人骨髓间充质干细胞体外定向诱导分化为脂肪细胞方法的建立

目的：分离和培养人骨髓间充质干细胞（hMSCs）,并在体外定向诱导hMSCs分化为脂肪细胞。方法：利用Percoll梯度分离法、贴壁筛选法及单克隆培养法,分离、培养、扩增hMSCs;应用地塞米松、吲哚美辛、IBMX及胰岛素定向诱导hMSCs分化为脂肪细胞。结果：体外分离、培养出高度同源性的hMSCs,hMSCs具有独特的细胞免疫学表型,即CD73、 CD105、CD166、CD90及CD44阳性,CD34、CD31及CD45阴性。诱导3 d后,hMSCs细胞内有小脂滴出现,诱导2周后,脂滴数量增加并相互融合,细胞由长梭形变为圆形或多边形。结论：成功建立hMSCs分离培养方法,体外定向诱导hMSCs分化为脂肪细胞。     

间充质干细胞定向诱导为内皮细胞的体外研究

目的:为寻找心血管组织工程新的种子细胞来源,探讨大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)的体外培养方法和向血管内皮细胞分化的能力.方法:利用淋巴细胞分离液分离出MSCs,并体外扩增,激光共聚焦显微镜检测表面抗原表达,以含血管内皮细胞生长因子(VEGF)、碱性成纤维生长因子(bFGF)的诱导分化培养液定向诱导传代使其向血管内皮细胞方向分化,观察细胞形态的变化,检测内皮细胞特异性标志物的表达.结果:MSCs在体外传代扩增后激光共聚焦显微镜检测结果显示CD44、CD90表达阳性,CD31、CD45为阴性,分化后细胞具有内皮细胞的形态学特征,并表达内皮细胞特异性标志物CD31.结论:骨髓间充质干细胞可在体外诱导向内皮细胞方向分化.     

兔骨髓间充质干细胞定向诱导移植修复关节软骨的实验研究

目的：通过诱导兔骨髓间充质干细胞（MSCs）,观察干细胞向软骨细胞的分化效果。方法：纯化兔骨髓间充质干细胞;用含转化生长因子β1的诱导液培养骨髓间充质干细胞;以MTT测定诱导细胞的增殖活性;免疫组化检测Ⅱ型胶原蛋白的表达;诱导后的细胞移植于白兔膝关节内,X线摄片观察软骨修复形成情况。结果：诱导液可有效诱导MSCs向软骨细胞表型转化,且骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化所需的特异性细胞外基质——Ⅱ型胶原明显升高,移植后效果明显。结论：兔骨髓间充质干细胞定向诱导后移植修复关节软骨是有效的。因此骨髓间充质干细胞有可能成为软骨组织工程较理想的种子细胞来源。     

肝样细胞的诱导分化及处理胆红素的能力

目的：利用肝细胞生长因子（HGF）、表皮生长因子（EGF）和成纤维细胞生长因子-4（FGF-4）诱导骨髓间充质干细胞（MSCs）向肝细胞分化,为肝组织工程提供新的细胞来源。方法：取志愿者骨髓,使用密度梯度离心法联合贴壁筛选法获取MSCs,用含有HGF、EGF、FGF的培养基进行培养。用流式细胞仪、免疫细胞化学法鉴定细胞表型,检测诱导后细胞胆红素处理能力。结果：骨髓MSCs生长良好,表型为CD29阳性,CD34阴性。诱导后细胞可在21～28 d时形成肝样细胞。诱导7 d后细胞检测到AFP的表达,第14天时CK18呈阳性表达,随着诱导时间的延长,阳性率增加,并能显著降低胆红素浓度。结论：HGF、EGF、FGF联合能诱导骨髓MSCs分化为具有处理胆红素能力的肝样细胞。     

骨髓间充质干细胞体外可定向诱导为内皮细胞

目的:探讨大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)的体外培养方法和向血管内皮细胞分化的能力。方法:利用淋巴细胞分离液分离出MSCs,体外扩增,激光共聚焦显微镜检测表面抗原表达,以含VEGF、bFGF的诱导分化培养液定向诱导传代使细胞向血管内皮细胞分化,免疫荧光及免疫组化检测内皮细胞特异性标志物鉴定。结果:MSCs在体外传代扩增后激光共聚焦显微镜检测结果显示CD44、CD90表达阳性,CD31、CD45为阴性,分化后的细胞具有内皮细胞的形态学特征可表达CD31及Ⅷ因子。结论:骨髓间充质干细胞可在体外诱导向内皮细胞方向分化。     

