造血系统肿瘤WT1基因启动子区域DNA甲基化及其调控的研究

目的 应用聚合酶链反应（PCR）的实验方法研究白血病细胞系中WT1基因启动了区域的DNA甲基化水平，及其与WT1基因表达的关系。方法 ①采用RT-PCR技术及甲基化特异性PCR（Methylation-spectific PCR，MSP）技术检测8226、HL-60、Jurkat、KG-1及Raji等血液系统肿瘤细胞系中WT1基因mRNA表达水平及其启动子区域的DNA甲基化状态；②以5-杂氮脱氧胞嘧啶（5-aza-CdR）对U937细胞系进行去甲基化处理，并观察WT1基因表达水平的改变。结果 ①HL-60、K562、KG-1、NB4及SHI-1细胞系中WT1表达水平高，而8226、Jurkat、Raji、U266和U937细胞系WT1表达水平则极低，同时检测到在8226、Jurkat、Raji、U266和U937这5个细胞系存和WT1基因启动子区域DNA高甲基化；②经去甲基化处理后，U937细胞系的WT1基因表达水平较未处理者上升，同时伴随着WT1启动子区域DNA甲基化水平的下降和未甲基化水平的升高。结论 WT1基因启动子区域DNA高甲基化是抑制其表达的机制之一。     

EGFP作为报道基因在研究WT1基因调控元件中的应用

本研究调查EGFP基因作为报道基因在研究WT1基因调控功能中应用的可行性。利用基因重组技术分别将WT1基因启动子和增强子的功能片段构建到质粒pEGFP-1载体中,转化感受态E.coli菌细胞,筛选了阳性转化菌落,通过限制性酶切鉴定重组质粒插入片段正确的菌落,抽提重组质粒DNA;同时将重组质粒转染K562细胞,通过荧光显微镜检测重组质粒的功能。结果表明：通过基因重组技术分别构建了含有WT1基因启动子的载体（pEWP）和含有WT1基因启动子和增强子的载体（pEWPE、pEWPA和pEWPD）。转染48小时后,pEWP、pEWPE、pEWPA和pEWPD的K562细胞在荧光显微镜下能够显示荧光,而转染了空载体pEGFP-1的K562细胞未出现荧光。结论：EGFP基因作为报道基因可以用于WT1基因调控功能的研究,为进一步开展基因治疗创造了条件。     

WT1基因在造血调控和造血系统恶性疾病中的研究

造血调控异常是造血系统恶性疾病发生的重要原因，ＷＴ１基因与造血调控及恶性血液病的发生密切相关。ＷＴ１基因在白血病，尤其是急性髓细胞白血病中高表达，可以作微小残留病检测的共同标记。     

WT1基因与造血系统疾病

ＷＴ１基因作为一种抑癌基因最早在Ｗｉｌｍｓ瘤中发现并克隆,其表达具有组织特异性。近年来发现它在造血组织中也有特异表达,对造血细胞的增殖分化有重要的调节作用,而且它在白血病发病中的作用与在Ｗｉｌｍｓ瘤中有很大差别。本综述了ＷＴ１基因在造血系统中的研究进展。     

WT1基因在白血病中的表达及意义

ＷＴ１基因在白血病中的表达及意义吴晓雄综述汪月增裴雪涛审校Ｗｉｌｍｓ肿瘤基因（Ｗｉｌｍｓ＇ｔｕｍｏｒｇｅｎｅ，ＷＴ１）是最早发现的与Ｗｉｌｍｓ肿瘤的发生、发展有关的基因，其等位基因的功能缺失可导致Ｗｉｌｍｓ肿瘤。ＷＴ１可以抑制胰岛素样生长因子Ⅱ、集落...     

