微载体cytodex 3大量扩增成人骨髓间充质干细胞的初步研究

目的建立一种体外分离、大量扩增培养成人骨髓间充质干细胞(hMSCs)的方法.方法用Percoll梯度离心结合贴壁法分离hMSCs,用微载体cytodex 3培养hMSCs,以普通单层聚苯乙烯(TCPS)培养作对照,用流式细胞仪(FCM)和MTT法对其细胞表型和增殖活性检测.结果①梯度离心结合早期换液是分离hMSCs的较好方法,FCM检测表明hMSCs表面表达CD29、CD44和CD105,而不表达CD14、CD34、CD45、VLA-1和HLA-DR.hMSCs细胞周期分布显示:G 0/G 1期(86.4±3.8)%,S+G 2+M期(13.6±4.2)%;②hMSCs与cytodex 3有良好的相容性, MTT法表明hMSCs在cytodex 3表面悬浮生长时具有比普通单层TCPS培养时更高的数量和增殖活性,FCM分析表明两者的细胞表型和细胞周期分布相同,无显著性差异(P>0.05).结论微载体cytodex 3培养方法是扩增组织工程种子细胞hMSCs的有效方法.     

微载体cytodex 3大量扩增成人骨髓间充质干细胞的初步研究

目的建立一种体外分离、大量扩增培养成人骨髓间充质干细胞(hMSCs)的方法。方法用Percoll梯度离心结合贴壁法分离hMSCs,用微载体cytodex 3培养hMSCs,以普通单层聚苯乙烯(TCPS)培养作对照,用流式细胞仪(FCM)和MTT法对其细胞表型和增殖活性检测。结果①梯度离心结合早期换液是分离hMSCs的较好方法,FCM检测表明hMSCs表面表达CD29、CD44和CD105,而不表达CD14、CD34、CD45、VLA-1和HLA-DR。hMSCs细胞周期分布显示:G0/G1期(86.4±3.8)%,S G2 M期(13.6±4.2)%;②hMSCs与cytodex 3有良好的相容性,MTT法表明hMSCs在cytodex 3表面悬浮生长时具有比普通单层TCPS培养时更高的数量和增殖活性,FCM分析表明两者的细胞表型和细胞周期分布相同,无显著性差异(P>0.05)。结论微载体cytodex 3培养方法是扩增组织工程种子细胞hMSCs的有效方法。     

人骨髓间充质干细胞成骨诱导的研究进展

<正>干细胞是一类具有自我复制能力的多潜能细胞,在一定条件下可分化为多种功能细胞,根据发育阶段不同分为胚胎干细胞和成体干细胞。骨髓间充质干细胞(Bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSCs)是骨髓基质系统中的一类多能干细胞,具有向中胚层和神经外胚层来源组织细胞分化的能力。BMSCs获取简便,分离培养较容易,移植排斥反应较弱,植入反应较为理想。哺乳动物来源的BMSCs是具有多向分化潜能的成体干细胞,相关研究证实其有强烈的成骨潜     

人骨髓间充质干细胞体外诱导培养成骨的实验研究

目的 观察人骨髓间充质干细胞的生长特点及诱导条件下的成骨能力。方法 抽取人骨髓组织，梯度离心后，保留贴壁细胞传代，稳定传代后改用含地塞米松、β—甘油磷酸钠和维生素C的诱导培养液，通过倒置显微镜观察、碱性磷酸酶染色、骨钙素免疫组化染色等方法进行观测。结果 原代人骨髓间充质干细胞10～12d左右即可长满，并可稳定传代，传代细胞5～6d即可传代，在诱导培养液中2周形成多层结构，并聚集成细胞钙化结节。诱导培养细胞碱性磷酸酶染色，骨钙素免疫组化染色阳性。结论 人骨髓间充质干细胞经合理的体外诱导培养后，符合成骨细胞的形态特征和生物学特性，可为体外构建组织工程化骨提供自体种子细胞。     