血管内皮生长因子C诱导骨髓间充质干细胞分化为淋巴管内皮细胞的研究

目的 研究骨髓间充质干细胞向淋巴管内皮细胞分化的潜能及条件,为淋巴管再生和重建提供理想的细胞来源。方法 分离SD大鼠骨髓间充质干细胞,流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞表面抗原CD31、CD14、CD29和CD90。将纯化的骨髓间充质干细胞加血管内皮生长因子C(VEGF-C)50ng/mL诱导培养10d,Western-blot法与免疫荧光染色法检测细胞中淋巴管内皮细胞标记物Prox-1和LYVE-1的表达。结果 骨髓间充质干细胞呈现典型的梭形和旋涡状排列;经VEGF-C诱导后,细胞变短、呈多边形。流式细胞学显示,分离培养的骨髓间充质干细胞表面抗原CD29、CD90呈阳性表达,CD31、CD14呈阴性表达;Western-blot检测显示,经VEGF-C培养诱导后,细胞明显表达淋巴管内皮特异性标记物Prox-1和LYVE-1;免疫荧光染色显示,诱导后细胞均明显表达Prox-1和LYVE-1,而未分化的骨髓间充质干细胞Prox-1和LYVE-1均不表达。结论 VEGF-C可以诱导骨髓间充质干细胞表达淋巴内皮细胞特异性标记物,促进其向淋巴管内皮转化。     

胎儿骨髓来源的Flkl^＋CD34^—细胞的血液血管干细胞特性

目的:研究骨髓基质中是否具有血液血管干细胞的特征。方法：分离并培养人胎儿骨骨基质细胞（hfMSCs),FACS检测细胞的免疫表现。将此细胞接种在基底膜胶中，由血管内皮细胞生长因子（VEGF）和碱性成纤维细胞生长因子（bFGF)诱导，免疫组化和透射电镜检测轿管和造血的分化形成。结果：此细胞群体的典型特征是CD34阴性的成纤维样细胞99％表达Flkl(即血管内皮细胞生长因子受体2），并能形成血管样结构，而在管样结构形成的过程中诱导的CD34阳性的圆形细胞。结论：Flk^ CD34^-的hfMSC能向血管内皮细胞和造血细胞分化，提示其具有血液血管干细胞的特征表型。     

大鼠骨髓间充质干细胞向内皮细胞分化潜能的研究

目的体外研究大鼠骨髓间充质干细胞(rMSCs)分化为血管内皮细胞的潜能。方法采用密度梯度离心法分离rMSCs,体外扩增并进行鉴定。在内皮细胞生长培养基(EGM-2)中以血管内皮细胞生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)定向诱导rMSCs向血管内皮细胞分化,观察细胞形态学变化。采用免疫细胞化学法和Dil荧光标记法,分别检测诱导后rMSCs的内皮细胞表型表达及对乙酰化低密度脂蛋白(Ac-LDL)的摄取能力。结果形态学观察显示,诱导后的rMSCs可见类似内皮细胞样改变,并表达血管内皮细胞特异的表面标志vWF和CD31,但仅少数细胞具有摄取Dil-Ac-LDL的能力。结论VEGF和bFGF在体外能够诱导rMSCs出现内皮细胞表型,但尚不完全具备成熟内皮细胞的功能特性。rMSCs具有向血管内皮细胞分化的潜能。     

诱导人骨髓间充质干细胞向运动神经元分化的研究

目的探讨人骨髓间充质干细胞（human bone marrow mesenchymal stemcells,hMSCs）在体外诱导向运动神经元分化的潜能。方法用密度梯度离心法分离hMSCs,在含有10%FBS的DMEM/F12培养基中的培养扩增。将传代后的第1代hMSCs分为诱导组和对照组,诱导组的细胞在完全培养基中加入终浓度为10μg/L碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）预处理24h后,用0.5μg/mL维甲酸（RA）和200ng/mL音速波状蛋白（shh）联合诱导10d。对照组不加上述诱导剂。光镜下观察其分化过程中hMSCs的形态变化,免疫组化检测诱导前后细胞是否表达神经干细胞特异性标志蛋白,用流式细胞仪检测是否产生运动神经元及在总的细胞数种所占比率,并用流式软件分析结果。结果诱导组hMSCs经诱导后能分化为具有典型神经元形态的细胞,部分细胞表达抗人神经巢蛋白（Nestin）,表达率达到（25.0±4.8）%;流式检测诱导后运动神经元特异性标志蛋白HB9表达,表达率达到（50.0±5.3）%。对照组细胞形态无改变,无Nestin表达,HB9表达小于5%。结论hMSCs在体外条件下能诱导分化为运动神经元样细胞。     

