几种外用中药成份对离体人脐静脉内皮细胞增殖的影响

目的:体外观察几种常用外用中药有关成分对血管内皮细胞增殖作用的影响,初步探讨其对创伤愈合的可能作用。方法:采用MTT比色法观察中药人参皂苷Rg1、Rh1、黄芪多糖、鹿茸多肽、川芎嗪、麝香酮、桂皮醛和乳香水提物对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖的影响。结果:9.75mg/L-2.5g/L的黄芪多糖对HUVEC未表现出增殖促进作用;1.94mg/L-0.5g/L的人参皂苷Rh1促进HUVEC的增殖(P＜0.05或P＜0.01),31mg/L的人参皂苷Rg1抑制细胞增殖(P＜0.05);1mg/L-0.5g/L的鹿茸多肽明显促进HUVEC的增殖,以10mg/L作用最明显(P＜0.01),桂皮醛2g/L时促进HUVEC的增殖(P＜0.05);1g/L的麝香酮明显抑制HUVEC的增殖(P＜0.01);0.5kg/L-2.5kg/L(生药)乳香水提物明显抑制HUVEC的增殖(P＜0.01),抑制增殖率为35.56%-55.56%。川芎嗪0.125g/L-0.5g/L明显抑制HUVEC的增殖(P＜0.01)。结论:益气温阳药物人参(Rh1)、鹿茸(鹿茸多肽)、肉桂(桂皮醛)促进HUVEC增殖;通络活血药物麝香(麝香酮)、乳香(乳香水提物)、川芎(川芎嗪)抑制HUVEC增殖。     

藏红花素对人脐静脉内皮细胞增殖及细胞外调节蛋白激酶信号通路的影响

目的观察藏红花素(crocin)对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)体外增殖、细胞外调节蛋白激酶(ERK)1/2表达及活性的影响。方法用藏红花素及MAPK/ERK激酶(MEK)抑制剂PD98059分别处理HUVECs,Ed U细胞增殖法检测细胞体外增殖活力,Western blotting法检测crocin对磷酸化细胞外调节蛋白激酶1/2(ERK1/2)和总ERK1/2表达的影响,激光扫描共焦显微镜检测细胞内Ca~(2+)浓度。结果在1μmol/L和10μmol/L浓度水平,藏红花素可明显促进细胞的增殖能力,提高磷酸化ERK1/2和总ERK1/2蛋白的表达水平,并增加细胞内Ca~(2+)浓度;给予MEK抑制剂PD98059后,细胞的增殖能力下降,磷酸化ERK1/2和总ERK1/2的表达减弱,细胞内Ca~(2+)浓度降低。结论藏红花素通过活化ERK1/2信号途径,提高细胞内Ca~(2+)浓度,促进人脐静脉内皮细胞的体外增殖能力。     

重组人促红细胞生成素对体外培养内皮细胞增殖的影响

目的:研究重组人促红细胞生成素(rhEPO)对体外培养内皮细胞增殖的影响.方法:从脐静脉体外分离培养人脐静脉内皮细胞(HUVEC),采用形态学观察及Ⅷ因子相关抗原(Ⅷ-R Ag)检测进行内皮细胞鉴定,免疫组织化学方法检测rhEPO对HUVEC增殖细胞核抗原(PCNA)与细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)的表达变化.结果:rhEPO实验组内皮细胞PCNA与Cyclin D1表达均明显高于对照组.当rhEPO剂量提高到20U/ml时其作用最强.结论:rhEPO对内皮细胞增殖有明显促进作用,这种促进作用町能是其影响血管生成的主要原因之一.     

