华支睾吸虫一个谷胱甘肽转移酶新基因的克隆与表达

目的 克隆华支睾吸虫(Clonorchis sinensis,Cs)谷胱甘肽转移酶(glutathione transferase,GST)的一个新基因,并在大肠杆菌中表达。方法 用PCR方法从华支睾吸虫成虫cDNA(质粒)文库中扩增新基因CsGST1,对DNA及其推导的氨基酸进行序列分析。将CsGST1克隆到原核表达载体pET-30a(+),在大肠杆菌BL21/DE3表达,用SDS-PAGE鉴定重组蛋白。结果 从华支睾吸虫成虫cDNA(质粒)文库扩增出642 bp的CsGSTl,序列分析显示它所编码的氨基酸序列与麝猫后睾吸虫GST的同源性最高(88％),并具有GST N-末端和C-末端的保守功能域。构建了重组质粒pET-30a(+)-CsGST1,SDS-PAGE显示CsGST1在大肠杆菌中得到了高效表达,pET-30a(+)-CsGST1的蛋白条带的分子量约为30 kDa。结论成功构建了CsGST1的原核表达载体,并在大肠杆菌中得到了高效表达,为进一步研究该基因的功能打下了基础。     

华支睾吸虫组织蛋白酶Cathepsin L1 样基因全长序列的克隆和生物信息学分析

目的预测华支睾吸虫全长cDNA质粒文库中cs002d09号EST序列的结构和功能特征及编码蛋白的应用前景。方法利用NCBI和ExPaSy等生物信息学网站在线分析工具和Vector NTIsuite及PcGene等软件包，分析华支睾吸虫全长cDNA质粒文库中cs002d09号EST序列及其编码蛋白的理化性质、结构与功能特征。结果BLASTx分析该ESF序列是组织蛋白酶Cathepsin L1的同源基因，全序列长为1458bp，包含完整的编码区80～1191，编码371个氨基酸，前18个氨基酸是分泌信号肽，蛋白的理化性质较稳定。该蛋白有2个空间构象相对独立功能域：N端的抑制功能域和C端的活性功能域，抑制功能域含有3个线性B细胞抗原表位，同源性较低；C端活性功能域同源性较高，Cys177，His318和Asn338组成催化中心，位于底物结合裂缝的底部。结论华支睾吸虫Cathepsin Ll基因与多个物种的Cathepsin L1基因同源，编码蛋白可能是重要的虫体分泌排泄抗原成分，在华支睾吸虫病的免疫诊断和疫苗研究方面有较好的应用前景。     

华支睾吸虫组织蛋白酶Cathepsin L1样基因全长序列的克隆和生物信息学分析

目的预测华支睾吸虫全长cDNA质粒文库中cs002d09号EST序列的结构和功能特征及编码蛋白的应用前景。方法利用NCBI和ExPaSy等生物信息学网站在线分析工具和Vector NTIsuite及PcGene等软件包，分析华支睾吸虫全长cDNA质粒文库中cs002d09号EST序列及其编码蛋白的理化性质、结构与功能特征。结果BLASTx分析该ESF序列是组织蛋白酶Cathepsin L1的同源基因，全序列长为1458bp，包含完整的编码区80～1191，编码371个氨基酸，前18个氨基酸是分泌信号肽，蛋白的理化性质较稳定。该蛋白有2个空间构象相对独立功能域：N端的抑制功能域和C端的活性功能域，抑制功能域含有3个线性B细胞抗原表位，同源性较低；C端活性功能域同源性较高，Cys177，His318和Asn338组成催化中心，位于底物结合裂缝的底部。结论华支睾吸虫Cathepsin Ll基因与多个物种的Cathepsin L1基因同源，编码蛋白可能是重要的虫体分泌排泄抗原成分，在华支睾吸虫病的免疫诊断和疫苗研究方面有较好的应用前景。     

