Mayven不同截短体原核表达载体的构建、表达和纯化

为了探索Mayven蛋白的功能,进一步研究多发性硬化症的发病机制,我们通过PCR扩增得到Mayven 4个不同长度的基因片段,包括片段P1(1-902 bp)、片段P2(1-523 bp)、片段P3(507-182 bp)和片段P4(887-1782 bp),将这些片段克隆至大肠杆菌表达载体pGEX-4T-2, 转化大肠杆菌BL21,并用IPTG诱导表达, 对表达产物进行SDS-PAGE及western blot方法分析,采用GST蛋白纯化系统对融合蛋白进行纯化.实验结果显示我们成功构建了4个包含不同截短体的重组融合表达质粒GST-Mayven(P1、P2、P3、P4),诱导后表达得到4个截短体的Mayven融合蛋白,其表达形式均为可溶性表达,其相对分子质量与预期相符,纯化后得到各自的目的蛋白,为后续的Mayven蛋白的功能研究奠定了基础.     

早幼粒细胞白血病基因结构域诱饵载体的构建及鉴定

目的 研究早幼粒细胞白血病基因(promyelocytic leukemia,PML)中含环指/B-BOX结构与含coiled-coil结构的两个结构域的功能,构建含其结构域序列的诱饵表达载体,为进一步应用酵母双杂交系统筛选与之相互作用的蛋白建立实验基础.方法 PCR扩增PML的两个结构域序列,克隆入诱饵载体pGBKT7中,经测序鉴定后,将诱饵载体转化到酵母细胞AH109中,检测诱饵蛋白有无毒性,渗漏和自激活作用,同时利用蛋白印迹法分析诱饵蛋白的表达.结果 成功扩增了PML两个结构域的基因片段,并正确克隆入pGBKT7中.诱饵载体成功转化到酵母细胞AH109中,其中一个诱饵蛋白BD-PML-B无毒性,但具有渗漏和自激活作用,另一个诱饵蛋白BD-PML-C无毒性,渗漏和自激活作用,蛋白印迹法分析证实酵母细胞表达诱饵蛋白.结论 含环指/B-BOX的结构域具有转录因子活性,全长PML的转录活性与之有关;成功构建了含coiled-coil结构的PML结合域的酵母诱饵表达载体,为运用酵母双杂交技术筛选与之作用的蛋白并探讨其功能奠定了基础.     

酵母双杂交系统筛选GATA-1相互作用蛋白质及功能验证

目的 利用酵母双杂交技术从人脑cDNA文库中筛选与人GATA-1相互作用的蛋白质.方法 从人K562细胞中扩增出全长GATA1基因,设计引物将其3段截断体亚克隆入酵母表达载体pDBLeu中,转化至AH109感受态酵母中,利用酵母双杂交技术筛选人脑cDNA文库中与其相互作用的蛋白质,阳性克隆通过回转及免疫共沉淀试验进行验证,利用3xGATA荧光素酶报告基因对相互作用蛋白质进行功能验证.结果 成功构建出酵母诱饵蛋白表达质粒pDBLeu-GATA1(1),pDBLeu-GATA1(2),pDBLeu-GATA1(3),筛到34个阳性克隆,用生物信息学分析及回转验证得到5个与GATA-1相互作用的候选蛋白,通过免疫共沉淀试验进一步验证,获得3个蛋白质能与GATA-1相互作用,分别是ECSIT,EFEMP1和GPS2.荧光素酶试验表明这3个蛋白质均能对GATA1的转录活性产生影响,证实它们之间的相互作用具有影响GATA1转录的功能.结论 应用酵母双杂交技术及免疫共沉淀试验,从人脑cDNA文库中成功获得3个与GATA-1相互作用并对其转录活性具有调节作用的蛋白质,为研究GATA1蛋白质的功能提供了新的线索.     

