hybridization products. After being amplified with selective polymerase chain reaction, the products were inserted into a vector,and then transferred into E. coli HB101. The colonies were screened afterwards. Results: The wounded fetuses were alive for a long time even after birth. Every determinant step, such as RNA isolation, cDNA synthesis, Rsa I digestion, adaptor ligation and hybridization, was well-operated. Subtractive efficiency identification demonstrated that the suppression subtractive hybridization (SSH) was successful. Insertion into vector and transferring to E.coli were satisfactory. Conclusions: Instead of classic SSH, an improved SSH with 2 Drivers was applied for the experiment. Results confirmed that the improved program was reasonable and correct in both theory and practice. The subtractive cDNA library we have obtained is going to be used for future researches to reveal scariess healing related gene (s) and its (their) expression.     

糖蛋白(MUC1与MUC7)基因在膀胱移行细胞癌的表达研究

目的 探讨糖蛋白MUC1与MUC7基因在膀胱移行细胞癌（BTCC）组织及细胞株中的表达及意义。方法 采用MUC1与MUC7特异性巢式逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）对分离的4种组织标本及3种细胞株的mRNA样本进行检测。结果 所有4种组织标本及3种膀胱癌细胞株的MUC1基因表达均为阳性。MUC7基因表达仅见于3种膀胱癌细胞株和侵袭性移行细胞癌标本。半定量结果显示MUC1 mRNA基因表达在正常膀胱黏膜同腺性膀胱炎及各期膀胱癌之间差异有统计学意义（P〈0．05）。浅表性膀胱癌与侵袭性膀胱癌之间差异有统计学意义（P〈0．05）。不同细胞系BIU-87与T24之间表达差异无统计学意义（P〉0．05），耐药细胞株BIU-87／A同敏感细胞株BIU-87与T24之间表达差异有统计学意义（P〈0．05）。MUC7 mRNA基因表达在3种细胞株及侵袭性膀胱癌组织之间差异无统计学意义（P〉0．05）。结论 MUC1基因的上调表达与MUC7基因的差异性表达可能影响膀胱癌细胞的生物学行为，导致相应的临床后果-恶性转变、侵袭转移、耐药。MUC7基因表达是尿路上皮恶性侵袭性转化的开始。     

膀胱癌患者尿脱落细胞抑制消减文库的构建及差异基因的初步筛选

目的 应用抑制性消减杂交方法 筛选膀胱移行细胞癌患者与正常人尿脱落细胞差异表达基因.方法 分离膀胱移行细胞癌患者与正常人尿液中总mRNA,用SMART技术反转录成cDNA,经过酶切、接头连接、两轮消减杂交及两轮抑制性PCR,使得差异表达的DNA片段得以富集.PCR产物与T/A载体连接并转化大肠杆菌XL-blue构建差异表达基因的cDNA消减文库.文库扩增后随机挑取克隆进行酶切、测序及同源性分析.结果 PCR鉴定有317个克隆载有主要在200～900bp之间呈随机分布的插入片段,片段插入率达93.2%,证实建库成功.对20个质粒测序结果 经同源性比对分析,其中20个片段源于17个已知基因,1个克隆在GenBank中未检索到与其有相似性的基因序列,表明它们可能为BTCC差异表达的新基因.结论 该消减杂交文库质量町靠,它的成功构建为进一步筛选、克隆膀胱肿瘤差异表达基因提供了依据.也为膀胱肿瘤诊断基因芯片的研究与开发奠定了基础.     

激光捕获显微切割结合RNA线性扩增技术在膀胱移行细胞癌相关基因研究中的应用

目的 当对有问质细胞混杂的膀胱移行上皮细胞与癌细胞进行基因差异表达分析时，激光捕获显微切割技术(LCM)是不可缺少的。LCM与RNA线性扩增结合，目的是确定一条可行的技术路线，获取均质的、足量的RNA，以备进一步用于膀胱癌相关基因研究。方法 采用LCM技术分别从正常膀胱黏膜及膀胱癌组织冰冻切片中获取膀胱移行上皮细胞及癌细胞，提取RNA，并对120ng上皮细胞RNA进行线性扩增，获得aRNA 20μg。用逆转录．聚合酶链反应(RT-PCR)验证扩增前、后RNA中β-actin基因表达水平。结果对照实验Ⅰ证实LCM后RNA完整性较好；产物RNA扩增后获得片段大小为0．5～2．5kb的水NA，且β-actin表达完整。结论 LCM结合RNA线性扩增技术获取均一的、足量的、完整性好的目的细胞RNA．能用干讲一步研究．     

尿液脱落细胞CD44基因拼接变异体对膀胱癌的诊断价值

作者应用逆转录－聚合酶链反应和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交技术对２０例膀胱癌和２０例非癌对照组尿液脱落细胞ＣＤ４４基因拼接变异体进行检测,并与尿细胞学检查结果进行比较。结果显示：９０％的膀胱癌患者尿液脱落细胞均检测到ＣＤ４４基因拼接变异体的过量表达,而２０例非癌对照标本均未检测到这种异常。本技术诊断膀胱癌的敏感性为９０％,较尿细胞学检查的６５％明显提高。提示尿液脱落细胞ＣＤ４４基因拼接变异体是一种很有前途的用于膀胱癌早期无创伤性诊断的新的分子标记物。     

从膀胱癌尿脱落细胞中提取RNA进行RT-PCR的研究

目的:建立从膀胱癌尿液脱落细胞中提取RNA进行RT-PCR研究的实验方法.方法:从20例膀胱癌患者尿液脱落细胞中提取RNA,采用RT-PCR技术扩增癌细胞中CD_(44)基因V_6～V_(11)外显子序列.结果:18例尿液标本均可被扩增出所设计的相应片段,并经Southern印迹杂交证实.结论:临床上采用此技术可从分子水平上对大批膀胱癌患者的癌基因表达产物进行无创伤性检测;为深入研究膀胱癌的发病机制、生物学行为和探讨简便、有效的无创伤性检测方法奠定了实验基础.     

膀胱癌尿脱落细胞端粒酶活性检测及其临床意义

目的检测尿脱落细胞端粒酶活性并探讨其临床意义。方法应用改良的端粒重复序列扩增（ＴＲＡＰ）银染方法,分别对膀胱癌组织、正常膀胱组织,以及膀胱癌患者和非尿路上皮肿瘤患者的尿脱落细胞、膀胱冲洗液进行端粒酶活性检测。结果１２例正常膀胱组织均无端粒酶活性,４８例膀胱癌组织中４４例（９１．７％）端粒酶阳性。膀胱癌患者尿液及膀胱冲洗液中脱落细胞端粒酶阳性率分别为８３．３％（４０／４８）和８７．５％（４２／４８）。１２例分化良好（Ｇ１级）膀胱癌患者中,尿液和膀胱冲洗液中脱落细胞端粒酶阳性率分别为７５．０％（９／１２）和８３．３％（１０／１２）。结论尿脱落细胞端粒酶活性检测敏感性高,可用于膀胱癌的早期诊断和术后随访。