树鼩骨髓间充质干细胞体外分离培养及成脂成骨诱导

目的探讨树鼩骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)的体外分离、传代及定向诱导为脂肪细和成骨细胞的可行性。方法通过密度梯度离心联合贴壁培养法对树鼩骨髓间充质干细胞进行体外分离、扩增、纯化,倒置相差显微镜进行形态学观察。用成脂诱导液(DMEM/F12+10%FBS+100 U/mL青霉素+100μg/mL链霉素+1.0μmol/L地塞米松+0.2 mmol/L吲哚美辛+0.01 mg/mL胰岛素+0.5 mmol/L IBMX)和成骨诱导液(高糖DMEM+10%FBS+100 U/mL青霉素+100μg/mL链霉素+50 ng/mL BMP-2)对分离的树鼩BM-MSCs分别定向诱导为脂肪细胞和成骨细胞。结果原代和传代细胞为梭形或三角形,可增殖形成克隆。BM-MSCs成脂诱导后油红O染色细胞内出现红色脂滴,成骨诱导后茜素红染色可观察到矿化结节。结论密度梯度离心联合贴壁培养法分离培养树鼩BM-MSCs简便可行,获得的BM-MSCs可体外诱导分化为脂肪细胞和成骨细胞。     

人骨髓间充质干细胞体外培养及鉴定

目的：体外分离、培养、鉴定人骨髓间充质干细胞（hBMSC）。方法：利用密度梯度离心法分离出人骨髓单个核细胞（MNC），通过贴壁筛选法建立hBMSC的体外培养体系，并通过一系列检测方法对所培养的细胞进行鉴定。结果：细胞主要呈“成纤维样”，但体积较大、形状不规则、细胞质突起多，细胞核大而疏松，核仁明显。流式细胞仪检测：CD34阳性率为2．09％、CD29阳性率为94．46％；CD54及CD105表达阳性。细胞周期及透射电镜检测提示细胞处于相对原始状态。免疫细胞化学染色显示：CD14、CD45、胶原蛋白Ⅱ呈阴性；CD106、CD166、纤维连接蛋白、波形蛋白及胶原纤维酸性蛋白呈阳性。细胞化学染色：糖原染色呈强阳性；碱性磷酸酶染色呈阴性。通过诱导分化培养可诱导出成骨细胞。结论：成功建立了稳定的hBMSC体外培养体系，按照此培养体系进行培养可获得hBMSC。hBMSC可传代培养，但在培养过程中细胞逐渐出现老化现象，且不能冻存。     

人骨髓间充质干细胞对脐血干细胞体外扩增支持作用的研究

目的：探讨以人骨髓间充质干细胞(bone nlarrow-mesenchymal stem cells，BM-MSC)为基质的无血清培养方法，体外扩增脐血造血干细胞(cord blood stem cells，CBSC)，研究BM—MSC支持造血的功能，以能最终用于临床。方法：用含血小板生成素(TPO)、干细胞因子(SCF)、fit3／flk2配体(FL)和粒细胞-集落刺激因子(G—CSF)的无血清培养液，比较有或无MSC条件下，体外扩增脐血CD34^ 细胞两周后检测总细胞TC、CD34^ 细胞、集落形成单位(CFU)和长期培养-起始细胞(LTC—IC)增加倍数。结果：在TPO、FL、SCF、和G-CSF的作用下，经两周体外扩增后有MSC组的TC、CD34^ 细胞、CFU—GM、CFU—C和LTC—IC数较起始分别增加了427、39、125、104和16倍。单纯用上述4种细胞因子的无MSC组，TC、CD34^ 细胞、CFU—GM、CFU—C数分别增加了62、11、25、24倍，但LTC-IC只有扩增前的0．8倍。结论：以人BM—MSC为基质的无血清体外培养体系可以更有效扩增CBSC，有潜在的临床应用价值。     