激活素受体相互作用蛋白3的基因克隆及其免疫学特性研究

目的：研究新克隆的激活素受体相互作用蛋白3（ActRIP3）的免疫学特性和其介导Ser／Thr激酶型受体胞内信号传导的作用。方法：以酵母双杂交法发现的ActRIP基因片段作为探针，从小鼠脑cDNA文库中克隆ActRIP3基因。EIA法分析其与激活素ⅡA型受体（ActRⅡA）结合能力，Westernblot杂交检测成熟蛋白在组织中的表达，免疫组化染色分析其在脑组织中的分布，采用pcDNA-AetRIP3与CAGA-1ux报告基因质粒共转染HEK293细胞分析信号传导作用。结果：克隆的ActRIP3基因全长1197bp，编码101个氨基酸残基，EIA分析显示ActRIP3与ActRⅡA具有特异性结合作用，这种作用与ActRIP3的N末端氨基酸序列有关。Westernblot杂交显示天然ActRIP3相对分子质量约为14000，在多种组织表达，免疫组化染色显示其在脑组织中的分布以海马及下丘脑为主。通过表达ActRIP3可促进激活索诱导的特异性基因转录活性。结论：ActRIP3属于ActRIP家族新成员，具有特异结合ActRⅡA的能力，并具有促进激活素信号传导的作用。     

酵母双杂交体系(Yeast Two-Hybrid System):一种研究蛋白一蛋白相互作用的强有力方法

双杂交体系是研究蛋白一蛋白相互作用的一种有效方法。将相互作用的两个蛋白分别与转录因子的DNA结合结构域和转录激活结构域融合成两个杂交体，在酵母细胞内，通过报告基因的表达情况反映两蛋白之间的相互作用。其主要特点是操作简单，可以研究蛋白间弱相互作用，通过筛库可直接得到与目的蛋白相互作用蛋白的DNA序列。用双杂交体系筛库时最值得注意的是假阳性问题。     

酵母双杂交体系一种研究蛋白—蛋白相互作用的强有力方法

双杂交体系是研究蛋白－蛋白相互作用的一种有效方法。将相互作用的两个蛋白分别与转录因子的ＤＮＡ结合结构域和转录激活结构融合成两个杂交体，在酵母细胞内，通过报告基因的表达情况反反映两蛋白之间的相互作用。其主要特点是操作简单，可以研究蛋白间弱相互作用，通用筛库可直接得到与目的蛋白相互作用蛋白的ＤＮＡ序列，用双杂交体系筛库时最值得注意的是假阳性问题。     

Ataxin-3相互作用蛋白A3IP的克隆与细胞及组织定位的初步研究

目的 根据前期筛选到的与ataxin-3蛋白羧基端相互作用的A3IP部分序列,进行A3IP基因的克隆,并探讨其细胞及组织定位情况.方法 应用生物信息学及Northern印迹方法克隆A3IP基因并检测其转录本在人体组织和人脑不同部位的表达情况；应用Western印迹及免疫荧光方法检测A3IP蛋白在细胞中的表达及定位情况；应用免疫组织化学染色方法检测A3IP蛋白在人体各组织和人脑不同部位的表达及定位情况.结果 对A3IP基因序列全长阅读框进行了cDNA克隆及序列拼接；检测了A3IP的3个转录本(1 kb、1.35 kb、6 kb)在人体不同组织和人脑不同部位的表达谱；获得了A3IP-pEGFP在COS-7细胞和人大脑皮质、小脑、肌肉、周围神经、肝脏、肾脏的表达及定位情况.结论 所克隆的A3IP基因编码ataxin-3的一种相互作用蛋白A3IP,其3个剪切本在人体多种组织和人脑不同部位广泛表达,是一种细胞胞浆蛋白.     