MTS1基因β启动子转录活性研究

目的 研究IMTSl基因β启动子在急性T淋巴细胞白血病细胞株中的转录激活情况，鉴定β启动子转录活性的功能片段区。方法 用DNA重组方法，构建MTS1基因口启动子3′端转录起始点相同，而5′端序列不同的7种pGL3重组质粒。用脂质体介导的基因瞬时转染法，将构建的重组质粒分别转染MTSl基因双等位缺失的Jurkat细胞株，检测pGL3重组质粒中荧光素酶报告基因的表达，观察β启动子在Jurkat细胞中的激活情况及其基础转录活性片段区。结果 成功构建了MTSI基因β启动子7种不同片段的重组质粒，它们在Jurkat细胞中均有转录活性，其中0．38kb Sac Ⅱ-Sac Ⅰ酶切片段是MTSl基因β启动子转录活性的基础片段。结论 IMTSlβ启动子可在Jurkat细胞中被激活。     

白血病细胞WT1基因启动子区DNA甲基化研究

目的：研究白血病细胞WT1启动子区DNA甲基化与其表达的关系。方法：采用RT-PCR技术、硫化PCR结合限制性内切酶技术检测白血病细胞系及正常人外周血单个核细胞WT1基因的表达及其启动子区DNA甲基化水平。结果：正常人外周血单个核细胞及U937细胞不表达WT1基因，而HL-60、K562和KG1细胞高表达WT1基因，HL-60细胞WT1基因无甲基化。结论：WT1基因启动子区DNA甲基化不能抑制其表达，尚存在其他调节WT1基因表达的因素。     

WT1基因与白血病研究现状

WT1是Wilms’瘤抑癌基因,在人类白血病细胞中表达水平很高,对其生长分化有重要作用。本文综述了WT1基因的结构、功能以及与白血病的关系。     

急性白血病患者WT1基因异构体的研究

ＷＴ1基因是Ｗｉｌｍｓ瘤的候选基因。近年来研究发现它在白血病中有异常的高表达 ,提示ＷＴ1与造血系统恶性疾病有密切的关系。为了研究在白血病中ＷＴ1四种异构体相对比例的改变对造血系统疾病发生和预后的意义 ,我们使用ＲＴ ＰＣＲ方法联合核酸扫描定量技术 ,对 4 6例ＷＴ1表达阳性白血病患者骨髓细胞进行了分析研究。对象和方法1　研究对象　 4 6例ＷＴ1基因表达阳性的初治白血病患者的骨髓标本 ,其中急性淋巴细胞白血病 (ＡＬＬ) 8例 ,急性髓细胞白血病 (ＡＭＬ) 38例 (Ｍ15例、Ｍ2 10例、Ｍ3 13例、Ｍ42例、Ｍ58例 )。临床治疗方案 :…     

WT1基因与白血病研究现状

ＷＴ１是Ｗｉｌｍｓ’瘤抑癌基因，在人类白血病细胞中表达水平很高，对其生长分化有重要作用。本文综述了ＷＴ１基因的结构，功能以及与白血病的关系。     

NB4细胞系诱导分化过程中WT1基因表达的变化

为了研究WT1基因的表达与NB4细胞诱导分化的关系,应用基因重组技术建立了竞争性RT-PCR定量检测WT1基因表达的方法,并用间接免疫荧光标记法检测NB4细胞表面抗原CD11b的变化.结果发现,随着NB4细胞向粒系终末分化WT1基因表达迅速下降,全反式维甲酸(ATRA)作用0,12,24小时后每μg总RNA中WT1基因的分子数分别为4×106,1.56×106和0.4×106,与CD11b的变化情况相一致.结论提示,WT1基因高表达与NB4白血病细胞分化阻滞有关,WT1基因定量检测与细胞表面抗原检测结合有助于白血病细胞诱导分化的研究.     

正常人骨髓不同细胞群中WT1基因表达及其异构体比例研究

本研究探讨WT1基因在正常人骨髓不同分化阶段造血细胞中的表达程度及异构体间比例关系。采用实时荧光定量RT-PCR方法检测18例正常人骨髓标本中CD34^＋CD38^-、CD34^＋CD38^＋、CD15^＋CD11b^＋、CD33＋CD14^＋、CD20^＋CD5^-和CD20^-CD5^＋细胞群中总WT1、WT1（＋17AA）及WT1（＋KTS）的表达。结果表明：与K562细胞相比,CD34^＋CD38^-、CD34^＋CD38^＋、CD15^＋CD11b^＋和CD33^＋CD14^＋细胞群中均存在WT1基因的低表达,且依次逐渐降低;在CD20^＋CD5^-和CD20^-CD5^＋细胞群中未检测到WT1基因表达。在分化程度较低的CD34^＋CD38^-和CD34^＋CD38^＋细胞群中以＋17AA,＋KTS及WT1（＋/＋）异构体为主,而较成熟的CD15^＋CD11b^＋和CD33＋CD14^＋细胞群中以-17AA、-KTS及WT1（-/-）异构体为主。结论：在正常人骨髓细胞中WT1基因的表达随着细胞分化程度提高而降低,造血细胞可能通过其4种异构体比例的调整而发挥抑制或促进分化的作用。     

