shRNA干扰沉默Mcl-1基因对淋巴瘤细胞系增殖的影响

目的研究慢病毒介导的髓细胞白血病基因(Mcl-1)短发夹状RNA(shRNA)干扰对淋巴瘤细胞系SNK-6增殖和凋亡的影响。方法设计以Mcl-1为靶点的shRNA并构建携带此shRNA的慢病毒载体,转染淋巴瘤细胞系SNK-6,荧光定量PCR(qPCR)及Western blot方法检测病毒感染前后Mcl-1 mRNA及蛋白表达变化,四甲基偶氮唑盐法(MTT法)和流式细胞仪分析细胞增殖和凋亡变化的情况。结果成功构建Mcl-1-shRNA慢病毒表达载体,并可有效感染淋巴瘤细胞株SNK-6,感染后SNK-6细胞Mcl-1基因的mRNA水平及蛋白水平表达明显下调,MTT法检测显示慢病毒介导的Mcl-1基因shRNA干扰与对照病毒组相比可明显抑制SNK-6细胞增殖[(31.6±3.3)%vs(5.8±2.7)%,P<0.01],流式细胞仪测定感染后细胞凋亡明显高于对照病毒组[(28.9±2.1)%vs(5.3±1.5)%,P<0.01]。结论慢病毒介导的Mcl-1基因shRNA干扰技术可特异性阻断SNK-6细胞Mcl-1基因的表达,抑制细胞的增殖并促进细胞的凋亡。     

Effect of shRNA interference targeting myeloid leukemia-1 gene on proliferation in lymphoma cell line

目的 研究慢病毒介导的髓细胞白血病基因(Mcl-1)短发夹状RNA(shRNA)干扰对淋巴瘤细胞系SNK-6增殖和凋亡的影响.方法 设计以Mcl-1为靶点的shRNA并构建携带此shRNA的慢病毒载体,转染淋巴瘤细胞系SNK-6,荧光定量PCR(qPCR)及Western blot方法检测病毒感染前后Mcl-1 mRNA及蛋白表达变化,四甲基偶氮唑盐法(MTT法)和流式细胞仪分析细胞增殖和凋亡变化的情况.结果 成功构建Mcl-1-shRNA慢病毒表达载体,并可有效感染淋巴瘤细胞株SNK-6,感染后SNK-6细胞Mel-1基因的mRNA水平及蛋白水平表达明显下调,MTT法检测显示慢病毒介导的Mcl-1基因shRNA干扰与对照病毒组相比可明显抑制SNK-6细胞增殖[(31.6±3.3)％vs(5.8±2.7)％,P＜0.01],流式细胞仪测定感染后细胞凋亡明显高于对照病毒组[(28.9±2.1)％vs(5.3±1.5)％,P＜0.01].结论 慢病毒介导的Mcl-1基因shRNA干扰技术可特异性阻断SNK-6细胞Mel-1基因的表达,抑制细胞的增殖并促进细胞的凋亡.     

shRNA沉默Survivin基因对胶质瘤细胞U87生物学行为影响的研究

目的 观察短发卡RNA(short hairpin RNA,shRNA)沉默Survivin基因对人脑胶质瘤细胞U87增殖、凋亡等生物学特性的影响.方法 通过脂质体LipofectamineTM 2000对胶质瘤细胞株U87转染Survivin shRNA干扰质粒(Suvrivin shRNA-i),以及对照无意义质粒(Suvrivin shRNA-nonsense),应用RT-PCR、Western blot检测转染前后Survivin mRNA和蛋白表达,流式细胞术测定各组细胞的细胞周期及TUNEL测定细胞凋亡形态.结果 转染Survivin shRNA-i组的Survivin mRNA及蛋白表达水平显著低于对照组(P＜0.05).与对照组相比较,转染Survivin shRNA-i后细胞周期G2/M期阻滞显著,细胞凋亡率升高(P＜0.05).结论 靶向Survivin基因的特异性shRNA能够阻制U87细胞的生长并诱导其凋亡.     