酵母双杂交诱饵载体pGBKT7_ppr Ⅰ的构建及自激活检测

目的 构建耐辐射球菌(Deinococcus radiodurans)R1 ppr Ⅰ蛋白的诱饵表达载体,为应用酵母双杂交系统筛选与ppr Ⅰ相互作用的蛋白建立实验基础.方法 PCR扩增ppr Ⅰ基因片段,克隆入诱饵载体pGBKT7中,经测序鉴定后,将构建好的诱饵载体pGBKT7_ppr Ⅰ转化到酵母细胞AH109中,检测诱饵蛋白有无毒性、渗漏和自激活作用.结果 成功扩增了ppr Ⅰ基因片段,并克隆入pGBKT7中,测序结果正确.诱饵载体成功转化到酵母细胞AH109中,诱饵蛋白无毒性、渗漏和自激活作用.结论 成功构建了ppr Ⅰ的酵母诱饵表达载体,为进一步运用酵母双杂交技术筛选与之相互作用的蛋白奠定了基础.     

人延伸体复合物Elp3亚基表达及功能研究

目的将人延伸体复合物(elongator)的中心亚基elp3(elongtor complexprotein3)基因导入293T细胞,观察它对293T细胞生长特性以及基因转录活性的影响。方法用脂质体将pFlAGCMV4-Elp3真核表达载体导入293T细胞,通过G418持续筛选阳性克隆,建立elp3的稳定表达细胞株。通过RT-PCR、免疫荧光法检测外源性elp3基因的表达。MTT法测定细胞生长曲线、流式细胞仪法测定细胞周期及凋亡情况。瞬时转染不同组合的质粒后,收集细胞用荧光素酶报告基因法检测转染前后荧光素酶活性的变化。结果Elp3可以抑制293T细胞生长,并使细胞出现G1期阻滞,未引起293T细胞凋亡。elp3能激活转录,但作用较弱。elp4也可激活转录,过量表达elp3基因与elp4基因时,可明显激活转录,说明两者有协同激活转录作用。Elp3与转录因子TFⅡF亚基RAP30基因过量表达时,两者也可协同激活转录。结论Elp3对293T细胞的生长有明显抑制作用,可诱导G1期细胞阻滞,具有转录激活功能,并可分别与Elp4亚基、RAP30亚基协同激活转录。     

转录因子Sp1和Sp3对食管癌细胞ezrin基因的表达调控作用

目的:明确转录因子Sp1和Sp3对食管癌细胞ezrin基因的表达调控作用.方法:将转录因子表达载体CMV-Sp1和CMV-Sp3分别转染食管癌EC109细胞,采用定量RT-PCR和Western blot技术检测过表达转录因子Sp1和Sp3对ezrin mRNA和蛋白表达的影响;将ezrin基因启动子驱动的报告基因表达载体与内参照质粒pRL-TK和转录因子表达载体共转染EC109细胞,采用双荧光素酶报告基因分析系统检测转录因子Sp1和Sp3对ezrin基因启动子的激活作用以及这种激活作用是否依赖于ezrin基因的Sp1结合位点-75/-69.结果:过表达转录因子Sp1和Sp3显著提高EC109细胞ezrin mRNA和蛋白表达水平以及启动子活性.Sp1和Sp3增强ezrin基因启动子活性的作用位点不同,只有Sp1通过-75/-69位点调控ezrin基因启动子活性.结论:转录因子Sp1和Sp3可调控EC109细胞ezrin基因的表达.     