皮秒脉冲电场抑制人脐静脉内皮细胞增殖和迁移并阻滞细胞周期于G2/M期且促进其凋亡

目的研究皮秒脉冲电场(ps PEF)对体外人脐静脉内皮细胞(HUVEC)生物学行为的影响。方法固定ps PEF脉宽800 ps、频率3 Hz、脉冲处理个数2000个,将HUVEC分为对照组和(200、300、400)KV/cm场强的低、中、高剂量处理组。在ps PEF处理HUVEC后2、4、6、8、10、12、14、16 h,CCK-8法检测ps PEF对HUVEC生长的影响,采用划痕试验及TranswellTM小室法观察ps PEF对HUVEC迁移率的影响,流式细胞术检测ps PEF对HUVEC细胞周期及凋亡的作用。结果随着场强的增加,细胞死亡率上升,生长受到抑制,12 h时抑制率最为显著;ps PEF处理可明显抑制HUVEC的迁移能力;ps PEF可将HUVEC阻滞于G2/M期,同时HUVEC凋亡细胞数增多。结论 ps PEF可抑制HUVEC增殖和迁移,并阻滞细胞周期于G2/M期并促进其凋亡。     

活性氧和ERK1/2信号通路在缺氧大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖和凋亡中的作用

目的：研究缺氧状态下大鼠肺动脉平滑肌细胞（PASMCs）内活性氧（ROS）水平的变化,ROS对细胞外信号调节激酶（ERK）1/2蛋白表达的影响以及ROS和ERK1/2在PASMCs增殖和凋亡关系失衡中的作用。方法: 原代培养正常大鼠PASMCs,选用第2-3代用于实验。分别在常氧及缺氧条件下用ROS清除剂tiron、ERK1/2抑制剂PD98059进行分组干预。通过NBT还原法和DCFH-DA荧光探针检测细胞内ROS,免疫荧光法检测磷酸化- ERK1/2（p-ERK1/2）蛋白表达,MTT比色法和增殖细胞核抗原（PCNA）蛋白的免疫细胞化学法检测细胞增殖,原位末端标记法（TUNEL）检测细胞凋亡。结果: (1)缺氧组细胞内ROS水平明显高于对照组（P<0.01）;(2)缺氧组的增殖活性与对照组相比显著增高（P<0.01）,而凋亡率显著降低（P<0.01）,使用tiron后能明显抑制缺氧诱导的细胞增殖（P<0.05）,而凋亡率却明显升高（P<0.01）;(3)缺氧组p-ERK1/2蛋白表达显著高于对照组（P<0.01）,使用tiron后缺氧诱导的p-ERK1/2表达被显著抑制（P<0.01）;(4)使用PD98059也能明显抑制缺氧诱导的细胞增殖（P<0.05）,而凋亡率也明显升高（P<0.01）,缺氧下同时使用PD98059和tiron与单用tiron相比,对细胞增殖和凋亡的影响均无明显差异（P>0.05）。结论: 缺氧时PASMCs中生成增多的ROS通过活化下游ERK1/2信号通路,促进PASMCs增殖并抑制凋亡,从而在缺氧性肺动脉重建过程中发挥重要作用。     

小檗碱抗肿瘤新生血管形成作用机制的研究

目的：研究小檗碱对bFGF活化人脐静脉内皮细胞（HUVEC）增殖、细胞周期及细胞凋亡的影响，探讨其对肿瘤新生血管形成作用的机制。方法：MTT法检测小檗碱对bFGF活化HUVEC的增殖作用；流式细胞仪检测用药后细胞周期的变化；激光共聚焦扫描显微镜下观察药物对细胞形态、细胞内钙的影响；流式细胞仪检测小檗碱对细胞凋亡的作用。结果：小檗碱能明显抑制bFGF活化的HUVEC增殖，且存在剂量依赖关系；使细胞在G0-G1期的比例明显增多；使细胞核浓缩、甚至裂解成碎块，同时使细胞内钙增多；并诱导活化HUVEC发生细胞凋亡。结论：小檗碱可能通过将bFGF活化的HUVEC细胞周期阻滞在G0-G1期，抑制活化HUVEC的增殖：诱导活化HUVEC细胞发生凋亡等机制，阻止新生血管形成，发挥其抗肿瘤作用。     