华支睾吸虫mGST新基因的克隆、表达与纯化

目的扩增华支睾吸虫一个微粒体谷胱甘肽转移酶（mGST）新基因,明确是否存在内含子,并进行原核表达与纯化. 方法用PCR方法分别从华支睾吸虫成虫cDNA（质粒）文库和基因组DNA中扩增mGST基因并测序,将编码基因定向克隆到原核表达载体pET-30a（＋）,在大肠埃希菌BL21/DE3中表达,按照Ni-NTA agarose说明书纯化重组蛋白,用SDS-PAGE和TLC分析. 结果 mGST基因全长486 bp,没有内含子,构建的原核表达质粒pET-30a（＋）-mGST在大肠埃希菌中得到了有效表达,融合蛋白的分子质量单位约为24 ku.重组蛋白达细菌总蛋白质的11%,纯化后的重组蛋白纯度为83%. 结论 mGST基因没有内含子,在大肠埃希菌中能有效表达,得到了纯化的重组蛋白,为进一步研究其功能奠定了基础.     

华支睾吸虫溶血磷脂酶基因的识别、克隆和序列分析

目的筛选cDNA文库识别华支睾吸虫新基因，并将所发现的华支睾吸虫溶血磷脂酶(csLysoPLAH)基因编码区克隆到原核表达质粒PGEX-4T-1和真核表达质粒pcDNA3上，为进一步研究其功能奠定基础。方法对华支睾吸虫cDNA文库进行随机筛选并测序，在NCBI和ExPasy网站上进行序列分析，识别华支睾吸虫新基因，并应用Motifsan、NCBI Conserved Domain Search等程序对其进行结构域分析。根据PGEX-4T-1和pcDNA3上的克隆位点及所发现的csLysoPLAH cDNA编码序列设计引物，进行PCR扩增，扩增产物回收纯化后克隆到原核表达载体PGEX-4T-1和真核表达载体pcDNA3上。构建的PGEX-4T-1-csLysoPLAH、pcDNA3-csLysoPLAH重组表达质粒经PCR、双酶切及测序证实。结果发现csLysoPLAH基因，完整阅读框含708个碱基，编码235个氨基酸，理论分子质量为25．2628ku，理论pI为6．03。序列分析表明，csLysoPLAH编码氨基酸序列与其它物种有较高的同源性，csLysoPLAH具有磷脂酶／羧酸酯酶保守功能域和完整的脂酶保守功能域，并含有丝氨酸酯酶特征性的标签肽(即GXSXG)。所构建的重组原核和真核表达质粒经PCR、双酶切及测序证实与目标基因相符。结论发现华支睾吸虫溶血磷脂酶基因，并成功构建原核和真核重组表达质粒。     

华支睾吸虫分泌蛋白基因（CsCrSP）的克隆和生物信息学分析

目的 筛选cDNA文库识别华支睾吸虫新基因，克隆并构建重组表达载体。 方法 对华支睾吸虫cDNA文库进行筛选，通过BLASTn程序进行序列比对，识别华支睾吸虫新基因，并应用Motifscan，NCBI Conserved Domain Search等程序对其进行结构域及进化树分析。 结果 筛选出华支睾吸虫未知基因Pcs004f03序列，含689 bp；应用Vecter NTI分析，理论相对分子质量（Mr）为21 000，完整的ORF含561 bp，编码187aa。该基因有潜在的糖激化位点、3个N肉豆蔻酰化位点、3个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、蛋白激酶Ｃ磷酸化位点、cAMP-and cGMP依赖蛋白激酶磷酸化位点。利用软件在线搜索发现在第1～50aa内有一明显的信号肽，初步推断CsCrSP为一种分泌蛋白。结论 CsCrSP基因为华支睾吸虫富含半胱氨酸分泌蛋白基因。     