HBV Pre S1蛋白在酵母细胞中的转录激活功能

目的 探索应用双杂交体系统克隆与乙型肝炎病毒（HBV）Pre S1蛋白结合的肝细胞受体的可行性。方法 构建编码HBV Pre S1全序列或部分序列与酵母蛋白GAL 4 DNA结合区域融合蛋白的酵母表达质粒，应用这些质粒转化酵母报道菌株SFY526，检测β－半乳糖苷酶活性作为酵母中转录激活的指标。构建编码Pre S1全序列与GAL4 DNA结合区域融合蛋白的哺乳动物细胞表达质粒，与CAT报道质粒共转染肝癌细胞系Huh-7，使用薄层层析法检测细胞提取物的氯霉素乙酰转移酶活性。结果 全序列Pre S1蛋白与GAL4 DNA结合区域的融合蛋白在酵母细胞中呈现转录激活功能，其转录激活序列被定位于Pre S1第21－47氨基酸之间。全序列Pre S1蛋白与GAL 4 DNA结合区域的融合蛋白在哺乳动物细胞中未呈现转录激活功能。结论 HBV Pre S1蛋白在酵母细胞中的转录激活功能，限制了研究人员应用酵母双杂交体系统克隆与Pre S1结合的HBV受体。然而，Pre S1蛋白在哺乳动物细胞未呈现转录激活功能。哺乳动物细胞双杂交体系统可能是克隆与Pre S1蛋白作用的肝细胞受体的可行途径。     

Mutations that alter both localization and production of a yeast nuclear protein

The first 74 amino acids of the yeast GAL4 gene product are sufficient to localize a GAL4-beta-galactosidase chimeric protein to the yeast nucleus. Chimeric proteins missing the first 74 GAL4 amino acids, but containing almost all of the rest of GAL4, are not localized to the nucleus and are expressed at higher levels than their nuclear counterparts. On this basis, point mutations within GAL4, which reduce nuclear localization and increase production of a normally nuclear GAL4-beta-galactosidase fusion protein, were isolated and sequenced. The effect of these mutations on the localization and expression of the intact GAL4 protein was examined. The degree to which the mutant proteins are excluded from the nucleus varies, but all mutations cause overproduction of the protein. Point mutations altering two of the six cysteine residues of the GAL4 putative 'zinc finger' abolish gene activation by intact GAL4; however, mutations in nearby residues have no effect on GAL4-dependent gene activation.     

柯萨奇病毒A16型2 B基因的酵母双杂交诱饵载体的构建及其特性鉴定

目的：构建柯萨奇病毒A16的2B基因的酵母诱饵表达载体,用于筛选与2B相互作用的蛋白。方法 PCR扩增2B全序列,克隆入pGBKT7?BD,将构建好的 pGBKT7?2B转化到酵母细胞 Y2HGold;用Western印迹分析诱饵蛋白的表达,检测诱饵蛋白有无毒性和自激活效应。结果成功克隆了pGBKT7?2B并转化至Y2 HGold中,转化细胞Y2 HGold [pGBKT7?2B]可以表达诱饵蛋白2B,2B蛋白对转化细胞无细胞毒性和自激活效应。结论成功构建了酵母诱饵表达载体pGBKT7?2B,可用于酵母双杂交筛选与2B蛋白相互作用的宿主靶蛋白。     

重组嵌合抗人CD22四价基因工程抗体在毕赤酵母中的表达及活性检测

目的:采用酵母多拷贝分泌表达载体pPIC9K表达重组嵌合抗人CD22四价基因工程抗体cRFB4FC和cRFB4CH3,并进行活性检测。方法:采用基因克隆技术获得两抗体的基因,然后将其克隆入表达载体pPIC9K中,构建重组质粒pPIC9K/cRFB4FC和pPIC9K/cRFB4CH3,经测序鉴定正确,电转化入毕赤酵母SMD1163中,将经G418抗性筛选出的重组酵母菌株进行PCR鉴定,经甲醇诱导,表达产物经SDS-PAGE分析和Western blot鉴定,经ELISA检测生物学活性。采用正交试验优化重组酵母菌株的表达条件以提高抗体的表达量。结果:获得重组表达质粒pPIC9K/cRFB4FC和pPIC9K/cRFB4CH3,经G418筛选及PCR鉴定得到高拷贝整合的重组酵母菌株,经甲醇诱导表达出cRFB4FC和cRFB4CH3蛋白。它们在SDS-PAGE上分别表现为相对分子质量(Mr)约326 000和295 000的蛋白区带,在Western blot分析中均可被山羊抗人IgG Fc单克隆抗体(mAb)识别,经ELISA分析它们都具有较高的生物学活性。优化表达条件后,抗体的表达量分别提高了196.4%和151.7%。结论:抗体cRFB4FC和cRFB4CH3在酵母菌SMD1163中成功获得高效分泌表达,并有免疫学活性。     