MRPS23 shRNA对乳腺癌细胞Walker256增殖凋亡的作用及机制

目的:探讨线粒体核糖体蛋白MRPS23 shRNA对大鼠乳腺癌细胞Walker256增殖和凋亡的作用及机制。方法:构建含有MRPS23基因沉默片段(sh MRPS23)和对照shRNA的慢病毒载体(sh Ctrl),感染Walker256细胞48 h,以确定转染效率和基因沉默效率。MTS、TUNEL法检测其对Walker256细胞的增殖凋亡率的影响;RTPCR、western blot法检测细胞增殖和凋亡相关基因与蛋白表达水平。结果:与control组以及对照病毒组相比,sh MRPS23能显著抑制MRPS23基因及蛋白的表达,MRPS23基因沉默后能抑制Walker256细胞增殖,并促进细胞凋亡;p21WAF1、p53表达增高(P<0.05)。结论:慢病毒介导的MRPS23 shRNA可以通过上调p21WAF1抑制Walker256细胞增殖,MRPS23 RNAi可诱导细胞p53依赖性的凋亡。     

S100PshRNA慢病毒载体的构建及其对胃癌MGC-803细胞生物学行为的影响

目的：：构建针对S100P基因的shRNA慢病毒载体,并在胃癌MGC-803细胞上鉴定沉默效率,观察其对细胞生物学行为的影响。方法：筛选的S100P基因特异性siRNA靶点,合成短发卡结构shRNA,并与GV115-GFP慢病毒载体重组形成shRNA表达载体,与pHelper 1.0和pHelper 2.0质粒共转染293T细胞,产生慢病毒。用病毒感染MGC-803细胞,RT-PCR和Western blot检测靶基因的沉默效率、克隆形成情况、细胞周期变化和凋亡实验观察靶基因沉默对MGC-803的影响。结果：构建的重组shRNA慢病毒载体,经293T细胞包装获得病毒颗粒,和阴性对照相比,慢病毒感染组S100 P mRNA表达下降了83.4%,蛋白表达也明显受到抑制。 S100 P沉默后MGC-803的克隆形成能力明显减弱,细胞周期发生S期阻滞,细胞凋亡明显增加。结论：成功地构建了S100P基因shRNA慢病毒表达载体,该载体能够在MGC-803细胞中沉默S100P基因的表达,导致胃癌细胞克隆形成能力降低,细胞周期阻滞,诱导细胞凋亡,表明S100 P基因有可能具有影响胃癌发生发展的作用。     

应用RNAi敲减MARCH6基因对乳腺癌MCF-7细胞增殖及#br# 周期的影响

目的：应用慢病毒介导的RNAi技术,在乳腺癌MCF-7细胞中敲减MARCH6基因的表达,研究其对MCF-7细胞增殖及细胞周期的影响。方法：靶向MARCH6基因的shRNA慢病毒转染293T细胞后,在荧光显微镜下观察转染效率;收集慢病毒液感染MCF-7细胞后,应用实时荧光PCR和Western印迹验证RNAi敲减MARCH6基因后,MARCH6基因mRNA和蛋白的表达影响;应用MTT,BrdU细胞增殖实验检测细胞增殖能力的变化;采用增殖指数染色流式细胞术检测细胞周期和增殖的改变。结果：通过在荧光显微镜下观察,MARCH6 shRNA慢病毒质粒成功转染293T细胞,与同明视野对比,可见80%左右的细胞带绿色荧光;感染MCF-7细胞,90%的细胞均带绿色荧光; 实时荧光PCR和Western印迹验证了MARCH6 shRNA慢病毒感染MCF-7细胞后,MARCH6在转录水平和蛋白水平表达均显著下降;MTT实验、BrdU法结果显示MARCH6基因敲减组的MCF-7细胞增殖显著下降(P<0.01),流式细胞术分析显示MARCH6敲减后MCF-7细胞出现细胞周期抑制,细胞分裂处于G1期细胞数明显增多,增殖指数显著降低。结论：敲减乳腺癌MCF-7细胞的MARCH6基因表达后,抑制了MCF-7细胞的增殖,并引起细胞周期G1期阻滞。提示MARCH6通过影响细胞周期的进展,促进乳腺癌细胞的增殖。     