人骨髓间充质干细胞的分离培养及表型分析

目的体外分离培养人骨髓间充质干细胞(MSCs)并研究其生物学特性,为进一步实验研究打下基础.方法通过密度梯度离心法及贴壁培养分离纯化人骨髓中的单个核细胞、体外培养传代、倒置相差显微镜观察细胞生长情况、瑞氏染色及透射电镜观察细胞形态及结构、绘制生长曲线、流式细胞仪检测细胞表面标记及增殖周期、免疫细胞化学及细胞化学染色对分离培养细胞进行鉴定.结果原代和传代培养的细胞以成纤维样为主,有较强的生长增殖能力;流式细胞仪检测细胞表面标记:CD29、CD105阳性,CD34阴性;细胞周期分析:90%以上的细胞处于G0/G1期;细胞CD106、纤维连接蛋白表达阳性,CD45、CD14及层连蛋白、胶原蛋白Ⅱ表达阴性,细胞糖原(PAS)染色强阳性,细胞碱性磷酸酶(ALP)染色阴性.表明细胞不是造血细胞且未向成纤维细胞、成骨细胞、软骨细胞分化,而是处于未分化阶段的间充质干细胞.结论通过密度梯度离心法及贴壁传代培养可以分离纯化MSCs以满足下一步实验研究,该细胞具有特殊的生物学特性.     

微RNA调控骨髓间充质干细胞成骨分化的研究进展

目前,对于大面积骨坏死及骨代谢疾病临床仍没有合适的治疗方法。治疗这些疾病的关键在于如何促进成骨分化,而微RNA(miRNA)作为真核细胞内的特异性调节因子,参与了大量基因的编码,在转录、翻译过程中发挥重要作用,其通过对多种信号通路的调节,促进间充质干细胞的成骨分化和骨再生。同时,miRNA的异常表达也是导致骨质疏松、骨性关节炎等骨代谢疾病的重要因素。由于miRNA数量较多,故其在调节骨代谢过程的作用机制仍不明确,未来需进一步研究,以为骨代谢疾病的特定治疗提供理论依据。     

人骨髓间充质干细胞的分离培养及其生物学特性的研究

目的研究人骨髓间充质干细胞(MSCs)的分离和培养条件,并探讨其生物学特性。方法取无恶性血液病的32~65岁的成人骨髓7例,经密度梯度离心得到单个核细胞,加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液,将细胞的密度调整到1×106个/mL,接种到12孔培养板中(1 mL/孔)进行培养,48 h后更换新鲜培养液,以后每3 d换液1次。当细胞铺满培养板底90%以上时,按常规方法进行细胞传代培养。用流式细胞术检测培养细胞的CD29、CD44、CD166、CD105、CD34、CD45、HLA-DR表达情况。并且使用脂肪细胞诱导培养液诱导培养MSCs,油红O染色检测其能否被诱导分化为脂肪细胞。结果成人骨髓接种后24 h内细胞开始聚集成细胞集落,并从集落中长出少许长梭形细胞,6~15 d细胞进入快速增殖期,一般培养20~25 d后细胞汇合成片铺满培养板底;而传代培养的细胞每代约需10~15 d即可铺满瓶底。流式细胞术检测结果显示,此次培养的骨髓来源细胞高表达CD29、CD44、CD166、CD105,不表达CD34、CD45、HLA-DR,符合骨髓MSCs细胞的特性。油红O染色显示MSCs可以被诱导分化为脂肪细胞。结论用密度为1.077 g/mL淋巴细胞分离液作为分离液,密度梯度离心法分离培养的人骨髓MSCs增殖力强,操作简单,是一种较好的分离和培养MSCs的方法。MSCs可以被诱导分化为脂肪细胞。     

蜕皮甾酮对人脐带间充质干细胞增殖的影响

摘要：目的研究不同剂量蜕皮甾酮（EDS）对人脐带间充质干细胞体外增殖的影响。方法分离培养并鉴定人脐带间充质
干细胞(hUCMSCs)。取第3代hUCMSCs分别在基础培养基(低糖DMEM培养基、10%的胎牛血清、100 U/m青/链霉素、4
mmol/L L-谷氨酰胺)中加入不同浓度（0、25、50、100、150、200 μg/ml）EDS予以干预,分别于第1、3、5、7天行MTT法检测细
胞增殖活性;另外,设置相同分组EDS干预培养hUCMSCs7 天,绘制细胞生长曲线。结果第3 代细胞阳性表达CD29、
CD105,阴性表达CD34、CD45。MTT法检测结果显示经EDS干预培养的hUCMSCs增殖能力较空白对照组有明显差异
(P<0.05),其中EDS 100、150及200 μg/ml三组细胞活性比较无显著差异(P>0.05),较其他实验组有统计学意义(P<0.05)。
细胞生长曲线同样显示EDS实验组可有效促进间充质干细胞的增殖。结论一定浓度范围内EDS对hUCMSCs具有促增
殖作用,该作用在EDS浓度为100 μg/ml时较为显著,不随浓度的增加而增强。这有望成为促进脐带间充质干细胞增殖的
新方法。     