华支睾吸虫CsSP16.4基因的克隆、序列分析和功能预测

目的通过筛选cDNA文库识别华支睾吸虫新基因;克隆并构建重组表达载体,为进一步研究其功能及其应用价值奠定基础。方法对华支睾吸虫cDNA文库进行筛选,通过Blastn程序进行序列比对,识别华支睾吸虫新基因,并应用Motifscan,NCBIConservedDomainSearch等程序对其进行结构域分析及进化树分析。结果筛选得到的序列长725bp,应用VecterNTI分析,理论分子量为16.4kDa,理论等电点(pI)为6.44,疏水氨基酸(AILFWV)占36%,带电荷氨基酸(RKHY-CDE)占29%,极性氨基酸(NCQSTY)占28.8%,酸性氨基酸(DE)占8.65%和碱性氨基酸(KR)占9.21%。应用NCBI站点的ORFFinding分析发现其含4个可能的ORF,其中最长的ORF,从第42到第494bp,起始密码为ATG、终止密码为TAG,完整阅读框含450bp,编码150aa。发现该基因有潜在的2个糖激化位点、3个N肉豆蔻酰化位点和1个蛋白激酶C磷酸化位点。结论确定该基因为华支睾吸虫分泌蛋白基因,为作为诊断候选抗原提供了依据。     

华支睾吸虫Rap2B样基因的生物信息学分析及其克隆、表达

目的从华支睾吸虫cDNA文库中筛选Rap2B样基因并分析其结构和功能,初步进行克隆和表达纯化,为进一步研究其功能奠定基础。方法利用多种生物信息学分析软件,分析华支睾吸虫Rap2B蛋白的拓扑学结构、生物学和免疫学功能特征。设计引物,从华支睾cDNA质粒文库中扩增目的基因cDNA序列,构建原核重组质粒并初步表达纯化。结果华支睾吸虫Rap2B样基因长度为847bp,其全长编码序列为426bp,编码141个氨基酸,理论分子量是15851.1。重组的原核表达质粒pET-28a(+)-Rap2B经PCR、双酶切及DNA测序结果均表明重组质粒构建成功。该基因在大肠杆菌中能高效表达。经His亲和层析柱获得了纯化的重组蛋白,Western blotting证实Rap2B重组蛋白能被感染华支睾吸虫的大鼠血清识别。结论华支睾吸虫Rap2B蛋白经生物信息学预测为ras原癌基因家族成员,可能在华支睾吸虫致癌过程中有一定作用。该基因可在原核表达系统中高效表达,并得到了纯化的重组蛋白,为进一步研究该蛋白的功能以及在致病尤其是可能促发肿瘤的作用方面奠定一定基础。     

华支睾吸虫蛋白酶体α2新基因的生物信息学分析与克隆表达

目的发现华支睾吸虫成虫蛋白酶体新基因,应用生物信息学方法预测其结构和功能,表达重组蛋白为进一步确定其功能特征奠定基础。方法通过华支睾吸虫成虫cDNA文库的大规模测序,获取全长cDNA序列,利用生物信息学软件ORFfinder,BLAST,Conserved Domains和ExPASy等识别华支睾吸虫蛋白酶体α2(CsPSMA2)新基因,分析其基因和编码蛋白结构,同源性比对并构建系统发育树。将CsPSMA2基因克隆到pGEX-4T-1原核表达载体中,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,表达产物经SDS-PAGE鉴定。结果确定了编码CsPSMA2的新基因并成功登录到GenBank(Accession NO.:EU223819)。该基因全长833bp,编码235个氨基酸,第5-232aa之间含有蛋白酶体α2全长结构域,理论分子量为26.0kDa,分子进化分析显示CsPSMA2的蛋白与日本血吸虫亲缘关系最近,重组质粒融合表达了带有GST标签的CsPSMA2蛋白。结论发现了华支睾吸虫蛋白酶体α2新基因,确定了其重要的功能域和结构特征,成功进行了该基因在大肠杆菌中的克隆表达。     