PTEN基因对子宫内膜癌细胞PI3K/AKT通路的影响

 【目的】探讨PTEN基因在子宫内膜癌PI3K/AKT通路中的作用,评估PTEN基因在抗肿瘤治疗中的意义。【方法】利用慢病毒载体系统, 构建人PTEN基因RNA干扰慢病毒载体和PTEN基因过表达慢病毒载体,分别转染PTEN野生型的HEC-1A细胞和PTEN突变型的Ishikawa细胞, 建立PTEN 基因敲减及过表达的细胞模型,Western Blot方法检测PTEN基因敲减或过表达前后PTEN蛋白的表达和AKT通路的活化情况, MTT法检测慢病毒转染前后细胞增殖的变化,流式细胞术检测慢病毒转染前后细胞周期及细胞凋亡率的变化。【结果】1. HEC-1A细胞转染PTEN基因干扰慢病毒载体后,细胞的增殖曲线和细胞凋亡率与对照组比较无明显变化。但Ishikawa细胞转染PTEN基因过表达慢病毒载体后,增殖曲线和细胞凋亡率显示其生长呈明显抑制状态。2.当HEC-1A细胞转染了RNA干扰病毒后（HEC-1A-RNAi）,Western Blot 结果显示PTEN蛋白表达下调,其EGFR, p-EGFR, mTOR, p-mTOR, AKT, p-AKT蛋白表达增强,当Ishikawa细胞转染了过表达载体病毒后（Ishikawa-PTEN）,Western Blot 结果显示其PTEN蛋白表达上调,p-EGFR,p-mTOR,AKT,p-AKT蛋白表达减弱。3.HEC-1A-RNAi细胞周期中G1期细胞比例减少,S期细胞比例增加,Ishikawa-PTEN细胞周期中G1期细胞比例增加,S期细胞比例减少。【结论】PTEN 基因可以抑制细胞增殖过程, 有可能成为子宫内膜癌患者基因治疗的选择之一。     

氯化三乙基锡对体外培养大鼠C6胶质瘤细胞的增殖抑制作用

目的：探讨氯化三乙基锡（TETC）对体外培养大鼠C6胶质瘤细胞的增殖抑制作用及其机制,为胶质瘤治疗提供实验依据。方法：采用MTT法检测0.5、1.0和2.0 μmol/L TETC对大鼠C6胶质瘤细胞作用24和48 h后细胞增殖抑制率,采用Hoechest33258染色荧光显微镜观察0.5、1.0和2.0 μmol/L TETC作用48 h后 C6胶质瘤细胞核的形态学变化,采用流式细胞术(FCM)检测0.5、1.0和2.0 μmol/L> TETC作用48 h后 C6胶质瘤细胞周期和凋亡。结果：0.5、1.0和2.0 μmol/L TETC在体外可抑制C6胶质瘤细胞增殖,24 h抑制率分别为7.92％、9.51％和19.03％;48 h抑制率分别为15.62％、36.16％和41.92％,存在剂量依赖性和时间依赖性上升趋势,48 h抑制率在各剂量组间及各剂量组与对照组间比较差异有显著性（P<0.05或P<0.01）。荧光显微镜显示TETC作用C6胶质瘤细胞48 h后,细胞呈现核浓缩和碎裂的凋亡形态学改变。1.0和2.0 μmol/L TETC作用C6胶质瘤细胞48 h后,G₀/G₁期细胞比例明显高于对照组（P<0.05）,S期细胞比例明显低于对照组（P<0.05
）,细胞凋亡比例明显高于对照组（P<0.05）。结论：TETC对大鼠C6胶质瘤细胞有增殖抑制作用,通过细胞周期阻滞及诱导凋亡可能是TETC抑制C6胶质瘤细胞增殖的作用机制。     