WT1介导的转录调控通路与白血病

WT1基因编码的锌指转录因子能调控下游基因的转录，其中很多靶基因涉及调节细胞周期和增殖分化，而WT1本身也接受其上游基因的调控，如NF-кB和GATA-1等，这样便构成WT1介导的转录调控通路，参与造血系统发育的调控，如果转录因子的表达脱调控以及随之而来的正常基因表达态势受干扰，常会引起造血细胞的增殖，分化及凋亡动态平衡的紊乱，最终导致白血病，本就WT1介导的转录调控通路与白血病的关系作一综述。     

WT1基因干扰质粒的构建

目的构建WT1(Wilms’tumor susceptibility gene,WT1)基因siRNA(small interference RNA,siRNA)载体, 为进一步探讨WT1的生物学功能奠定基础。方法根据针对WT1 mRNA的有效的siRNA序列,设计合成两条shRNA(small hair RNA,shRNA)的DNA模板单链,同时模板链两端分别设计不同的两个限制酶切位点。退火形成siRNA载体插入片断。用限制性内切酶将siRNA空载体线性化,T4连接酶将插入片断插入siRNA空质粒中。结果经酶切、PCR及测序鉴定确定构建成功。结论成功构建了WT1的干扰质粒,可对其生物学行为作进一步研究。     

Rspo1基因转染间充质干细胞株的构建及生物学活性鉴定

目的：构建稳定表达Rspo1的基因转染间充质干细胞株。方法将人Rspo1全长cDNA重组入逆转录病毒载体pEGZ-Term,通过与辅助病毒载体共转染293T细胞,包装为具有感染力的完整重组病毒载体,收集培养上清感染间充质干细胞C3H10 T1/2细胞株,筛选获得G418抗性的基因转染细胞,通过RT-PCR与流式细胞术检测感染后C3H10 T1/2细胞Rspo1分子的表达,并采用细胞计数法观察其上清对SW480结肠癌细胞增殖能力的影响。结果成功构建pEGZ-Term/Rspo1逆转录病毒表达载体,获得了稳定表达人Rspo1的基因转染细胞株C3H10/Rspo1,该细胞株上清能促进SW480结肠癌细胞增殖。结论建立了稳定表达Rspo1的基因转染间充质干细胞株,为进一步利用Rspo1和间充质干细胞靶向作用于肠道干细胞救治肠上皮损伤的研究奠定了基础。     

巢式MS-PCR法检测恶性血液病细胞株APC基因启动子甲基化状态

本研究旨在应用巢式甲基化特异性PCR（nMS—PCR）法检测10种恶性血液系统肿瘤细胞株APC基因启动子的甲基化状态,并探究其在肿瘤发生发展中的作用,同时筛选出APC基因启动子高甲基化的肿瘤细胞株,将其作为研究基因甲基化与表达关系的细胞模型。采用nMS—PCR扩增亚硫酸盐修饰后的10种肿瘤细胞株基因组DNA,检测其APC基因启动予区CpG岛的甲基化状态。结果表明,CA46、U266、Molt4、K562、HL-60、CEM、AKR、U937、Raji细胞的APC基因启动子区均未甲基化,而Jurkat细胞的APC基因启动子区出现甲基化。结论：用nMS—PCR可以准确地检测出恶性血液病细胞株APC基因的甲基化状态,该方法操作简便,可用于检测各种肿瘤细胞基因的甲基化状态。     