华支睾吸虫溶血磷脂酶基因的识别、克隆和序列分析

目的　筛选cDNA文库识别华支睾吸虫新基因 ,并将所发现的华支睾吸虫溶血磷脂酶 (csLysoPLAH)基因编码区克隆到原核表达质粒PGEX 4T 1和真核表达质粒pcDNA3上 ,为进一步研究其功能奠定基础。　方法　对华支睾吸虫cDNA文库进行随机筛选并测序 ,在NCBI和ExPasy网站上进行序列分析 ,识别华支睾吸虫新基因 ,并应用Motifsan、NCBIConservedDomainSearch等程序对其进行结构域分析。根据PGEX 4T 1和 pcDNA3上的克隆位点及所发现的csLysoPLAHcDNA编码序列设计引物 ,进行PCR扩增 ,扩增产物回收纯化后克隆到原核表达载体PGEX 4T 1和真核表达载体 pcDNA3上。构建的PGEX 4T 1 csLysoPLAH、pcDNA3 csLysoPLAH重组表达质粒经PCR、双酶切及测序证实。　结果　发现csLysoPLAH基因 ,完整阅读框含 70 8个碱基 ,编码 2 3 5个氨基酸 ,理论分子质量为 2 5 .2 62 8ku ,理论pI为6.0 3。序列分析表明 ,csLysoPLAH编码氨基酸序列与其它物种有较高的同源性 ,csLysoPLAH具有磷脂酶 /羧酸酯酶保守功能域和完整的脂酶保守功能域 ,并含有丝氨酸酯酶特征性的标签肽 (即GXSXG)。所构建的重组原核和真核表达质粒经PCR、双酶切及测序证实与目标基因相符。　结论　发现华支睾吸虫溶血磷脂酶基因 ,并成功构建原核和真核重组表达质粒。     

华支睾吸虫表膜相关蛋白基因的扩增、序列分析和克隆

目的识别华支睾吸虫新基因,并将所发现的华支睾吸虫表膜相关蛋白(tegumental protein ofClonorchis sinensis,CsTP)的cDNA序列克隆到原核载体中,为进一步的研究奠定基础。方法对华支睾cDNA质粒文库进行随机筛选并测序,用在线生物信息学工具进行序列分析,识别CsTP基因,并对其进行同源性、物理性质及结构分析。设计引物,从华支睾cD-NA质粒文库中扩增目的基因cDNA序列,并构建原核重组质粒,相同引物从华支睾吸虫基因组中扩增出CsTP的DNA序列。结果发现CsTP基因,其cDNA完整阅读框含555个碱基,编码184个氨基酸,理论分子量为20.7kDa;其DNA序列含1393个碱基,含有3个外显子、2个内含子。序列分析表明,CsTP蛋白与其它物种的表皮蛋白或膜相关蛋白有一定的同源性。所构建的重组原核表达质粒PGEX-4T-1-CsTP经PCR、双酶切及测序证实与目的基因相符。结论发现华支睾吸虫表膜相关蛋白基因,成功构建其重组原核表达质粒为进一步研究该基因的功能提供了条件。     

华支睾吸虫CsSCCRO基因的克隆表达和蛋白纯化

目的原核表达华支睾吸虫鳞状上皮癌相关肿瘤基因(SCCRO)全长编码区序列,获得纯化的重组蛋白,为进一步功能研究做好准备。方法用生物信息学方法从华支睾吸虫成虫全长cDNA文库中识别出与人鳞状上皮癌相关基因的同源序列及其全长编码区,将其编码区序列克隆到原核表达载体PET-30a(+),测序鉴定重组质粒,在大肠杆菌BL-21/DE3中用IPTG诱导表达,重组产物用His-镍蛋白纯化柱纯化。结果华支睾吸虫鳞状上皮癌相关基因长度为1 218bp,其全长编码序列长度为780bp,编码259个氨基酸,1-22位为分泌信号肽,在羧基端有一个高度保守的区域。该基因在大肠杆菌中得到了高效的可溶性表达,重组蛋白达总蛋白的39%,纯化后的重组蛋白纯度可达98%。结论鳞状上皮癌相关基因的PET-30a(+)原核重组质粒在大肠杆菌BL-21/DE3中可以稳定高效地表达可溶性蛋白。     

抗华支睾吸虫循环抗原Fab抗体克隆的筛选及序列分析

目的　获得抗华支睾吸虫循环抗原Fab段抗体。方法　将华支睾吸虫代谢抗原包被在固相ELISA板中 ,采用“吸附 -洗脱 -扩增”的方法 ,对已构建的抗华支睾吸虫噬菌体抗体库进行富集。从富集后的抗体库中筛选抗循环抗原抗体克隆 ,并交叉筛选鉴定其特异性。结果　从 2 0 6个克隆中筛选到阳性克隆 2 3个 ,再分别用肺吸虫、肝片虫、姜片虫和日本血吸虫脱脂全虫粗抗原进一步交叉筛选 ,最终获得特异性抗Cs -MAg阳性克隆 3个 (B0 5 ,C10和E38)。对其中 2株 (E38和B0 5 )序列分析表明它们的κ轻链V基因属于人VκⅠ (O2 )亚群 ,J基因属于Jκ1;γ链V基因属于人VHⅠ - 6 9亚群 ,D基因来自D3- 10 ,J基因则来自JH3。结论　用成虫代谢抗原直接包板 ,可以从抗体库中筛选到阳性克隆 ,构建的噬菌体抗体库是成功有效的     