shRNA 沉默YAP基因对人肾癌786-O细胞增殖和凋亡的影响

目的：探讨慢病毒干扰载体沉默Yes-相关蛋白（Yes-associated protein,YAP）对人肾癌786-O细胞增殖和凋亡的影响。方法：用细胞免疫荧光法检测肾癌786-O细胞中YAP蛋白表达情况;构建针对YAP基因的shRNA慢病毒干扰载体转染786-O细胞。RT-PCR和Western blot分别检测干扰786-O细胞前后 YAP mRNA及蛋白的表达情况;CCK-8（cell counting kit-8）法检测沉默YAP后细胞增殖的改变;流式细胞仪（flow cytometry,FCM）检测细胞凋亡和周期的变化。结果：786-O细胞中YAP蛋白表达于细胞浆和细胞核;shRNA-YAP慢病毒干扰载体转染4 d后,可明显下调786-O细胞YAP mRNA及蛋白表达水平（P=0.000）,并且明显抑制细胞增殖和促进细胞凋亡（P=0.000）;细胞周期紊乱,G1 期细胞明显增加,S期细胞明显降低（P=0.000）。结论：YAP-shRNA慢病毒干扰载体能有效抑制YAP基因在786-O细胞中表达,进而抑制细胞增殖并促进细胞凋亡。     

Clusterin基因沉默对脑胶质瘤U87细胞放射敏感性的影响

目的：研究通过慢病毒介导的RNA干扰技术沉默簇集蛋白（clusterin,CLU）基因表达对人脑胶质瘤U87细胞放射敏感性的影响。方法：设计和合成靶向CLU的短发夹RNA（short hairprin RNA,shRNA）序列（CLU shRNA1,CLU shRNA2）,并构建到慢病毒的载体plentilox 3.7,以不针对任何基因的shRNA序列作为对照（对照 shRNA）。包被能成功表达各种shRNA载体的慢病毒。将慢病毒感染人脑胶质瘤U87细胞,Real-time PCR法和Western blot法测定CLU mRNA表达和蛋白质表达水平,证实干扰效果。给予不同放射剂量（2、4、6 Gy）处理后,通过四甲基偶氮唑盐（thiazolyl blue tetrazolium bxomide,MTT）法及流式细胞仪Annexin V/PI法检测脑胶质瘤U87细胞的存活率及凋亡率。Western blot方法筛选多个凋亡相关信号分子的改变。结果：靶向CLU基因的shRNA特异性地抑制了CLU mRNA和蛋白质的表达。MTT实验结果显示实验干扰组细胞在不同放射剂量下的脑胶质瘤实验U87细胞的存活率与对照组比较明显下降,差异具有统计学意义（4 Gy时,对照 shRNA vs. CLU shRNA1：P=0.000,对照 shRNA vs. CLU shRNA2：P=0.00３;6 Gy时,对照 shRNA vs. CLU shRNA1：P=0.000,对照 shRNA vs. CLU shRNA2：P=0.000）。流式细胞仪Annexin V/PI法检测结果表明：4 Gy放疗后2个实验组细胞凋亡率均明显增加,最高达（35.54±0.95）%,较对照组高2倍多,差异具有明显统计学意义（对照 shRNA vs. CLU shRNA1：P=0.000;对照 shRNA vs. CLU shRNA2：P=0.000）。Western blot 法发现CLU沉默可以显著上调促凋亡分子Bax蛋白水平。结论：CLU基因沉默可能通过调控Bax蛋白的表达,明显增强脑胶质瘤U87细胞对放射的敏感性,有望成为增加脑胶质瘤放射敏感性的新靶点。     

调控CIAPIN1基因表达对食管癌细胞生长及侵袭性的影响

目的 采用重组慢病毒CIAPIN1表达载体和CIAPIN1沉默载体感染食管癌EC9706细胞,观察调控CIAPIN1基因表达对细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡及体外侵袭转移的影响.方法 构建CIAPIN1表达慢病毒载体和CIAPIN1 siRNA慢病毒载体,包装得到重组慢病毒;分别感染食管癌EC9706细胞,筛选得到稳定C...     

