丙型肝炎病毒核心蛋白反式激活基因2表达产物的亚细胞定位

目的研究HCV核心蛋白反式激活基因2(TAHCCP2)在细胞内的表达及表达产物的亚细胞定位。方法构建HBeAgTP基因的绿色荧光蛋白表达质粒pEGFP-C1-TAHCCP2,转染HepG2细胞,24h后荧光显微镜下观察表达蛋白的亚细胞定位。结果成功构建出TAHCCP2基因的绿色荧光蛋白表达质粒pEGFP-C1-TAHCCP2,其表达的蛋白定位于细胞核。结论TAHCCP2基因可表达TAHCCP2蛋白且定位于细胞核。     

丙型肝炎患者血清中的交叉中和抗体

目的 分析HCV感染者血清中是否存在交叉反应性中和抗体.方法 以分泌表达HCV包膜E2蛋白真核表达质粒转染的293T 细胞培养上清液中的HCV E2蛋白作为检测抗原,建立检测HCV E2抗体的ELISA方法,检测48份HCV抗体阳性的慢性丙型肝炎患者血清,然后用免疫荧光分析血清与HCV全长包膜蛋白表达质粒转染的293T细胞的结合反应,再用5株HCV假病毒为模型分析阴性血清的病毒中和活性.结果 48份抗-HCV阳性血清中,E2抗体阳性血清达36份,阳性率75%.免疫荧光分析的结果与ELISA检测一致.HCV E2抗体阳性血清对5株HCV假病毒的感染性均有不同程度的中和作用,中和活性与E2抗体水平相一致.结论 丙型肝炎患者血清中存在交叉中和抗体,提示开发能诱导广泛交叉中和抗体的丙型肝炎疫苗或许具有可行性.     

丙型肝炎病毒融合蛋白及融合机制

丙型肝炎病毒（hepatitis C virus,HCV）属于黄病毒科、肝病毒属,是有包膜的单正链RNA病毒,其包膜糖蛋白E1、E2均位于病毒颗粒外表面,主要参与子代病毒颗粒的形成（如组装）及病毒新一轮感染（如细胞黏附、受体结合以及膜融合等过程）。目前研究认为,有包膜病毒均通过一个共同机制--膜融合将自身基因组输送至靶细胞,然后进行复制、转录与翻译、子代病毒组装与释放。经受体结合[如Ⅰ型人免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus,HIV-1）]、pH改变[如流感病毒、登革病毒（dengue virus,DENV）和塞姆利基森林病毒（Semliki forest virus,SFV）]或二者兼具（如鸟类肉瘤病毒、白血病病毒）的方式,与细胞膜或内体（endosome）膜发生融合[1]。本文将对近年来HCV E1、E2所介导的膜融合研究作一综述。     

丙型肝炎病毒核心蛋白、Bcl-2、P21Waf1在丙型肝炎中的表达及相互关系

目的调查丙型肝炎、肝硬化病人组织中的丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白、P21cl-2的表达以及相互间关系,探讨HCV核心蛋白是否抑制P21和促进Bcl-2表达.方法收集23例HCV表达阳性的肝炎、肝硬化组织,采用免疫组化Envision法检测核心蛋白、P21、Bcl-2表达,并用统计学方法分析三者间的表达关系.结果HCV核心蛋白和突变P21的阳性表达主要位于细胞核中,Bcl-2的阳性表达主要位于细胞质;HCV核心蛋白表达阳性组织中,P21阳性表达率仅13%,Bcl-2阳性表达率则达95.7%,三组间比较差异有显著性(P=0.012).HCV核心蛋白和Bcl-2二组间比较差异无显著性(P=0.561);HCV核心蛋白与Bcl-2、p21阳性强度两者间P值分别为0.012和0.2.结论三种蛋白的表达有相关性,HCV核心蛋白可能促进Bcl-2蛋白的表达,抑制P21蛋白表达.     