人骨髓间充质干细胞体外增殖及成骨分化的增龄变化

目的观测年龄对人骨髓间充质干细胞(human mesenchymal stem cells,hMSCs)体外增殖、成骨分化的影响.方法使用密度梯度离心法分离不同年龄人骨髓MSCs进行培养,保留贴壁细胞传代,观察细胞生长情况,检测其增殖活性、细胞周期、碱性磷酸酶活性.结果低龄hMSCs较高龄hMSCs体外生长快、增殖期比例大、MTT及碱性磷酸酶活性高.结论hMSCs的增殖和成骨分化的能力和活性随着年龄的增加而降低,建立其参数可满足组织工程种子细胞在临床应用中不同患者的要求.     

人骨髓间质干细胞体外培养诱导成为心肌样细胞的实验研究

目的 研究人骨髓间质干细胞的体外培养及向心肌样细胞转化的条件。方法 取成人髂骨骨髓，分离出骨髓间质干细胞进行培养、传代。观察在培养液中添加诱导剂5-氮胞苷(5-aza)条件下骨髓间质干细胞的生长和分化。结果 成人骨髓间质干细胞贴壁呈集落生长，有成纤维细胞样外观。5-aza诱导人骨髓间质干细胞转化为心肌样细胞。结论 人骨髓间质干细胞能够在体外被诱导分化为心肌样细胞，是心肌组织工程良好的细胞来源。     

人间充质干细胞体外成骨诱导培养及其生物学特性变化

目的　确定人间充质干细胞 (MSCS)体外扩增培养、向成骨细胞表型转化的方法 ,了解其生物学特性变化。方法　分离人骨髓细胞 ,按不同种植密度、首次换液时间进行原代培养 ,对传代培养细胞用化学药物或生长因子进行成骨诱导培养 ,并检测成骨细胞表型、生长曲线、贴壁率。结果　人MSCS 原代培养种植细胞密度为 1× 10 5～ 3× 10 5/cm2 ,48h后半量换液 ,以后每 3d全量换液的方法较合理。经化学药物 (如地塞米松、β 甘油磷酸、维生素C)或生长因子 (rh BMP2 、BMPS)作用后 ,MSCS 表达碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原和骨钙素 ,细胞增殖速度减慢 ,贴壁率略降低。未诱导MSCS 形成细胞团后 ,可自动分化表达碱性磷酸酶活性。结论　合理的人MSCS 培养方法及可靠的诱导条件 ,可为体外构建组织工程化骨提供自体种子细胞。     

人早期胚胎间充质干细胞的定位和体外初步分离培养

目的:从早期入胚分离培养人早期胚胎间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC),并初步鉴定其生物学特性.方法:取4～6周胚龄的人胚,用免疫组织化学法,结合特定抗体SH-2,对MSC在人胚中的分布进行定位,分离组织进行培养.免疫组化和流式细胞术检测MSC的相对特异性抗原SH-2、CD44、OCT-4、S-100、CD34、α-smooth-actin在分离培养细胞中的表达.结果:在胚胎的四肢、躯体部紧邻神经管的下方(不包括原肠等内脏部位)有大量的MSC分布.分离培养可得到成纤维状的MSC,贴壁生长,有生长优势,可多次传代并保持MSC生物学特性不变.结论:通过机械分离和胰酶消化的方法,可从早期人胚得到MSC.利用MSC的贴壁生长特性及生长优势,经4～5次传代后可得到纯度很高的MSC.     