纳米基因载体介导RNA干扰沉默Survivin基因对大肠癌细胞增殖和凋亡的影响

目的 探讨纳米基因载体介导RNA干扰沉默Survivin基因对大肠癌细胞HT-29增殖和凋亡的影响.方法 用壳聚糖-聚乙二醇纳米粒介导的Survivin shRNA(基因纳米复合物)转染结肠癌细胞株HT-29,并以携带相同shRNA的脂质体载体,以及阴性对照shRNA为对照,用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测转染后的HT-29细胞中Survivin mRNA的变化,用噻唑蓝(MTT)法检测细胞凋亡率.结果 和脂质体载体比较,转染基因纳米复合物后,HT-29细胞中Survivin mRNA拷贝数及蛋白表达显著降低,其细胞死亡率和凋亡率显著提高(P<0.05).结论 壳聚糖-聚乙二醇纳米粒里介导的Survivin shRNA较之脂质体载体具有更高的干扰效率,且能长期、高效地诱导结肠癌细胞凋亡并抑制其增殖.     

Id2 shRNA慢病毒载体的构建及其转染后对胶质瘤细胞增殖和凋亡的影响

目的构建能高效敲减分化抑制因子2(Id2)基因的短发夹状小干扰RNA(shRNA)慢病毒载体,并观察敲减Id2对胶质瘤细胞株U251增殖和凋亡的影响。方法设计并合成特异性针对Id2基因的shRNA序列,将其构建到慢病毒载体pGCSIL-GFP中。以含有Id2基因的质粒为模板,扩增Id2基因cDNA序列的特异性片段,插入真核表达载体pEGFP-N1-3FLAG。构建含Id2基因质粒和不同靶点的RNAi慢病毒载体,共转染入工具细胞293T,筛选出适合浓度慢病毒感染U251细胞株。MTT法检测敲减Id2后胶质瘤细胞增殖的改变,RT-PCR检测Id2敲减后U251细胞caspase 3的表达。结果构建后载体的PCR鉴定及DNA测序结果与预期一致。与对照组相比,转染Id2 shRNA的U251细胞增殖降低,凋亡率升高,caspase3表达升高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论成功构建的针对Id2基因的RNA干扰慢病毒载体体外转染可抑制胶质瘤细胞增殖并促进其凋亡。     

IGF1R-shRNA重组慢病毒的构建及对肺癌A549细胞增殖的影响

目的 构建IGF1R基因的shRNA慢病毒载体,转染A549细胞鉴定沉默效率,观察其对A549细胞增殖能力的影响.方法 设计IGF1R干扰序列,与pGC-LV慢病毒载体重组形成shRNA表达载体,包装shRNA慢病毒颗粒,感染A549细胞,应用RT-PCR和Western blot检测IGF1R干扰效果;细胞生长抑制实验、克隆形成实验及细胞周期检测评价其对A549细胞增殖的影响. 结果 成功构建了IGF1R-shRNA重组慢病毒并高效感染A549细胞,IGF1R mRNA及蛋白表达量分别下降74.51％,70.53％;细胞群体倍增时间显著延长,克隆形成能力显著降低,细胞周期阻滞于G0/G1期. 结论 本研究构建的重组慢病毒能显著抑制IGF1R表达,抑制A549细胞增殖.     

双靶点沉默Survivin和RhoA对肺腺癌A549细胞的作用

目的双靶点靶向沉默肺腺癌A549细胞Survivin和RhoA基因表达,研究其治疗作用。方法构建共表达靶向Survivin和RhoA基因的串联microRNA干扰载体,脂质体介导该干扰载体转染A549细胞作为实验组,空白干扰载体作为对照组。于转染48 h后,RT-PCR检测Survivin、RhoA mRNA表达,Western blot检测Sur-vivin、RhoA蛋白质表达,MTT法检测细胞的增殖并计算抑制率,流式细胞仪检测细胞凋亡。结果实验组SurvivinmRNA表达抑制率为62.7%,RhoA mRNA表达抑制率为69.0%;实验组Survivin蛋白表达抑制率为66.7%,RhoA蛋白表达抑制率为71.9%。与对照组比较,实验组细胞增殖抑制率为(47.63±6.34)%。实验组细胞凋亡率为(36.32±6.42)%,明显高于对照组[(0.62±0.2)%](P<0.05)。结论成功构建Survivin-RhoA串联microR-NA干扰载体,表达的人工双靶点microRNA能通过促进细胞凋亡来抑制A549细胞增长。     