小檗碱对人脐静脉内皮细胞增殖与凋亡的作用

目的：观察小檗碱对人脐静脉内皮细胞增殖与凋亡的作用，以探讨小檗碱抑制肿瘤生长与转移的机制。 方法： 用小檗碱与体外培养的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）共同孵育，以MTT法检测细胞的增殖活性，免疫细胞化学法检测增殖细胞核抗原（PCNA）的表达，荧光染色法观察凋亡细胞核形态，用Rhodamine123染色，激光共聚焦显微镜检测线粒体膜电位。 结果： 不同浓度小檗碱与HUVEC共同孵育可明显抑制HUVEC的增殖(P<0.05，P<0.01)，呈现一定的浓度依赖性和时效性；20 mg/L小檗碱与HUVEC共同孵育48 h，可显著降低细胞核PCNA的表达（P<0.01），并可见凋亡细胞数增多、线粒体膜电位明显降低（P<0.01）。 结论： 小檗碱抑制血管内皮细胞的增殖，并促进血管内皮细胞凋亡，从而抑制肿瘤血管形成，可能是小檗碱抑制肿瘤生长与转移的机制之一。     

马兜铃酸通过ERK1/2信号传导途径诱导人脐静脉血管内皮细胞凋亡

 目的 探讨马兜铃酸(AA)是否通过ERK1/2信号传导途径诱导人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)凋亡。方法 通过MTT法检测细胞增殖能力;通过Hoechst 33258荧光染色观察细胞凋亡的形态学改变;通过Annexin V-FITC/PI染色采用流式细胞仪检测细胞凋亡率;通过Western blotting法测定细胞内p-ERK1/2的水平。结果 马兜铃酸呈浓度和时间依赖方式抑制了内皮细胞增殖。马兜铃酸可引起内皮细胞出现凋亡形态学改变,且呈浓度依赖方式增加了内皮细胞凋亡率。同时,马兜铃酸可降低内皮细胞内p-ERK1/2的水平。应用ERK1/2抑制剂PD98095预处理后,细胞内p-ERK1/2的水平与AA (10 mg/L)组相比显著增加,马兜铃酸诱导的内皮细胞凋亡率亦被明显抑制。结论 马兜铃酸可诱导血管内皮细胞凋亡,其机制可能是通过抑制ERK1/2信号传导途径。     

腺病毒介导的shRNA下调PTEN表达对体外活化肝星状细胞增殖与凋亡的影响

目的:探讨腺病毒介导的shRNA下调第10号染色体缺失的磷酸酶和张力蛋白同源物基因(PTEN)表达对体外培养的大鼠活化肝星状细胞(HSCs)增殖和凋亡的影响及其信号转导机制。方法:体外培养活化HSCs,以腺病毒为载体将靶向PTEN的shRNA干扰重组体转染至体外活化的大鼠HSCs;四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测HSCs增殖;末端转移酶标记技术(TUNEL)及流式细胞术测定HSCs凋亡;Western blotting方法检测PTEN、Bax、Bcl-2、Akt、p-Akt、ERK1/2及p-ERK1/2蛋白表达情况;实时荧光定量PCR方法检测PTEN、Akt及ERK1 mRNA表达情况。结果:(1)靶向PTEN的RNA干扰重组腺病毒成功感染体外活化HSCs,并在一定范围内呈时间依赖性地促进HSCs增殖,腺病毒感染HSCs后72 h,HSCs凋亡率显著下降(P<0.05);(2)Bax表达降低,Bcl-2表达增加(P<0.05);(3)p-Akt和p-ERK1/2蛋白表达显著增加(P<0.05);而Akt蛋白及其mRNA、ERK1蛋白及其mRNA表达均无显著改变(P>0.05)。结论:RNA干扰下调PTEN基因表达可能通过Bcl-2/Bax途径促进体外活化HSCs增殖并抑制其凋亡,此外,RNA干扰下调PTEN基因表达促进p-Akt和p-ERK1/2表达增多,提示PTEN可能通过影响PI3K/Akt和ERK1/2信号通路而在调控HSCs增殖和凋亡中发挥重要作用。     