HBx蛋白对IGF-II基因P4启动子活性的影响

目的:构建乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)表达载体pEYFP-C1-X及人IGF-II基因P4启动子调控的荧光素酶报告载体pGL3-P4,并初步探讨HBx对IGF-II基因P4启动子活性的影响。方法:应用基因重组技术,将HBx基因及P4启动子分别克隆入pEYFP-C1及pGL3-Basic载体,构建重组质粒pEYFP-C1-X及pGL3-P4;将pEYFP-C1-X稳定转染HepG2细胞,进行G418筛选;将体外甲基化pGL3-P4瞬时转染HepG2-EYFP-X细胞,采用双荧光素酶实验检测P4启动子的转录调控活性。结果:(1)经酶切及测序鉴定,重组质粒中的目的片段HBx和P4启动子的大小分别为465bp及1246bp,序列与GenBank数据库一致。(2)获得了表达HBx的细胞系HepG2-EYFP-X,在荧光显微镜下呈现黄绿色荧光。(3)转染HepG2-EYFP-X细胞的甲基化P4启动子的荧光素酶活性明显高于其对照细胞HepG2-EYFP(P0.01)。结论:HBx可增加P4启动子的转录活性。     

抗内毒素单链抗体基因的构建、序列分析及表达

目的：构建抗内毒素（ＬＰＳ） 单链抗体基因, 并尝试其在Ｅ．ｃｏｌｉ 中的表达。方法： 采用ｌｉｎｋｅｒ Ｐｒｉｍ ｅｒ Ｍｉｘ ,按ＶＨｌｉｎｋｅｒＶＬ 的结构将鼠抗ＬＰＳ ｍ Ａｂ Ｃ３Ａ２ 的ＶＨ ,ＶＬ 基因拼接成单链抗体（ＳｃＦｖ） 基因;用ＰＥ３７３Ａ 型全自动ＤＮＡ序列分析仪测定其核苷酸序列。ＰＣＲ 扩增抗ＬＰＳ ＳｃＦｖ 基因并更换两端接头序列后,插入谷胱甘肽巯基转移酶（ＧＳＴ）融合表达载体ｐＧＥＸ４Ｔ１ ;转染Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９ ,以ＩＰＴＧ 诱导表达,ＳＤＳＰＡＧＥ 分析表达产物。结果：扩增出的ＳｃＦｖ基因长７３５ｂｐ , 序列分析表明,该序列完整、正确;ＳＤＳＰＡＧＥ 显示,转染入重组质粒ｐ４ＴＣ３Ａ２Ｆｖ 的ＪＭ１０９ 菌经诱导后,有相对分子质量（ Ｍｒ） 约为５２ ０００ 的外源蛋白表达。结论：成功地构建了鼠抗ＬＰＳ ＳｃＦｖ 基因,并在Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９中表达了ＧＳＴＳｃＦｖ 融合蛋白。     

中国株HGV NS3区基因的原核表达及其产物的抗原性分析

目的 研究ＨＧＶ ＮＳ３区基因产物的抗原性,并探讨ＮＳ３蛋白在血清学检测中的应用。方法 将中国株ＨＧＶ ＮＥ３区的３个基因片段分别克隆到ｐＲＳＥＴ Ｂ和ｐＲＳＥＴ Ｃ质粒载体中,构建成原核表达载体。ＩＰＴＧ诱导下,在大肠杆菌ＢＬ２１中高效表达,获得３个重组蛋白,用Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ和ＥＬＩＳＡ法分别对表达产物进行分析。结果 所构建的表达载体均得到高效表达,得到的重组蛋白ＰＡ,Ｐ３和Ｐ４的分子     

Multiple interactions among proteins encoded by the mite-transmitted wheat streak mosaic tritimovirus

