幽门螺杆菌尿素酶C基因的克隆表达及其免疫原性的鉴定

目的　利用 PCR方法扩增 Hp ure C基因 ,将其克隆入表达载体 p BV2 2 0中以表达 Hp ure C重组蛋白 ,并验证其抗原性和免疫原性 .方法　用 PCR方法从 Hp临床株中扩增Hp ure C基因 ,经 Eco R 和 Bam H 双酶切后克隆入 p GEM-3Zf(- )中 ,用全自动测序仪进行双向测序 .然后将目的片段克隆入表达载体 p BV2 2 0中 ,温度诱导表达 Hp ure C重组蛋白 .用 Western Blot实验验证表达蛋白的抗原性 ,用免疫动物实验验证其免疫原性 .结果　用 PCR方法从 Hp临床株中扩增得到了一段 1173bp的 Hp ure C基因片段 ,对其进行测序 ,经BL AST分析证明所得 DNA序列与 Hp标准菌株 M6 0 398的同源性为 95 % .通过温度诱导 ,获得了 Mr为 4 4× 10 3的 Hpure C重组蛋白质 .经 Western Blot实验和免疫动物实验证实表达的蛋白质有较强的抗原性和免疫原性 .结论　成功地在E.coli中表达了 Hp ure C重组蛋白并证明其有较强的抗原性和免疫原性 .     

屋尘螨抗原Der p2基因的克隆和表达

目的构建并克隆屋尘螨抗原Der p2基因,在大肠杆菌中初步表达. 方法根据已发表的Der p2基因,人工设计合成一系列基因片段,经单链扩增后连接成完整的Der p2基因;将该基因克隆入表达载体pProEX HTb中,测序并进行初步表达. 结果利用所设计的结构制备了完整的Der p2基因,以大肠杆菌为宿主在IPTG的诱导下获得初步表达,该外源蛋白Mr约为17×103,占总蛋白量的20%. 结论所构建的Der p2基因能在大肠杆菌中表达.     

人羧肽酶A1活性中心基因的克隆及原核表达

目的：克隆人羧肽酶A1(carboxyrpeptidase A1，CPA1)活性中心基因，构建重组表达载体并对其进行诱导表达。方法：通过RT-PCR方法扩增出正常胰腺组织中CPA1活性中心基因，克隆入载体pGEM-Teasyr，测序分析．将该目的基因亚克隆于表达载体pGEX-4T-1，测序证实序列正确后转化大肠杆菌DH5α，经IPTG诱导表达重组蛋白。结果：获得了人CPA1活性中心基因，构建了重组表达质粒，表达的蛋白以SDS-PAGE分析，在Mr约46000处出现一条新生蛋白带，经凝胶薄层扫描检测，表达量约占菌体总蛋白的22．1％。结论：成功克隆人CPA1活性中心基因并得到了其原核表达产物，为获得分子量小而具有相似活性的蛋白奠定了基础。     

肿瘤抗原基因MAGE-3的克隆、原核表达与纯化

目的: 克隆人MAGE-3基因并进行原核表达和分离纯化. 方法: 通过RT-PCR从人黑色素瘤细胞株中扩增MAGE-3全长cDNA,经PCR扩增MAGE-3基因3′端324 bp片段,克隆入pGEX-4T-1载体,构建重组原核表达质粒pGEX/MAGE-3,对含有该质粒的大肠杆菌DH5α进行诱导表达和分离纯化.结果: 经RT-PCR扩增出大小约950 bp的基因片段,以此为模板经PCR扩增出约320 bp片段,测序结果与GenBank公布的MAGE-3序列一致,成功构建了pGEX/MAGE-3原核表达质粒,经IPTG诱导在大肠杆菌中表达Mr约42 000的GST融合蛋白,纯化的蛋白纯度为89%.结论: 成功克隆了人MAGE-3基因全长cDNA并对其3′端324 bp片段编码的108个氨基酸的蛋白进行了原核表达和分离纯化,为该蛋白应用于肿瘤免疫治疗奠定了基础.     

结核分枝杆菌furB基因的克隆、表达和纯化

目的: 从H37Rv基因组中扩增furB并高效表达和纯化. 方法: 用PCR技术从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增furB序列,将其与pGEM-T-Easy载体连接转化E.coli DH5α,构建重组克隆载体pGEM-T-Easy/furB,测序正确后将目的基因片断克隆入pQE-80L原核表达载体并转化E.coli DH5α,IPTG诱导目的蛋白表达. 经Western blot鉴定目的基因与(His)6融合表达,将已表达的蛋白质通过Ni2 -NTA亲和色谱柱进行纯化. 结果: PCR得到结核分枝杆菌furB,测序结果与Genbank中报道的完全一致. SDS-PAGE显示,在Mr为15.0×103处有相应的蛋白质表达条带,Western blot鉴定为(His)6融合表达蛋白. 经Ni2 -NTA亲和色谱柱进行纯化后可得到纯化的蛋白. 结论: 成功克隆了铁调节蛋白基因furB序列,并在E.coli DH5α高效表达,亲和层析后获得了纯化目的蛋白.     