华支睾吸虫cDNA文库的构建

目的　构建华支睾吸虫cDNA文库。方法　采集华支睾吸虫阳性鱼 ,分离囊蚴 ,感染实验动物兔 ,解剖兔收集华支睾吸虫成虫虫体。应用“一步法”提取华支睾吸虫总RNA ;经过mRNA纯化、cDNA合成 ,以PcDNA3(Amp +)质粒为载体构建文库。挑取 2 0个克隆进行扩增 ,选择 9个克隆进行DNA序列测定。序列结果与GenBank中相关基因进行比对。结果　获得含有 9 7× 10 5个重组子库容量的华支睾吸虫cDNA文库。其中PC6号克隆基因序列与华支睾吸虫半胱氨酸蛋白酶序列具有 93%的同源性。结论　已构建成华支睾吸虫cDNA文库。     

虫卵ITS-2序列分析鉴别华支睾吸虫和扇棘单睾吸虫的研究

目的建立以分子生物学技术为基础的华支睾吸虫与扇棘单睾吸虫的ITS-2序列分析鉴别方法。方法在华支睾吸虫流行区采集华支睾吸虫和扇棘单睾吸虫成虫,从成虫虫体分离并收集虫卵。以蛔虫、鞭虫、钩虫、蛲虫做对照虫种,按不同虫种和虫卵数分成5个实验组,各组分别提取DNA,并扩增ITS-2序列,对扩增产物进行测序并作同源性分析以确保为目标片段,根据PCR扩增产物电泳获得的条带判定虫种。结果以华支睾吸虫和扇棘单睾吸虫虫卵DNA为模板的PCR产物电泳图谱分别在400bp、500bp左右各显示一条明显条带;在以两种虫卵DNA混合液为模板的PCR产物中,电泳图谱在400bp左右和500bp左右各显示明显条带。将测序得到的两种核苷酸序列进行Blast比对后,显示与GenBank中相应的华支睾吸虫和扇棘单睾吸虫序列高度同源。混入四种肠道线虫虫卵DNA的PCR产物中,除目的条带外,无其他条带。结论该方法可以对华支睾吸虫及扇棘单睾吸虫虫卵进行鉴别,且结果不受常见四种肠道线虫虫卵干扰,敏感性和特异性较高,可作为两虫种的鉴别检测方法。     

华支睾吸虫3-磷酸甘油酸激酶基因的扩增、克隆及表达

目的　构建编码华支睾吸虫3磷酸甘油酸激酶基因的原核表达载体,并分析其在大肠埃希菌中的表达。　方法　用Trizol法从华支睾吸虫 3成虫体内提取总RNA,并将其反转录成cDNA。根据华支睾吸虫磷酸甘油酸激酶的已知基因,利用DNAclub和PCRdesign软件设计合成一对特异引物 ,从合成的cDNA中,用PCR技术扩增出目的片段。将目的片段和原核表达载体同时双酶切后连接,重组体转入JM109大肠埃希菌,用双酶切、PCR和测序筛选阳性克隆。挑选1个阳性菌落,用异丙基βD硫代半乳糖苷诱导表达,表达产物进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)鉴定。　结果　用逆转录聚合酶链反应技术扩增出1条1248bp大小的片段,PCR产物测序鉴定正确;转化后得到10个克隆,双酶切、PCR扩增鉴定,其中6个为阳性克隆;表达产物用SDS PAGE鉴定,在相对分子质量70000处有1条与理论预测的融合蛋白大小相一致的特异条带。　结论　成功构建重组原核表达载体pGEX4T1PGK,所表达的蛋白为含有谷胱甘肽的融合蛋白