茯苓酸通过激活Nrf2 / HO-1 信号通路改善OX-LDL 诱导的人脐静脉 内皮细胞损伤

目的:研究茯苓酸(PA)对氧化低密度脂蛋白(OX-LDL)诱导的人脐静脉内皮细胞氧化应激损伤的影响及其作用的信号通路。方法:预先使用不同浓度的茯苓酸预处理人脐静脉内皮细胞(HUVEC)12 h,再加入OX-LDL刺激HUVEC 24 h,采用CCK-8法检测HUVEC细胞活力,流式细胞术检测细胞凋亡情况,化学荧光法检测活性氧(ROS)水平,采用WST-1法检测超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)含量,采用蛋白免疫印迹法检测Nrf2蛋白、HO-1蛋白以及凋亡相关蛋白(Bcl-2、Bax、Caspase-3)的表达水平。使用RT-PCR法检测内皮细胞在各种处理条件下Nrf2/HO-1的mRNA表达情况。结果:与对照组相比,OX-LDL作用于HUVEC后,能够明显降低细胞活力,增加细胞凋亡率及促凋亡相关蛋白的表达,并使细胞内ROS产生增多,促氧化物(MDA)表达增加,抗氧化物(SOD)活性降低。而茯苓酸预处理后,能显著改善OX-LDL对内皮细胞活力及凋亡的影响,减轻氧化应激损伤。蛋白免疫印迹法及RT-PCR结果显示相比于OX-LDL组,PA预处理后通路蛋白Nrf2/HO-1表达增加,并且细胞内Nrf2/HO-1的mRNA表达水平上调,而使用HO-1特异性抑制剂锌原卟啉(Znpp)后能消除这一作用。结论:茯苓酸(PA)可通过激活Nrf2/HO-1信号通路,减轻OX-LDL诱导的内皮细胞氧化应激损伤。     

静脉表型分子COUP-TFⅡ表达降低对血管内皮细胞衰老的影响

目的:观察静脉表型分子鸡卵清蛋白上游启动子转录因子Ⅱ(COUP-TFⅡ)表达对血管内皮细胞衰老的影响和分子机制。方法:通过RT-qPCR检测比较人冠状动脉内皮细胞(HCAEC)和人脐静脉内皮细胞(HUVEC)中COUP-TFⅡ的表达情况。使用10~(-5)mol/L血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导HUVEC衰老,通过COUP-TFⅡ特异性小干扰RNA(siCOUP-TFⅡ)转染HUVEC使其COUP-TFⅡ的表达降低,利用β-半乳糖苷酶染色、Western blot、CCK-8、细胞计数等方法分别观察siCOUP-TFⅡ对AngⅡ诱导的血管内皮细胞衰老及增殖的影响,通过Western blot检测Akt信号分子的表达变化。结果:与HCAEC相比,HUVEC中COUP-TFⅡ呈显著高表达;用siCOUP-TFⅡ抑制HUVEC的COUP-TFⅡ表达时,能显著促进AngⅡ诱导的内皮细胞衰老并抑制内皮细胞增殖和p-Akt蛋白水平;加入Akt激动剂SC79(4 mg/L)能够部分逆转siCOUP-TFⅡ对AngⅡ诱导的HUVEC衰老和增殖的影响。结论:COUP-TFⅡ表达降低可促进血管内皮细胞衰老并抑制内皮细胞增殖,其机制可能与调节Akt信号有关。     

Interleukin-1 production and cell-activation response to cytomegalovirus infection of vascular endothelial cells

Summary Human cytomegalovirus (HCMV) is a source of major complications in immunosuppressed individuals, and endothelial involvement in HCMV infection is well documented. Traditionally laboratory strains of HCMV have been used in experimental investigations in vitro; however the continuous propagation of these strains in fibroblasts have attenuated the virus making it unsuitable for infecting other cell systems such as endothelial cells. In this study a recent clinical isolate of HCMV was propagated through several passages in endothelial cells and was used to investigate the effect of HCMV infection of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) on IL-1 production and cell proliferation. Infection of HUVEC with the clinical isolate of HCMV (at multiplicity of infection 5:1) suppressed the production of IL-1 alpha (82%) and IL-1 beta (99%) at 5h post infection; the levels returned to that of the control within 24h post infection. Ultraviolet inactivated (but not heat killed) virus produced similar suppression confirming that a thermolabile viral structural protein or intact virion were responsible for this suppression. Infection of HUVEC with the clinical isolate increased the number of these cells and the rate of their proliferation. An increase of infected HUVEC number under quiescent growth conditions continued as the infection progressed (6–10 days post infection), exhibiting, at 3 days post infection, 5 times the number of uninfected HUVEC (control) which did not tolerate the quiescent culture conditions for more than 4 days. Live virus is responsible for this increase because UV-inactivated virus did not maintain the proliferation of HUVEC. These studies suggest that while infection of HUVEC with a recent clinical isolate of HCMV suppressed the production of IL-1 at early hours after infection, it increased the proliferation of these cells at later stages of infection.     