RNA干扰抑制HMGB1基因表达对子宫内膜癌的增殖抑制作用及其分子机制

目的：研究RNA干扰抑制高迁移率族蛋白1(high mobility group box-1 protein,HMGB1)的表达对子宫内膜癌 细胞株HEC-1A的增殖抑制作用及对细胞周期、细胞凋亡的影响,并探讨其可能的分子机制。方法：构建靶向HMGB1 基因的慢病毒shRNA载体,转染子宫内膜癌细胞株HEC-1A,同时利用实时荧光定量RT-PCR和Western印迹检测转染 HMGB1-siRNA后细胞HMGB1 mRNA和蛋白表达水平的变化。MTT法和流式细胞术分别检测转染HMGB1-siRNA后 HEC-1A细胞增殖、细胞周期和细胞凋亡的变化。Western印迹检测转染HMGB1-siRNA后细胞AKT,pAKT和cyclinD1 的蛋白表达水平。结果：慢病毒HMGB1 shRNA载体成功抑制HMGB1 mRNA(P<0.05)和蛋白(P<0.01)在HEC-1A细胞 中的表达;转染HMGB1 shRNA后HEC-1A细胞的增殖能力明显受抑制(P<0.01),并能阻滞细胞于G0/G1期,且明显 诱导细胞凋亡;转染HMGB1 shRNA组、空白对照组和阴性对照组的总凋亡率分别为(17.89±0.23)%,(4.69±0.20)%和 (4.62±0.17)%,3组之间差异有统计表达学意义(P<0.01)。转染HMGB1 shRNA后细胞pAKT和cyclinD1蛋白表达水平均下 调(均P<0.01)。结论：HMGB1表达下调可以有效地抑制子宫内膜癌细胞HEC-1A的增殖,细胞阻滞于G0/G1期,且可诱 导细胞凋亡,影响磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)信号通路及下调cyclinD1的蛋白表达水平可能为其主要作 用机制。     

慢病毒载体介导RNA干扰体外抑制人胰腺癌细胞增殖诱导配体的表达

目的:观察慢病毒表达载体介导的RNA干扰(RNAi)对人胰腺癌细胞株CFPAC-1增殖诱导配体(a proliferation-inducing ligand,APRIL)表达的影响,为后续的以APRIL基因为靶点的胰腺癌基因治疗研究奠定基础.方法:应用基因工程技术,筛选出3条针对APRIL基因的RNAi靶序列,分别与pGCL-GFP载体连接,构建3个重组慢病毒表达载体LV-APRIL shRNA1、LV-APRIL shRNA2、LV-APRIL shRNA3;将连接产物转化到DH5 α感受态细胞,经PCR筛选阳性克隆、测序鉴定.将LV-APRIL shRNA、pHelper 1.0、pHelper 2.0共转染293T细胞,包装产生慢病毒颗粒并测定病毒滴度.将包装产生的3种重组慢病毒分别感染CFPAC-1细胞,实时定量PCR和Western印迹检测CFPAC-1细胞APRIL mRNA和蛋白的表达,并与未转染及空转染细胞进行比较.结果:3个慢病毒载体PCR和测序结果与预期结果一致,经包装产生的病毒滴度分别为5×107、6×107、4×107 TU/ml.感染CFPAC-1细胞后,APRIL基因mRNA和蛋白的表达量与未感染慢病毒的细胞组及空载体感染组相比均明显下降(P＜0.05),其中LV-APRIL shRNA1、LV-APRIL shRNA2作用较明显,使mRNA表达分别下降73%和68%,蛋白表达分别下降66%和59%(P＜0.05);而未感染慢病毒的细胞组与空载体组相比无统计学差异.结论:成功构建针对APRIL基因的3个慢病毒载体LV-APRILshRNA,体外感染CFPAC-1细胞后可有效抑制APRIL基因和蛋白的表达.     