丙型肝炎病毒抗体与核心抗原检测的比较研究

丙型肝炎病毒（hepatitis C virus,HCV）是严重威胁人类健康的传染原之一,被称为“沉默杀手”,主要通过血液传播。据统计,全球已有1．7亿人受感染,我国HCV感染率约为3．2％,而多数HCV感染都是无症状的,少数表现为急性肝炎的患者,其症状也较甲型和乙型急性肝炎症状轻,由于其症状不明显,病情会在不知不觉中持续进展,且感染HCV后进展成慢性感染的几率很高,有较高比例的患者会发展成肝硬化、肝癌,因而丙型肝炎越来越受到医学界的重视。     

新基因丙型肝炎病毒核心蛋白结合蛋白6（HCBP6）的发现和研究

丙型肝炎病毒核心蛋白结合蛋白6（HCBP6）是成军教授课题组利用酵母双杂交技术首先发现的与丙型肝炎病毒核心蛋白结合的蛋白。课题组进一步发现HCBP6可以感受肝细胞内总胆固醇与甘油三酯水平变化并调节总胆固醇与甘油三酯水平。动物模型发现，HCBP6基因敲除小鼠在高脂饮食喂养下会出现糖脂代谢紊乱。课题组进一步发现韩国红参组分可通过调节HCBP6改善糖脂代谢，推动了含有该组分PTIB001治疗非酒精性脂肪性肝病的功能食品的问世。这些工作为基于PTIB001治疗NAFLD药物的研发提供了理论依据。     

TGF-β1中和抗体对TGF-β诱导的肌腱胶原产生和术后粘连形成的影响

目的 观察TGF-β1中和抗体对TGF-β诱导的肌腱细胞胶原产生及术后粘连形成的影响,探讨生物学调节在肌腱粘连防治中的作用.方法 取6只成年新西兰大白兔12条屈趾肌腱分离肌腱成纤维细胞、腱外膜细胞和腱内膜细胞,将细胞随机分成2组,实验组加入1 ng/mL TGF-β后,再加入不同浓度TGF-β1中和抗体,对照组不添加任何试剂,培养3 d后ELISA测定Col Ⅰ的产生.取84只兔行中趾屈趾肌腱切断吻合术,随机分成3组,腱鞘内分别注入生理盐水(NS组,n=36)、1.0 μg/mL TGF-β1中和抗体(1.0 μg/mL TGF-β1组,n=36)和2.0μg/mL TGF-β1中和抗体(2.0.μg/mLTGF-β1组,n=12).术后4、8周取出肌腱行肌腱粘连检测、生物力学测定、组织学观察和扫描电镜观察.1、2、4、8周后取出NS组及1.0 μg/mL TGF-β1组肌腱,原位杂交方法测定TGF-β1和Col Ⅰ mRNA的表达.结果 ELISA检测显示,TGF-β1能明显提高肌腱细胞Col Ⅰ的产生;TGF-β1抗体能降低肌腱成纤维细胞、腱外膜细胞和腱内膜细胞Col Ⅰ的产生,且呈剂量依赖关系.术后4、8周,NS组屈趾肌腱滑动距离较短,模拟主动屈曲度明显受限,与1.0μg/mLTGF-β1组和2.0μg/mL TGF-β1组比较差异均有统计学意义(P＜0.05);最大抗断裂载荷各组间比较差异无统计学意义(P＞0.05).扫描电镜和组织学观察结果显示,术后4、8周NS组胶原纤维排列紊乱,1.0 μg/mLTGF-β1组和2.0μg/mL TGF-β1组胶原纤维排列整齐.原位杂交结果显示,术后各时间点1.0μg/mL TGF-β1组TGF-β1 mRNA和Col Ⅰ mRNA表达水半均低于NS组,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 TGF-β1中和抗体能有效抑制TGF-β1在肌腱损伤修复中的作用,减少粘连形成.     

榄香烯对小鼠肝癌腹水瘤细胞系Hca-F25/CL-16A3的视网膜母细胞瘤抑癌蛋白及腺病毒E2启动子结合因子表达的影响

目的：探讨榄香烯对小鼠肝癌腹水瘤细胞系Hca-F25/CL-16A3治疗的作用机制。方法：将22只小鼠分成两组，对照组12只，治疗组10只。从荷瘤次日起，治疗组用榄香烯腹腔注射治疗，对照组用生理盐水治疗。20d后取瘤组织用免疫组织化学染色方法观察荷瘤小鼠两组肿瘤组织的视网膜母细胞瘤抑癌蛋白（pRB）和腺病毒E2启动子结合因子（E2F－1）蛋白的表达情况。结果：对照组肿瘤组织pRB阳性率为50％（6／12），用药组阳性率为100％（10／10），两组间差异有显著性（P＜0．05）。对照组和用药组E2F－1均呈阳性表达，表达率均为100％（12／12）和（10／10），两组间差异无显著性（P＞0．05）。结论：榄香烯对小鼠肝癌腹水瘤细胞系Hca-F25/CL-16A3有明显的抑制作用。其作用机制与pRB蛋白表达有关，与E2F－1无关。     