The genome organization of the mite-transmitted wheat streak mosaic virus (WSMV) appears to parallel that of members of the Potyviridae with monopartite genomes, but there are substantial amino acid dissimilarities with other potyviral polyproteins. To initiate studies on the functions of WSMV-encoded proteins, a protein interaction map was generated using a yeast two-hybrid system. Because the pathway of proteolytic maturation of the WSMV polyprotein has not been experimentally determined, random libraries of WSMV cDNA were made both in DNA-binding domain and activation domain plasmid vectors and introduced into yeast. Sequence analysis of multiple interacting pairs revealed that interactions largely occurred between domains within two groups of proteins. The first involved interactions among nuclear inclusion protein a, nuclear inclusion protein b, and coat protein (CP), and the second involved helper component-proteinase (HC-Pro) and cylindrical inclusion protein (CI). Further immunoblot and deletion mapping analyses of the interactions suggest that subdomains of CI, HC-Pro, and P1 interact with one another. The two-hybrid assay was then performed using full-length genes of CI, HC-Pro, P1, P3, and CP, but no heterologous interactions were detected. In vitro binding assay using glutathione-S-transferase fusion proteins and in vitro translation products, however, revealed mutual interactions among CI, HC-Pro, P1, and P3. The failure to detect interactions between full-length proteins by the two-hybrid assay might be due to adverse effects of expression of viral proteins in yeast cells. The capacity to participate in multiple homomeric and heteromeric molecular interactions is consistent with the pleiotropic nature of many potyviral gene mutants and suggests mechanisms for regulation of various viral processes via a network of viral protein complexes.     

人NT3、BDNF基因Tet-on可调控重组腺病毒载体的构建和鉴定

目的 :分别构建含人神经营养素 3(NT3)基因和脑源性神经营养因子 (BDNF)基因的重组四环素可诱导的腺病毒载体 ,并进行PCR和酶切鉴定。方法 :将NT3和BDNF基因依次分别亚克隆到pIND载体和pTRE Shuttle2载体中 ,构建重组载体pTRE Shuttle2 NT3和pTRE Shuttle2 BDNF。用PI SceI和I CeuI双酶切后将所获NT3及BDNF基因片段再与线性化的腺病毒载体pAdeno X连接 ,构建成pAdeno NT3及pAdeno BDNF的重组腺病毒载体。以电穿孔转化E .coli后挑取克隆进行PCR及酶切鉴定。结果 :重组腺病毒载体的PCR鉴定表明 ,在 312bp处出现特定的条带 ;酶切鉴定证实 ,得到约 2 3kb的预期片段 ,说明人NT3、BDNF基因与腺病毒载体pAdeno X已正确连接。结论 :成功地构建了含人NT3和BDNF基因的四环素可诱导重组腺病毒载体 ,为进一步实现其在雪旺细胞中可调控的高效表达奠定了基础     

A densely overlapping gene fragmentation approach improves yeast two-hybrid screens for Plasmodium falciparum proteins

Use of the yeast two-hybrid assay to study Plasmodium falciparum protein-protein interactions is limited by poor expression of P. falciparum genes in yeast and lack of easily implemented assays to confirm the results. We report here two methods to create gene fragments - random fragmentation by partial DNAse I digestion and generation of densely overlapping fragments by PCR - that enable most portions of P. falciparum genes to be expressed and screened in the yeast two-hybrid assay. The PCR-based method is less technically challenging and facilitates fine-scale mapping of protein interaction domains. Both approaches revealed a putative interaction between PfMyb2 (PF10_0327) and PFC0365w. We developed new plasmids to express the proteins in wheat germ extracts and confirmed the interaction in both the split-luciferase assay and in co-purification experiments with glutathione-S-transferase and HA-tagged proteins. The combination of improved yeast two-hybrid screening approaches and convenient systems to validate interactions enhances the utility of yeast two-hybrid assays for P. falciparum.