大鼠线粒体膜蛋白Nix基因过表达与shRNA慢病毒载体的构建与鉴定

目的 构建线粒体膜蛋白Nix基因过表达与shRNA慢病毒载体.方法 PCR扩增获得Nix基因序列,与经BamH Ⅰ、EcoR Ⅰ双酶切的pHBLV-CMVIE-IRES-Puro载体连接获得Nix过表达重组慢病毒载体;以Nix为靶基因,合成寡核苷酸,退火形成双链DNA,与经BamH Ⅰ、EcoR Ⅰ双酶切的pHBLV-U6-Scramble-Puro载体连接获得Nix shRNA重组慢病毒载体;将病毒包装辅助质粒与上述重组慢病毒载体共转染293T细胞,收集上清液并浓缩获得慢病毒浓缩液,3倍梯度稀释法测定病毒滴度;用病毒颗粒感染PC12细胞,经嘌呤酶素筛后得到稳定感染细胞株;荧光显微镜检测Nix荧光水平,Western blot检测Nix蛋白的表达.结果 成功构建Nix基因过表达和shRNA慢病毒载体,并在293T细胞中包装获得病毒.重组病毒感染PC12细胞后,荧光显微镜检测Nix基因过表达细胞荧光水平增加,shRNA感染细胞荧光水平降低;Western blot检测显示Nix基因过表达PC12细胞中Nix蛋白表达显著升高,shRNA慢病毒感染细胞中Nix蛋白表达明显降低,而Nix shRNA1干扰效果最好.结论 成功构建Nix基因过表达与shRNA慢病毒载体,并获得Nix过表达与干扰细胞模型.     

大鼠蛋白激酶Cγ基因小发卡RNA慢病毒载体的构建及其干扰效率的鉴定

目的：研究指出蛋白激酶Cγ（PKCγ）在脊髓水平上参与了伤害性信号的传递,文中拟构建大鼠PKCγ基因的小发卡RNA（shRNA）慢病毒载体,并在细胞水平鉴定其干扰效率。方法：根据PKCγ-mRNA序列,选择3条19nt的靶序列,设计并合成包含正、反义靶序列的互补DNA链,退火后插入到pLVTHM载体的H1启动子后获得重组质粒,同时构建一个非特异性对照质粒。将所构建的质粒与pMDLg-pRRE、pR sv-REV、pMD2G共转染293T细胞,包装产生慢病毒后,分别感染C6细胞,经免疫印迹技术（W estern b lot）检测PKCγ基因的蛋白表达水平以评价慢病毒载体的抑制效率。结果：测序证实成功构建了3个大鼠PKCγ基因shRNA慢病毒载体,分别感染C6细胞后pLV-PKC2和pLV-PKC3可明显降低PKCγ蛋白的表达,其中以pLV-PKC2（靶向位点：＋1913＋1931）的慢病毒抑制效率最高。结论：成功构建了大鼠PKCγ基因shRNA慢病毒载体,且慢病毒载体pLV-PKC2能特异、高效地抑制PKCγ基因的表达。     

抑制STAT3在胶质瘤细胞中的表达导致细胞凋亡

目的探讨Stat3基因在脑胶质瘤细胞中的表达及作用。方法将对应Stat3基因特异序列的发夹结构RNA（small hairpin RNA,shRNA）表达载体转染到脑胶质瘤细胞株SHG44,观察细胞形态的变化;用TdT介导的dUTP缺口末端标记技术（TUNEL）对细胞进行检测;RT-PCR分析Stat3的mRNA的表达量变化。结果转染shRNA表达载体使脑胶质瘤细胞形态发生显著变化;TUNEL实验观察到细胞凋亡数目明显增多,且凋亡细胞有明显荧光;RT-PCR结果显示转染后Stat3 mRNA的表达量明显下降。结论 Stat3蛋白在脑胶质瘤细胞正常生长中起到重要作用,抑制该蛋白在细胞中的表达会导致细胞凋亡。