单核趋化蛋白-2中和抗体对骨癌痛大鼠脊髓背角磷酸化细胞外信号调节蛋白激酶表达的影响

目的 观察鞘内注射单核趋化蛋白-2(monocyte chemoattractant protein-2,CCL2)中和抗体后骨癌痛大鼠行为学的变化,并探讨其可能的镇痛机制. 方法 雄性SD大鼠32只,体重180～220 g,采用随机数字表法分为4组(每组8只):假手术+正常IgG组(I组),于大鼠左侧胫骨干骺端骨髓腔内注射10μl Hank's液;假手术+CCL2中和抗体组(Ⅱ组),于大鼠左侧胫骨干骺端骨髓腔内注射10μl Hank's液,在注射Hank's液后第7～9天鞘内注射CCL2中和抗体,每天1次,每次10μl,浓度为103 mg/L;骨癌痛+正常IgG组(Ⅲ组),于左侧胫骨干骺端骨髓腔内注射10 μl(1×107/ml)Walker 256肿瘤细胞;骨癌痛+CCL2中和抗体组(Ⅳ组),在注射肿瘤细胞后第7～9天鞘内注射CCL2中和抗体,每天1次,每次10μl,浓度为103 mg/L.观察造模前及术后1、3、6、7、8、9d大鼠机械缩足反射阈值(mechanical withdraw threshold,PMWT)和热缩足反射潜伏期(thermal withdraw latency,TWL)及脊髓背角磷酸化细胞外信号调节蛋白激酶1/2(phosphorylate extracellular signal-regulated kinases 1/2,p-ERK1/2)的表达. 结果 与Ⅰ组比较,Ⅲ组大鼠的PMWT和TWL在第6～9天明显下降,脊髓背角p-ERK1/2蛋白表达明显增加(P＜0.01);与Ⅲ组比较,Ⅳ组大鼠的PMWT和TWL在第6～9天明显上升(P＜0.01),脊髓背角p-ERK1/2蛋白表达明显下降(P＜0.01);Ⅰ组和Ⅱ组上述指标比较,差异无统计学意义(P＞0.05). 结论 鞘内注射CCL2中和抗体可以部分缓解骨癌痛大鼠的机械性和热痛觉超敏,这种效应可能与抑制p-ERK1/2的表达有关.     

DNA甲基转移酶1对胆管癌细胞中端粒酶的调控作用

目的 观察丙型肝炎病毒核心蛋白(HCVc)阳性肝内胆管癌细胞中人端粒酶逆转录酶(hTERT)的表达,并探讨DNA甲基转移酶1(DNMT1)对hTERT表达的影响.方法 将HCVc质粒瞬转入肝内胆管癌细胞株RBE,5-氮杂-2'-脱氧胞嘧啶核苷(AZA)处理转染后细胞;Western blot 法及逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测细胞中hTERT及DNMT1的mRNA及蛋白表达.结果 比较空白对照组,转染HCVc质粒后,RBE细胞株中hTERT及DNMT1的mRNA、蛋白水平分别上调3.457±0.081、1.684±0.020、1.826 ±0.060、2.513±0.119(P＜0.05);AZA处理转染后细胞可逆转hTERT的升高,mRNA和蛋白水平分别下调2.755±0.098、1.491±0.045(P ＜0.05).结论 DNMT1参与HCVc诱导的hTERT表达上调过程.     

荧光定量PCR检测肝胆癌组织内HCV RNA含量

目的：检测肝胆癌组织内丙型肝炎病毒（HCV）RNA表达。方法：收集手术切除的新鲜肝胆肿瘤组织标本共31例,其中胆道肿瘤14例,肝癌11例,肝硬化6例,采用荧光定量PCR方法检测HCV RNA含量;同时采用酶联免疫吸附法检测患者血清抗-HCV。结果：胆道肿瘤中无1例HCV RNA阳性,1例肝癌组织和1例肝硬化组织可检测到HCV RNA含量,且其相应的血清抗-HCV阳性。结论：胆道肿瘤组织内HCV RNA阳性率极低,目前尚难定论HCV就是胆管癌发生的危险因素之一。     