不同浓度哇巴因对人血管内皮细胞的作用

目的：研究不同浓度哇巴因对血管内皮细胞(HUVEC)的作用及生理浓度哇巴因激活的血管内皮细胞早期反应基因。方法： MTT法观察哇巴因对血管内皮细胞增殖的影响，台盼蓝染色及乳酸脱氢酶活性测定细胞活力。免疫组织化学染色法测定细胞核增殖抗原（PCNA）表达情况。以包含8 464条人类基因的DNA芯片检测血管内皮细胞受生理浓度哇巴因活化后的基因表达谱，并从中筛选出早期反应基因。 结果： 生理浓度（0.3-0.9 nmol/L）的哇巴因能刺激细胞增殖，且这种增殖不与剂量呈正相关，刺激增殖的最适浓度为0.3 nmol/L，最大效应作用时间为1-2 h。0.9-1.8 nmol/L的哇巴因抑制内皮细胞的增殖，引起细胞水肿和凋亡。但10 nmol/L的高浓度哇巴因却能够引起细胞的增殖。血管内皮细胞受哇巴因作用2 h后，基因表达谱研究显示340条基因出现表达差异，其中上调的共有145 条，多数与细胞代谢和转录调控相关，显著上调的6条。 结论： 哇巴因在参与维持血管内皮细胞的正常增殖及高血压引起的血管重塑中起重要作用。     

高糖对体外培养Schwann细胞生长及细胞外信号调节激酶1／2磷酸化的影响

目的:探讨高糖对体外培养Schwann细胞生长及细胞外信号调节激酶(ERK)磷酸化的影响.方法:按照培养液中葡萄糖浓度的小同,分为对照组与高糖组.用MTT法检测Schwann细胞生长情况;用ELISA法检测对照组与高糖组ERK1/2磷酸化的程度,以及加入神经源性一氧化氮合成酶(nNOS)抑制剂后ERK1/2磷酸化的程度.结果:高糖浓度下,细胞虽有增殖但幅度及时程明显低于对照组,高糖抑制Schwann细胞生长;随着精浓度的升高.ERK1/2磷酸化的程度逐渐增加,并与加入nNOS抑制剂有相似的表现.结论:高糖抑制Schwann细胞生长,并且降低nNOS的量,减弱一氧化氮(NO)对ERK1/2的抑制作用,导致ERK1/2磷酸化水平升高.     

骨髓间充质干细胞增殖与成骨分化中电磁场激活ERK通路的作用

背景：研究表明电磁场可调节骨髓间充质干细胞的增殖和分化,但其具体机制尚不清楚。 目的：从ERK信号途径探讨电磁场诱导大鼠骨髓间充质干细胞增殖与分化成骨的作用。 方法：取第3代生长良好的大鼠骨髓间充质干细胞,暴磁组给予15 Hz、1 mT的正弦波电磁场刺激,PD98059+暴磁组在电磁场刺激前给予20 μmol/L ERK阻断剂PD98059,PD98059组仅给PD98059不进行电磁场刺激,对照组正常培养。电磁场刺激后,收集各组细胞,Western blot法检测ERK通路的活性,MTT法检测细胞增殖活性,碱性磷酸酶试剂盒检测细胞碱性磷酸酶活性。 结果与结论：电磁场刺激后,细胞ERK1/2磷酸化水平、细胞的增殖活性、及碱性磷酸酶活性均明显升高(P < 0.01);PD98059可明显抑制ERK1/2磷酸化水平及细胞增殖活性的升高(P < 0.01),而在一定程度上提高细胞的碱性磷酸酶活性(P < 0.01)。说明电磁场刺激可通过激活骨髓间充质干细胞ERK信号通路,并且主要通过该途径促进骨髓间充质干细胞的增殖;而在脉冲电磁场促进骨髓间充质干细胞分化成骨的过程中,激活ERK信号通路所起的作用较小。     