大鼠骨髓间充质干细胞向内皮细胞分化潜能的研究

目的 体外研究大鼠骨髓间充质干细胞(rMSCs)分化为血管内皮细胞的潜能.方法 采用密度梯度离心法分离rMSCs,体外扩增并进行鉴定.在内皮细胞生长培养基(EGM-2)中以血管内皮细胞生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)定向诱导rMSCs向血管内皮细胞分化,观察细胞形态学变化.采用免疫细胞化学法和Dil荧光标记法,分别检测诱导后rMSCs的内皮细胞表型表达及对乙酰化低密度脂蛋白(Ac-LDL)的摄取能力.结果 形态学观察显示,诱导后的rMSCs可见类似内皮细胞样改变,并表达血管内皮细胞特异的表面标志vWF和CD31,但仅少数细胞具有摄取Dil-Ac-LDL的能力.结论 VEGF和bFGF在体外能够诱导rMSCs出现内皮细胞表型,但尚不完全具备成熟内皮细胞的功能特性.rMSCs具有向血管内皮细胞分化的潜能.     

体外诱导骨髓基质干细胞向内皮细胞分化的实验研究

目的：探讨成体骨髓基质干细胞体外定向诱导分化为内皮细胞的可行性，为心血管组织工程提供新的种子细胞来源。方法：骨髓穿刺抽取绵羊骨髓液，密度梯度离心法获取骨髓单个核细胞，通过贴壁培养纯化骨髓基质干细胞。以含EGF、bFGF、IGF和肝素的M199培养液培养原代细胞，并以VEGF诱导骨髓基质干细胞向内皮细胞分化。通过CD34、CD31流式细胞仪分析，免疫组化CD34、CD31、Ⅷ因子相关抗原染色鉴定内皮细胞，UEA结合实验及NO含量测定评价内皮细胞功能。结果：骨髓基质干细胞表达α-SMA，不表达CD34和CD31。体外定向诱导2周后分化为内皮细胞。呈梭形，表达CD34和CD31及Ⅷ因子相关抗原，UEA结合试验阳性，并具有分泌NO的功能。结论：体外培养条件下骨髓基质干细胞能够分化为内皮细胞，并具有成熟内皮细胞的生物学特性和功能。     

脐血CD34＋细胞向内皮细胞诱导分化的体外研究

目的：探讨从脐血中分离CD34＋细胞,并诱导、鉴定其分化为内皮细胞的方法。方法：羟乙基淀粉沉降、密度梯度离心两步法制备脐血单个核细胞,免疫磁珠分选法（MACS）获得CD34＋细胞,在含有细胞因子的M199培养基中诱导。观察细胞形态变化,摄取Dit标记的乙酰化低密度脂蛋白（Dil—AcLDL）的情况,流式鉴定细胞表面标志。结果：分选CD34＋细胞纯度在91％以上,培养3d有明显集落形成及部分细胞贴壁,14d贴壁细胞呈条索状,逐渐增多后呈铺路石样改变。流式检测贴壁细胞表达血管内皮细胞特异性标志物CD144、vWF、CD31、CD34,而白细胞共同抗原CD45为阴性表达,与成熟的脐静脉内皮细胞表达率相近。免疫荧光发现贴壁细胞呈现红色荧光,提示细胞摄取Dil—AcLDL,证明CD34＋细胞分化为有功能的内皮细胞。结论：脐血中存在CD34＋细胞且用两步法和MACS可获得高纯度CD34＋细胞,在特定条件下可分化为内皮细胞。     