HCV核心蛋白通过LXRα核受体介导HepG2细胞甘油三酯合成增加

目的：观察丙型肝炎病毒（HCV）的核心蛋白（core）对肝细胞甘油三酯（TG）合成的影响。方法将HCV 1b基因型core表达载体pcDNA3.1-myc/his（-）-core1b和HCV 3a基因型core表达载体pcDNA3.1-myc/his（-）-core3a分别转染至HepG2细胞,利用定量测定法检测细胞内TG含量,用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应法（real time qPCR）、蛋白免疫印迹（Western blot）方法观察脂质合成相关基因肝X受体α（LXRα）、甾醇调节元件结合蛋白1c（SREBP1c）和脂肪酸合酶（FASN）的mRNA和蛋白的表达变化,并进行比较分析。结果 HepG2细胞转染两个基因型HCV core表达载体之后均能显著增加细胞内的TG含量（P＜0.05）,尤以基因型core3a组为差异更显著（P＜0.001）。Real-time PCR结果显示,两个基因型core均上调LXRα的mRNA水平（P＜0.05）,基因型core3a组差异更为显著（P＜0.01）;FASN的mRNA水平只在仅在基因型core3a组上调（P＜0.05）,而基因型core1b组差异无统计学意义。Western blot结果显示,HCV core表达可以明显上调表达可以显著上调SREBP1c的蛋白水平,尤其基因型core3a组更为显著。对FASN蛋白水平,基因型core3a上调其表达,但基因型core1b组无明显变化。结论 HCV可能通过LXRα介导肝细胞内的脂质合成诱导肝脂肪变,有待进一步研究。     

NF-κB p65介导的前列腺素E2分泌及DNA结合抑制因子2蛋白表达在促进大鼠桡骨骨折早期愈合的作用

目的骨再生过程包含一系列复杂的分子信号途径,通过探讨NF-κB作为骨折愈合过程中"关键性激活点"的可能性,为基因治疗骨折延迟愈合和骨不连提供实验依据。方法取6～7周龄Wistar雄性大鼠33只,体重180～220 g,随机分为4组。对照组(A组,n=3)、单纯NF-κB抑制剂Bay 11-7082处理组(B组,n=6):分别在大鼠右前肢桡骨中下段经皮注射0.3 mL生理盐水或含50μmol/L Bay 11-7082的生理盐水,每天1次,持续至处死。单纯骨折组(C组,n=12)、Bay 11-7082干预骨折组(D组,n=12):制备右侧桡骨中下段骨折模型后,C组不作任何处理,D组处理方法同B组。观察大鼠一般情况,A组于注射后7 d,B、C、D组于注射后3、7 d取标本行ALP活性、前列腺素E2(prostaglandins E2,PGE2)含量检测以及Western blot检测NF-κB p65、BMP-7和DNA结合抑制因子2(inhibitor of DNA binding 2,Id2),并取C、D组14、28 d标本行HE染色观察。结果各组大鼠均存活至实验完成。注射后3、7 d B组ALP活性及PGE2含量与A组比较,差异均无统计学意义(P>0.05);C组较A组增高,D组较A组降低,差异均有统计学意义(P<0.01)。注射后3、7 d,各组骨折端组织中均见NF-κB p65、BMP-7、Id2表达,B组各因子表达水平与A组比较,差异均无统计学意义(P>0.05);C组NF-κB p65和BMP-7蛋白表达水平较A组增高,Id2蛋白表达水平较A组降低,差异均有统计学意义(P<0.01);D组NF-κB p65、BMP-7蛋白表达水平较A组降低,Id2蛋白表达较A组增高,差异均有统计学意义(P<0.01)。组织学观察示,注射后14、28 d C组骨折端组织见大量骨性骨痂,而D组28 d时才见骨性骨痂。结论 NF-κB p65可通过调控PGE2分泌以及BMP-7和Id2蛋白表达促进大鼠桡骨骨折的早期愈合。     

Polymorphism of C-terminal activation region 2 of Epstein-Barr virus latent membrane protein 1 in predicting distant failure and post-metastatic survival in patients with nasopharyngeal carcinoma

BACKGROUND: The C-terminal activation region 2 (CTAR2) of Epstein-Barr virus latent membrane protein 1 is the major site that correlates with metastasis-related signaling pathway. The variation of CTAR2 sequence may affect the incidence of distant metastasis in patients with nasopharyngeal carcinoma (NPC). METHODS: Two hundred forty-nine specimens from consecutive patients with nonmetastatic NPC were collected. Amplification by polymerase chain reaction and sequence analysis of CTAR2 were performed. DNA sequence identical to the Cao strain was grouped as Cao CTAR2, whereas sequences differing from Cao made up non-Cao CTAR2. Clinical characteristics and CTAR2 status were subjected to statistical analysis for distant metastasis. RESULTS: Non-Cao CTAR2 was associated with a statistically significant lower distance metastasis and superior survival rate. A combination of clinical stage and CTAR2 expression provided an accurate method of identifying high risk of metastasis. CONCLUSION: NPC patients with non-Cao CTAR2 were less likely to have metastasis develop than those characterized by Cao CTAR2.     