人自噬基因hAPG_(12)的克隆及其重组真核表达载体的构建

目的:探讨克隆人自噬基因h APG12 ,构建重组真核表达载体p EGFP- C2 -h APG12 ,为进一步研究h APG12 的功能奠定基础。方法:从正常人外周血单个核细胞中提取总RNA,采用两步法RT- PCR,首先把RNA逆转录为c DNA,而后通过一对h APG12 的特异性引物扩增出目的基因,PCR产物与测序载体p UC18连接后转化到大肠杆菌DH5 α,而后对单菌落进行菌落PCR、酶切和测序鉴定。将测序正确的h APG12 亚克隆入真核表达载体p EGFP-C2 ,该重组载体转化到大肠杆菌DH5 α后进行菌落PCR和酶切鉴定。结果:测序结果表明从正常人外周血单个核细胞中所获得的h APG12 c DNAs含有2 2 5个碱基,与Genbank( BC0 1 1 0 33)序列完全一致。构建的重组真核表达载体经鉴定证实h APG12 基因已完全正确亚克隆到p EGFP- C2 。结论:成功克隆了人自噬基因h APG12 并构建了具有报告基因-增强绿色荧光蛋白( EGFP)基因的重组真核表达载体p EGFP- C2 - h APG12 ,为以后研究h APG12 的功能奠定基础     

人ALEX2部分cDNA序列的克隆与表达

目的：克隆人ALEX2基因部分片段的cDNA,构建重组表达载体并诱导其表达．方法：通过RT—PCR技术从人胚胎脑组织中特异扩增出ALEX2基因部分编码序列片断(630—1058位核苷酸),克隆入pGEM—Teasy载体中,测序后亚克隆于表达载体pGEX-4T-3中,酶切鉴定正确,转化大肠杆菌DH5α,经IPTG诱导4h后,可表达Mc417000的目的蛋白．结果：特异扩增出大小约440bp的片断,经测序与已知序列完全一致,构建了融合蛋白的重组表达质粒PGEX-ALEX2,表达的融合蛋白产物经凝胶薄层扫描检测,占菌体总蛋白量的15．5%．结论：获得了人ALEX2部分基因编码片断及其原核表达产物,为下一步ALEX2 mAb的制备和研究其生物学功能奠定了基础．     

人骨形成蛋白4成熟肽cDNA的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的：克隆编码人骨形成蛋白4(hBMP4)成熟肽的cDNA基因,并在大肠杆菌中表达．方法：从人胎盘组织中提取总RNA,以其为模板,采用RT—PCR方法得到编码hBMP4的成熟肽段(hBMP4m)cDNA,克隆入表达载体pDH2中,转化大肠杆菌DH5α,温度诱导表达．结果：获得hBMP4m cDNA基因,成功克隆入温度诱导表达载体pDH2,DNA序列分析证实所插入的hBMP4m cDNA序列与设计预期一致;将获得重组表达质粒pDH2-hBMP4m转化大肠杆菌DH5α中,经温度诱导,目的蛋白占细菌总蛋白的41．5％．结论：采用分子克隆的方法得到编码hBMP4成熟肽段的cDNA,克隆入表达载体,在大肠杆菌中成功获得hBMP4成熟肽的高效表达。     

应用endostatin蛋白治疗裸鼠SHG44脑胶质瘤的实验

目的　克隆小鼠内皮抑素 (endostatin)基因 ,检测其表达蛋白生物学活性 ,应用该蛋白治疗裸鼠 SHG44脑胶质瘤 .方法　从小鼠胶原 c DNA用 PCR法克隆 endostatin基因 ,重组入 p UC19,测序后构建非融合表达载体 p DH- En-dostatin,使其在 DH5 α内经温度诱导表达 ,纯化该表达蛋白并用鸡胚绒毛膜尿囊膜实验和内皮细胞抑制实验检测其活性 .经荷瘤裸鼠皮下注射该蛋白治疗其脑内胶质瘤 .结果　成功获得 endostatin基因 ,测序正确 .诱导表达蛋白 Mr为2 0× 10 3 ,具有抑制血管生成的活性 .该蛋白可抑制荷瘤裸鼠脑内胶质瘤生长 .结论　 endostatin基因的表达和初步应用 ,为采用抗血管生成方法治疗脑胶质瘤等实体瘤研究奠定了实验基础 .     