Expression of leukocyte-endothelial cell adhesion molecules on monocyte adhesion to human endothelial cells on plasma treated PET and PTFE in vitro

We used a coculture model to evaluate the inflammatory potential of ammonia gas plasma modified PET and PTFE by flow cytometry and immunohistochemistry. In these studies, human endothelial cells from umbilical cord (HUVEC) and promonocytic U937 cells were used. HUVECs grown on polystyrene tissue culture coverslips and HUVECs stimulated with tumour necrosis factor (TNF-) were used as controls. U937 adhesion to endothelium on each surface was evaluated at day 1 and day 7. To further investigate the role of leukocyte–endothelial cell adhesion molecules (CAMs) in cell-to-cell interaction on material surfaces, the expression of the leukocyte–endothelial CAMs: ICAM-1, VCAM-1, PECAM-1, and E-selectin on HUVECs were evaluated after U937 cell adhesion. The results demonstrated that plasma treated PET (T-PET) and treated PTFE (T-PTFE) did not increase U937 cell adhesion compared to the negative control. Maximal adhesion of U937 cells to HUVEC was observed on TNF- stimulated endothelium with significant differences between day 1 and day 7, which is consistent with our prior observation that T-PET and T-PTFE did not cause HUVECs to increase the expression of adhesion molecules. After U937 cell adhesion, the expression of ICAM-1 and VCAM-1 of HUVECs were not different on T-PET and T-PTFE compared with the negative control. However, the expression of E-selectin was reduced on day 1, but not on day 7. The effects of plasma treated PET and PTFE on HUVEC adhesion and proliferation were also studied. On day 1 there were slight increases in the growth of HUVECs on both of T-PET and T-PTFE but this was not statistically significant. On day 7, the cell number increased significantly on the surfaces compared to the negative control. The results demonstrate that the plasma treatment of PET and PTFE with ammonia improves the adhesion and growth of endothelial cells and these surfaces do not exhibit a direct inflammatory effect in terms of monocyte adhesion and expression of leukocyte–endothelial CAMs. The monocyte adhesion to endothelial cells on surfaces can be used as a tool for the evaluation of material surface modification and further to study the mechanisms of cell-to-cell interactions in response to surfaces.     

PI3K-ERK信号在胰岛素诱导的血管平滑肌细胞增殖中的作用

目的： 探讨胰岛素促血管平滑肌细胞增殖的分子机制。方法: 原代培养的SD大鼠血管平滑肌细胞为研究对象,［3H］-TdR掺入实验观察胰岛素刺激后血管平滑肌细胞的增殖,免疫印迹分析PI3K－ERK信号在平滑肌细胞增殖中的作用。结果: 胰岛素明显促进血管平滑肌细胞增殖,该作用呈现剂量依赖性关系,PI3K抑制剂LY294002、MAPK抑制剂PD98059可抑制胰岛素的促增殖作用,［3H］-TdR掺入分别下降48.8%、43.6%,抑制PI3K可下调胰岛素刺激的磷酸化ERK1/2蛋白表达和ERK活性,分别下降112％、127％。结论: PI3K－ERK1/2信号通路参与了胰岛素促平滑肌细胞增殖过程。     

睾酮对人血管内皮细胞纤溶活性影响及机制

目的：观察睾酮对人血管内皮细胞分泌纤溶酶原激活物（tPA）、纤溶酶原激活物抑制物1（PAI-1）的影响及其机制。方法： 将体外培养的人血管内皮细胞（HUVEC）分为5个浓度睾酮组及单纯培养基对照组，MTT实验观察睾酮对细胞生长及活性影响。ELISA 法测各组tPA、 PAI-1含量。用雄激素受体拮抗剂(flutamide)预处理细胞后重复实验。结果： 生理及略低于生理剂量睾酮（3×10-10 mol/L-3×10-8 mol/L）可明显促进tPA 分泌（P＜0.01）；而大剂量则使tPA 含量明显减少（P＜0.01）。各睾酮组PAI-1含量均明显低于对照组（P＜0.05）。Flutamide 能有效消除睾酮的上述作用。结论： 生理浓度睾酮通过雄激素受体促进tPA分泌，降低PAI-1浓度而增强纤溶系统活性，有利于防止血栓性疾病的发生。