Reduced specificity of Erns antibody ELISAs for samples from piglets with maternally derived antibodies induced by vaccination of sows with classical swine fever marker vaccine CP7_E2alf

Successful implementation of marker vaccines against classical swine fever virus is dependent on a reliable accompanying diagnostic assay that allows differentiation of infected from vaccinated animals (DIVA ) as well as the development of a testing scheme during emergency vaccination. In this context, special attention needs to be paid to breeding farms, because the offspring of marker vaccinated sows possess maternally derived antibodies (MDA s). So far, limited information is available on the influence of MDA s on serological testing in the context of a DIVA strategy. Therefore, two commercially available E^rns antibody ELISA s were compared, using serum samples of piglets with a high‐to‐moderate titre of MDA s against marker vaccine CP 7_E2alf. False‐positive results were detected by both E^rns antibody ELISA s for serum samples of piglets with an age of up to 4 weeks. Interestingly, most samples tested false‐positive in the first E^rns antibody ELISA were identified correctly by the other E^rns antibody ELISA and vice versa. In conclusion, in case of emergency vaccination of sows, the specificity of both ELISA s in newborn piglets younger than 4 weeks may be relatively low. This could be addressed in a testing strategy by either not sampling piglets up to the age of 4 weeks or using both ELISA s in a screening‐confirmation set‐up.     

乙型肝炎病毒感染孕妇替比夫定母婴阻断及其对婴儿乙肝疫苗免疫应答的影响

目的探讨高病毒载量乙型肝炎病毒(HBV)感染的孕妇应用替比夫定行母婴阻断疗效,及其对乙肝疫苗免疫应答的影响。方法回顾性收集2017年10月1日至2019年12月30日于首都医科大学附属北京地坛医院产检并分娩的慢性HBV感染202例孕妇及其分娩婴儿,选取孕中期HBV DNA>2.0×105 IU/ml的孕妇,其中132例孕中晚期给予替比夫定行抗病毒治疗者为研究组,未服用抗病毒药物的70例孕妇中剔除3例母婴阻断失败者为对照组(67例)。两组孕妇所产新生儿出生后2 h内均给予乙肝疫苗10μg及100 IU乙肝免疫球蛋白,出生后1个月、6个月常规给予10μg乙肝疫苗免疫接种。采用微粒化学发光法检测1岁婴儿乙型肝炎病毒表面抗体(HBsAb)水平,采用非参数秩和检验比较两组婴儿对乙肝疫苗的免疫应答。两组孕妇及其新生儿呈正态分布的计量资料采用独立样本t检验,非正态分布的计量资料采用非参数检验;计数资料采用Pearson卡方检验或连续校正卡方检验进行分析。结果入组202例孕妇中,服用替比夫定者与未服用者母婴阻断失败率[0(0/130)vs.4.29%(3/70)]差异有统计学意义(χ^(2)=5.74、P=0.017)。研究组和对照组孕妇年龄(t=-1.62、P=0.110)、孕次(t=0.27、P=0.787)、产次(t=1.325、P=0.187)、体重(t=0.55、P=0.580)、孕中期丙氨酸氨基转移酶(ALT)(Z=-0.19、P=0.85)及HBV DNA载量(t=0.49、P=0.620)、剖宫产率(χ^(2)=0.71、P=0.400)及孕产期并发症等差异均无统计学意义。研究组和对照组孕妇分娩前HBV DNA载量[(3.74±0.78)lgIU/ml vs.(7.29±0.71)lgIU/ml]差异有显著统计学意义(t=31.88、P<0.001)。两组孕妇所产新生儿出生孕周(t=1.72、P=0.090)、身长(t=0.39、P=0.696)、出生体重(t=-0.13、P=0.90)、性别(χ^(2)=0.25、P=0.620)、Apgar评分(t=0.213、P=0.832)、1岁时体重(t=-0.20、P=0.840)、ALT(Z=-0.40、P=0.690)及HBsAb水平(Z=0.76、P=0.450)差异均无统计学意义。研究组孕妇所产婴儿1岁时对乙肝疫苗免疫无应答率、弱应答率和强应答率分别3.79%(5/132)、22.73%(30/132)和73.48%(97/132);对照组分别为0(0/67)、14.93%(10/67)和85.07%(57/67),差异无统计学意义(Z=-1.93、P=0.054)。结论替比夫定可显著降低HBV感染孕妇的HBV DNA载量,提高母婴阻断成功率;孕期应用替比夫定抗病毒治疗不影响婴儿对乙肝疫苗的免疫应答。