幽门螺杆菌细胞毒素相关抗原A的表达纯化及其临床研究

目的　 cag A+ Hp的感染与胃癌的相关性在亚洲有不同报道 ,本研究应用重组幽门螺杆菌毒素相关抗原 A (Cag A)建立检测血清中抗 Cag A抗体的方法 ,以探讨本地区 cag A+ Hp的感染与胃癌的相关性 .方法　构建表达幽门螺杆菌 Cag A抗原的表达载体 ,工程菌经 IPTG诱导 ,表达的 Cag A包含体经 Ni柱纯化 ,变性、复性、透析并经活性鉴定后 ,抗原被点在硝酸纤维素膜上或用以包被 EL ISA板 ,建立检测正常人及胃癌患者血清抗 Cag A抗体的 DIGFA(斑点金免疫渗滤试验 ,简称滴金法 )和 EL ISA法 .结果　重组克隆 p RSETcag A的工程菌可表达 Mr36 0 0 0的目的蛋白 ,表达形式为包含体 ;Cag A包含体经纯化后 SDS- PAGE显示纯度达 98%以上 ,活性经 EL ISA证实 ;正常人 6 4例及胃癌患者血清 5 0例中 ,cag A+ Hp的感染率分别为 2 9.7%和6 2 .0 % ,胃癌患者 cag A+ Hp的感染率明显高于正常人 (P<0 .0 1) .结论　我们建立的检测血清抗 Cag A抗体的 DIGFA和EL ISA均具有良好的可重复性 ;胃癌患者 cag A+ Hp的感染比例明显高于正常人 ,Cag A阳性幽门螺杆菌的感染与胃癌有关 ,Cag A可作为制备防治 cag A+ Hp感染的疫苗的后备抗原 . Cag A可作为幽门螺杆菌疫苗制备的候选抗原 ,检测患者血清幽门螺杆菌 Cag A抗体 ,有可能为胃癌的发     

结核分枝杆菌毒素蛋白 higB 的原核表达及分析

目的：克隆编码结核分枝杆菌毒素基因higB并在大肠杆菌中表达。方法利用PCR法从结核分枝杆菌H37Rv基因组扩增higB基因;构建重组表达质粒pET-32a（＋）-higB;筛选出阳性重组质粒后转化大肠杆菌,诱导目的蛋白表达;利用SDS-PAGE与Western-blot鉴定目的蛋白的表达。结果成功扩增出了higB基因,克隆于载体pET-32 a（＋）质粒中,PCR筛选和酶切鉴定获得阳性克隆,测序证实正确;转化大肠杆菌BL21后higB蛋白没有发生表达。结论已成功构建结核分枝杆菌毒素基因higB的原核表达载体,但大肠杆菌BL21不能表达出higB蛋白。     

人肿瘤坏死因子α单链抗体的原核表达和活性分析

目的　在大肠杆菌中表达抗人 TNF-α单链抗体 (Sc Fv) ,并分析它的结合活性和中和活性 .方法　在获得抗人 TNF-αE6 Sc Fv的基础上 ,用热诱导载体 p BV2 2 0在大肠杆菌中表达 E6 Sc Fv蛋白 .EL ISA测定抗体的结合活性 ,实时 BIA技术确定亲和常数 ,L 92 9细胞毒试验分析其中和活性 .结果　克隆了抗人 TNF-α E6 Sc Fv基因的热诱导载体 p BV2 2 0在大肠杆菌中 ,经42℃热诱导 ,得到了相对分子质量 (Mr)约为 2 70 0 0的重组蛋白质 ,表达量占菌体总蛋白的 18% .对在大肠杆菌中表达的E6 Sc Fv进行了复性和亲和层析纯化 ,并进一步证…     

白血病分化相关基因dif14的原核表达

目的 :构建 pGEX dif14原核表达载体 ,在大肠杆菌中表达dif14蛋白片段以获得其抗原 .方法 :采用N末端融合谷胱甘肽巯基转移酶 (GST)的 pGEX 4T 1载体 ,根据dif14基因开放读框N端 5 2氨基酸序列设计引物PCR扩增并购建原核表达载体 ,测序证实 .在大肠杆菌DH5α中进行表达 .结果 :测序证实dif14原核表达载体构建正确 ,含 pGEX dif14表达质粒的大肠杆菌经异丙基硫代半乳糖苷 (IPTG)诱导后能够表达约Mr35× 10 3 的融合蛋白 .结论 :成功地构建了原核表达质粒 pGEX dif14 ,并在大肠杆菌得到表达 ,为研究dif14的功能奠定了一定的基础     