小鼠骨髓间充质干细胞定向诱导分化血管内皮细胞的实验研究

目的探讨体外小鼠骨髓间充质干细胞(mBMMSCs)的分离培养对其定向诱导分化为血管内皮细胞(VECs)的可行性。方法采用全骨髓贴壁法,分离骨髓间充质干细胞(MSCs)体外纯化培养并传代,倒置显微镜观察原代细胞形态变化,采用生长曲线法及3-(4,5-二甲基-2-噻唑)-2,5-二苯基溴化四氮唑蓝(MTT)法观察传代细胞生长特性。采用第3代mBMMSCs在内皮细胞生长培养基(EBM-2)中以血管内皮细胞生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)进行定向诱导,观察细胞形态学变化;流式细胞仪分析比较第3代mBMMSCs及诱导后细胞DNA周期、细胞免疫表型的变化;免疫细胞荧光技术分别检测CD31、vWF和CD34表达及摄取Di-lac-LDL结合FITC-UEA-1的功能特点;体外血管形成实验检测血管内皮细胞的功能。结果 mBMMSCs原代培养呈长梭形、漩涡状排列生长,P1、P2、P3细胞生长曲线及MTT法显示呈潜伏期、对数生长期及平台期生长。诱导后的部分细胞形态可见类似血管内皮样改变,呈多角形、短梭形、铺路石样排列生长;细胞周期分析显示,第3代mBMMSCs G0/G1期为86%,诱导分化后的细胞G0/G1期为92%,细胞DNA周期无明显差异;第3代mBMMSCs免疫表型结果显示为CD105、CD90、CD73、CD44阳性表达,而CD34、CD45、VEGF(CD309)、CD14阴性表达;诱导分化后的细胞VEGF(CD309)、CD34弱阳性表达,而CD105、CD90、CD73、CD44、CD45、CD14阴性表达;细胞免疫荧光技术检测第3代mBMMSCs表面CD31、vWF和CD34阴性表达,不具有摄取Dil-ac-LDL、结合FITC-UEA-1的功能特点及形成血管管腔样结构;诱导后的细胞表达VECs特异性表面标志CD31、vWF和CD34,具有摄取Di-lac-LDL、结合FITC-UEA-1的功能特点及体外可形成血管管腔样结构。结论采用全骨髓贴壁法培养的mBMMSCs在体外具有定向诱导分化为VECs的潜能,成为血管组织工程理想的细胞来源。     

人骨髓间充质干细胞分离培养鉴定及VEGF基因的转染

目的：探讨人骨髓间充质干细胞（hMSC）分离培养、鉴定方法及人血管内皮生长因子（hVEGF）165基因转染hMSC后表达情况,拟构建血管化组织工程皮肤.方法：用密度梯度离心法分离骨髓间充质干细胞,筛选贴壁细胞培养并传代.观察细胞形态,生长情况.检验细胞CD44、CD29、CD14、CI45等表面标记.利用基因重组技术,构建pCDN3.1＋VEGF表达质粒,并将其转染第3代hMSC.经G418抗性筛选后扩大培养并用Western blot实验检测其蛋白产物.结果：骨髓密度梯度离心法分离hMSC,接种培养瓶后26 h呈对数生长,6d后达到高峰.hMSC表达CD29,CD44,不表达造血细胞标记物CD14和CD45.通过酶切鉴定验证成功构建pCDN3.1＋ VEGF表达质粒.Western blotting实验证实转染后hMSCs表达VEGF增加.结论：成功建立hMSC分离培养鉴定体系.利用基因重组技术可成功将hVEGF基因导入hMSC并产生预期效应.     

体外诱导成人外周血干细胞向血管内皮细胞分化

目的研究人外周血干细胞(PBSC)向血管内皮细胞分化。方法以血管内皮细胞生长因子(VEGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对经重组人粒细胞集落刺激因子刺激后采集的PBSC进行诱导培养,观察细胞形态的变化,运用流式细胞术检测诱导后的细胞表达CD31和vWF情况,并用透射电镜观察细胞的超微结构。结果经VEGF和bF-GF诱导后的细胞形态上表现内皮细胞特征,经流式细胞仪测定表达血管内皮细胞特有表面标志CD31和vWF,透射电镜细胞胞浆内可见特征性Weible-Palade小体。结论外周血干细胞在VEGF和bFGF诱导下,可分化为内皮细胞。     

骨髓间充质干细胞移植至血管性痴呆大鼠模型的初步研究

目的：建立体外分离、培养大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）,体外诱导BMSCs向神经元样细胞方向分化、鉴定并移植至血管性痴呆大鼠模型的方法.方法：体外分离培养SD大鼠BMSCs,采用贴壁筛选法分离纯化BMSCs,显微镜下观察不同时期BMSCs的细胞形态,流式细胞术检测细胞表面标志物表达鉴定BMSCs,用含10 μg/L bFGF的L-DMEM及含200μmoVLBHA、2％ DMSO的无血清L-DMEM诱导BMSCs向神经元样细胞分化;免疫细胞化学检测分化细胞的巢蛋白（Nestin）、神经元特异性烯醇化酶（NSE）的表达,以确定其分化特性;用尿嘧啶脱氧核苷（BrdU）标记分化好的细胞,移植到改良Pulsinelli＇s四血管复制的血管性痴呆（VaD）模型大鼠侧脑室内,免疫组织化学检测BrdU表达以反映移植BMSCs在大鼠脑内的生长情况,Moms水迷宫检测大鼠学习记忆能力.结果：大鼠BMSCs可通过贴壁筛选法成功分离并在体外大量扩增,流式细胞仪检测显示BMSCs第5代表面标志可达90％以上,细胞表型CD90、CD29、CD44表达阳性,CD45表达阴性;bFGF/BHA诱导BMSCs分化后有Nestin和NSE表达,分化细胞具有神经细胞的形态;与对照组相比,模型组大鼠逃避潜伏期明显延长,第1次穿越平台时间延长,穿越平台次数减少,差异有统计学意义（P ＜0.05）;BrdU成功标记诱导后的BMSCs,并可在移植大鼠脑内检测到BrdU标记阳性细胞.结论：体外成功分离、培养大鼠BMSCs,生长稳定、可多次传代,bFGF/BHA可诱导BMSCs分化为神经元细胞,BMSCs成功移植到VaD大鼠,BMSCs有望为神经疾病细胞移植治疗提供丰富、易得的细胞来源.     