人类ERMAP基因在不同细胞系中表达的研究

为了探讨人类ERMAP基因在不同细胞系的表达谱和表达量的特点,选择血液肿瘤、实体瘤、正常组织细胞等不同类型的15种细胞系,在培养的12、24、36、48、60、72小时共6个时间点采集细胞,用荧光定量PCR检测人类ERMAP基因表达量。结果发现,K562细胞在培养12、24小时时ERMAP基因表达阳性,其表达量分别为(5.092±2.331)×106cps/μlRNA、(5.328±3.916)×106cps/μlRNA;ECV304细胞在培养24小时时ERMAP基因表达阳性,其表达量为(0.84±0.12)×106cps/μlRNA,其余13株细胞系ERMAP基因表达阴性。结论:首次发现人类ERMAP基因在ECV304细胞系中表达,进一步证实ERMAP在K562细胞系中表达。     

白血病U937细胞系WT1基因静默的机制研究

本研究探讨白血病细胞系WT1基因的甲基化状况及其与表达的关系.用甲基化抑制剂和组蛋白脱乙酰基酶抑制剂成功诱导WTI表达.用地西他滨、曲古抑菌素处理白血病U937、HL-60、K562细胞系,用RT-PCR、改良的硫化PCR结合限制性内切酶技术检测mRNA表达.结果表明,U937细胞不表达WT1基因,而HL-60、K562和KG1细胞高表达WT1基因;HL-60细胞WT1基因没有甲基化,而K562和U937细胞发生了甲基化.地西他滨、曲古抑菌素单药处理U937细胞不能诱导WT1基因表达,而二药联合作用可以诱导U937细胞系WT1基因重新表达.结论:单纯DNA甲基化不能抑制白血病细胞WT1基因表达;DNA甲基化与组蛋白脱乙酰基共同抑制了WT1基因表达;地西他滨、曲古抑菌素联合作用可以重新诱导WT1基因表达.     

联合检测WT1基因和COX-2基因表达在急性白血病的临床价值

目的 通过观察急性白血病（AL）患者WT1基因（WT1 mRNA）和COX-2基因（COX 2 mRNA）的表达情况,探讨其相关关系及临床检测价值.方法 125例初诊AL患者为研究对象,采用实时荧光定量PCR（RQ PCR）动态检测WT1mRNA和COX-2 mRNA的表达水平,并分析其与临床参数的相关性.结果 初诊AL患者WT1 mRNA和COX-2 mRNA表达水平（中位数157.7和163.2）均显著高于正常对照组（中位数1.65和0.87） （P＜0.01）,且WT1 mRNA与COX-2mRNA表达水平呈相关性（r=0.509,P＜0.05）.初诊AL患者WT1 mRNA和COX-2 mRNA的表达水平显著高于缓解组（中位数3.65和4.37）（P＜0.05）;缓解组AL患者WT1 mRNA和COX-2 mRNA的表达水平与对照组的差异无统计学意义（P＞0.05）;复发组AL患者WT1 mRNA和COX-2 mRNA的表达水平（中位数167.9和178.5）与初诊组的表达水平差异无统计学意义（P＞0.05）.WT1 mRNA表达水平在AL各亚型之间差异有统计学意义（X2=423.567,P＜0.01）,M5WT1 mRNA表达水平最低,M3表达最高.结论 AL患者WT1基因与COX-2基因表达水平存在相关性,联合检测WT1 mRNA和COX-2 mRNA,可作为AL患者疗效评价、监测微小残留病和预后判断的指标,为临床化疗方案个体化提供更可靠的依据.     

从贮存骨髓涂片提取RNA检测骨髓增生异常综合征病人的WT1基因表达

从贮存骨髓涂片提取RNA,用巢式RT-PCR检测61例骨髓增生异常综合征（MDS）病人的WT1基因表达,结果显示各类型MDS病人均高表达WT1基因,难治性贫血伴原始细胞增多（RAEB）和转变中的RAEB（RAEB-t)的表达率高于难治性贫血（RA）和环形铁粒幼细胞性难治性的贫血（RAS）,WT1基因的表达与MDS病人的疾病进展呈正相关关系。WT1基因表达的RT-PCR检测可作为判断疾病进展的一个有用指标。