成人骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的体外研究

目的 探索成人骨髓间充质干细胞在体外定向分化为神经元样细胞的条件。方法 采用Ficoll-paque(1．077g／m1)分离液密度梯度离心从人的骨髓分离出骨髓间充质干细胞，体外扩增到第10代，选择4组不同组合的神经分化诱导条件，分别诱导骨髓间充质干细胞向神经元细胞分化，通过免疫细胞化学鉴定诱导后细胞神经元烯醇化酶、神经丝蛋白、胶质纤维酸性蛋白的表达情况。结果各组诱导剂诱导后，骨髓间充质干细胞分化为具有典型的神经元形态的细胞，免疫细胞化学显示、NF-M呈强阳性反应，NSE表达强度提高，在最佳的分化条件下，即加入bFGF、ATRA、BME、BHA、DMSO诱导条件下，大约80％细胞表达NF—M，86％的细胞为NSE强阳性。结论 成人MSCs在体外可定向诱导分化为神经元样细胞，且具有较高的阳性分化率。     

体外诱导胎盘来源间充质干细胞分化为神经元样细胞的实验研究

目的:探索体外诱导胎盘间充质干细胞(PMSCs)分化为神经元样细胞的方法。方法:消化胎盘组织,贴壁培养细胞,观测形态并用流式细胞仪检测其细胞表面标志;用含叔丁对甲氧酚(BHA)、二甲基亚砜(DMSO)及碱性成纤维细胞因子(b-FGF)的条件培养基培养细胞,诱导分化为神经元样细胞,采用免疫细胞化学的方法对分化的细胞进行鉴定。结果:胎盘组织的贴壁细胞与骨髓间充质干细胞(BMSCs)有相似形态和细胞表面标志,诱导后细胞表达神经元和星形胶质细胞标志神经元特异性的烯醇化酶(NSE)、和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)。结论:胎盘组织中存在能分化为神经元样细胞的间充质干细胞。     

人骨髓间充质干细胞体外培养及生物学特性观察

目的：观察体外培养的人骨髓间充质干细胞(MSCs)部分生物学特性。方法：自健康人骨髓中分离出MSCs,进行原代培养,第5d首次更换培养液,以去除未贴壁细胞,以后每周换液2次,细胞铺满整个培养瓶底90％时开始传代培养。倒置相差显微镜下观察原代及传代细胞形态及生长特性,并绘制传代细胞的生长曲线。流式细胞仪检测第3代MSCs细胞表面分子CD29、CD44,以进行MSCs鉴定。结果：MSCs体外培养为贴壁生长。MSCs原代培养约18～21d才达传代要求;传代培养细胞生长潜伏期仅24～36h,对数增长期约3～5d,之后为平台期,4～6d传1代。传至第8代,出现凋亡征象。第3代MSCs细胞表面CD29、CD44的表达率分别为90．6％和91．5％,MSCs均一性较高。结论：从人骨髓中分离出的MSCs在体外环境中具有很强的自我更新和分裂增殖能力。     

EMILIN3基因促进人骨髓间充质干细胞增殖及向软骨细胞分化

目的 探讨EMILIN3基因对人骨髓间充质干细胞(human marrow mesenchymal stem cells,hMSCs)增殖及向软骨细胞分化的影响.方法 构建EMILIN3腺病毒表达载体,细胞分成hMSCs、hMSCs+对照腺病毒、hMSCs+ EMILIN3腺病毒3组,MTT法检测细胞的增殖情况,Real-time PCR法检测上述细胞向软骨细胞诱导后CollagenⅡ、Aggrecan、SOX9mRNA的表达.结果 hMSCs+EMILIN3腺病毒组细胞增殖能力明显快于hMSCs+对照腺病毒组和hMSCs组(P＜0.05),hMSCs+对照腺病毒组与hMSCs组增殖能力相比有所降低,但差异无统计学意义(P＞0.05).hMSCs+ EMILIN3 腺病毒组细胞中CollagenⅡ、Aggrecan、SOX9 mRNA的相对表达量与hMSCs+对照腺病毒组、hMSCs组相比明显增加(P＜0.05,P＜0.01).hMSCs+对照病毒组与hMSCs组相比有所增加,但没有明显的趋势(P＞0.05).结论 EMILIN3促进hMSCs增殖,并且可以增加hMSCs向软骨细胞诱导分化.