小鼠骨髓源性内皮祖细胞的体外培养及标志物鉴定

［摘要］目的: 探讨小鼠骨髓来源的血管内皮祖细胞（endothelial progenitor cells,EPCs）的体外培养、诱导分化及表面标志物的鉴别。方法： 收集ICR小鼠骨髓EPCs,Ficoll分离单核细胞,使用含有血管内皮生长因子（VEGF）、成纤维细胞生长因子(FGF)的培养基培养。分别在细胞培养5,10,15及20 d后检测细胞表面的内皮细胞标志物。结果： 培养5 d后细胞开始出现上皮细胞的形态,有伪足出现;培养10 d,细胞开始增殖,成圆形,出现梭形细胞;培养15 d,细胞出现较为典型的内皮细胞形态,铺路石状;培养20 d,细胞出现长梭形拉网状,即类似成熟内皮细胞形态。免疫荧光染色及流式定量检测结果显示,CD34在EPCs中的表达随培养时间延长有渐变减弱的趋势;血管内皮生长因子受体 2（VEGFR-2）在EPCs的表达随培养时间延长有渐变增强的趋势。结论： 骨髓EPCs在特定诱导条件下可分化出典型的成熟内皮细胞,取材方便,扩增能力较强。     

人骨髓间充质干细胞诱导分化为汗腺细胞的实验研究

目的：研究人骨髓间充质干细胞（hMSCs）在体外诱导分化为人汗腺细胞（hSGCs）。方法：体外分别分离培养hMSCs和hSGCs,原代培养hSGCs融合后,收集细胞,制备汗腺细胞匀浆,用含10%汗腺细胞匀浆的汗腺培养基来诱导培养hMSCs。1周后,检测诱导培养的hMSCs的抗原表达。结果：培养的hSGCs表达CK19和CEA;hMSCs表达CD44、105,不表达CK19、CD34和CEA。诱导培养1周,免疫细胞化学染色示诱导培养组少量细胞表达CEA和CK19,而对照组未见CEA和CK19阳性细胞;流式细胞仪检测CEA在诱导培养组的阳性表达率约为（6.2±1.2）%,对照组（0.9%±0.0）%（P〈0.05）。结论：在无完整汗腺细胞存在的情况下,hMSCs在体外也可诱导分化为hSGCs。     

微小RNA可在人骨髓间充质干细胞分化来源的心肌样细胞中表达

目的研究人骨髓间充质干细胞（hMSCs）分化来源的心肌样细胞中代表性微小RNA（miRNAs）的表达。方法利用FITC-偶联的CD29、CD34和CDllb抗体在流式细胞仪上检测分离的hMSCs的抗原表型。分别用5-氮胞苷（5-aza）和乳鼠心肌非接触共培养法诱导传至3代的hMSCs分化为心肌样细胞。用免疫化学法检测hMSCs分化来源的心肌样细胞中心肌特异的α-肌节辅肌动蛋白和心肌肌钙蛋白（cTnI）的表达：利用逆转录PCR和DNA测序鉴定5个代表性的心脏特异的初级微小RNA（pri-miRNAs）的表达。结果hMSC标志分子CD29表达率为98．87％．而造血细胞标志分子CD34和CDllb的表达率只是5％和0．4％。免疫化学分析显示．分别经5-aza和乳鼠心肌非接触共培养诱导的hMSC均可表达α-肌节辅肌动蛋白和cTnI,而在未分化的hMSCs中无表达。miRNA-143,-181可在5-aza诱导的hMSCs中表达,miRNA．143,-181,-206,-208可在乳鼠心肌非接触共培养的hMSCs中表达．而两种诱导方法均未能诱导miRNA-1-2在hMSCs中表达。结论利用5-aza和乳鼠心肌非接触共培养法诱导hMSCs分化的心肌样细胞中可以表达不同的心脏特异的pri-miRNAs。