人p65和IκBα基因真核表达载体的构建及在永生化滑膜细胞中的表达

目的：构建人p65和IκBα基因的真核表达载体并检测其在人永生化滑膜细胞MH7a中的毒达．方法：应用RT—PCR方法从体外培养的HEK293细胞mRNA中扩增出p65和IκBα基因的编码区。克隆至pMD18T载体并测序,然后亚克隆至真核表达载体pcDNA3．1myc／His（-）A,酶切鉴定正确后以脂质体法瞬时转染MH7a细胞,Western Blot检测p65和IκBα的表达．结果：测序证实PCR扩增得到的p65和IκBα基因编码区序列正确;脂质体法转染MH7a细胞后检测到预期目的蛋白的表达．结论：成功构建了p65和IκBα的真核表达载体并使其在人永生化滑膜细胞中表达．     

pGEX-4T-1/HSV2-gG重组质粒的构建及表达

目的 通过基因工程技术,构建含有目的 基因的重组质粒(pGEX-4T-1/HSV2-gG).方法 用PCR技术扩增HSV2-gG基因的免疫优势表位片断;将PCR产物与质粒表达载体pGEX-4T-1连接;然后鉴定含有目的 基因的重组表达载体;并转化大肠杆菌DH5α,诱导表达目的 蛋白;以免疫印迹法检测表达的目的 蛋白.结果 PCR法扩增出1 242 bp的DNA片断;通过PCR法及测序法证实重组质粒中含有1 242 bp的DNA片断.SDS-PAGE和免疫印迹法证实重组蛋白在大肠杆菌中的表达.结论 重组质粒HSV2-gG-pGEX-4T-1的成功构建及表达,为制备HSV-2血清诊断试剂奠定了基础.     

IL-21编码基因的克隆及其在大肠杆菌中表达

①目的 利用基因工程技术从人偏桃体细胞CDNA中克隆出白细胞介素21（IL-21）的编码基因，并在大肠杆菌中进行表达。②方法 以人扁桃体细胞经PHA刺激的CDNA文库为模板，经PCR获得IL-21的全基因片段。测序确认后，分别设计含BamH I和SalI酶切位点的引物，经PCR获得IL-121成熟肽的编码基因。将此IL-21基因插入表达载体PGEX4T-2，重组克隆经酶切与测序确认后转化大肠杆菌DH5α进行IPTG诱导表达。③结果 琼脂糖凝胶电泳显示重组质粒的PCR和双酶切产物与理论值的大小相等。SDS-PAGE显示经IPTG诱导后的大肠杆菌DH5α亦表达一与理论相符的条带。目的蛋白约占总菌体蛋白的10%。④结论 成功地构建了IL-21编码基因克隆载体并获得的大肠杆菌中的成功表达。     

睫状神经营养因子cDNA的克隆、表达、纯化及生物活性测定

目的 :利用基因工程技术获得有较高生物学活性的睫状神经营养因子 (CNTF)蛋白。方法 :应用反转录 PCR技术直接扩增出人 CNTF c DNA,克隆入 p UC19载体中 ,用双脱氧法进行手工序列分析 ,构建表达菌株 p BV2 2 0 - CNTF/ DH5α。表达的蛋白质得到纯化 ,用鸡胚背根节无血清培养法检测表达蛋白生物学活性。结果 :所克隆的 CNTF基因序列与文献报道完全一致 ,p BV2 2 0 - CNTF/ DH5α能特异表达分子量大约为 2 6 0 0 0的蛋白质 ,表达量约为菌体总蛋白量的 35 %。 CNTF蛋白质经纯化后纯度约 95 % ,而且表达蛋白有很高的生物学活性。结论 :该研究结果为 CNTF的结构和功能的研究及临床应用打下基础     

人高迁移率族蛋白1基因的克隆和表达

目的：克隆人高迁移率族蛋白1(HMG—1)编码基因，构建重组表达载体并对其诱导表达．方法：通过RT—PCR方法扩增出人外周血单个核细胞中HMG—1的编码基因，克隆于载体pGEM—T easy，测序分析后亚克隆于表达载体pGEx—4T—2，测序证实序列正确后转化大肠杆菌DH5α，经IPTG诱导4h后可表达M，约56000的融合蛋白GST—HMGl．结果：克隆了人HMG—1的编码基因，构建了融合蛋白的重组表达质粒pGEx—HMGl，表达的融合蛋白产物经凝胶薄层扫描检测，占全菌总蛋白的0．23．结论：获得了人HMG—1编码基因及其原核表达产物，对研究人HMG—1的生物学功能及其mAb的制备具有重要意义．