胃癌耐药细胞EXOs的提取鉴定及可能存在的耐药信息传递作用的初步探讨

目的:探讨胃癌耐药细胞（SGC7901/Adr）分泌的外泌体（exosomes,EXOs）在细胞间可能存在的耐药信息传递作用。方法:选用胃癌亲本细胞SGC7901及其阿霉素耐药细胞SGC7901/Adr为模型,用PEG方法提取EXOs;透射电子显微镜观察鉴定细胞EXOs形态;Western Blot检测CD9、CD63、TSG101、Calreticulin以及P-糖蛋白（P-gp）的表达;运用激光共聚焦显微镜观察胃癌SGC7901和SGC7901/Adr细胞及加入阿霉素耐药细胞SGC7901/Adr外泌体处理后的敏感细胞内阿霉素药物浓度变化。结果:透射电子显微镜下观察到,胃癌SGC7901和SGC7901/Adr细胞来源的EXOs为直径在30~100 nm之间的囊性小泡,呈圆形或椭圆形,大小均匀一致。Western Blot检测胃癌SGC7901和SGC7901/Adr细胞来源的EXOs,携带有外泌体生物标记分子CD9（四次跨膜分子）、CD63（四次跨膜分子）以及TSG101表达,Calreticulin为阴性表达。进一步检测发现在SGC7901/Adr细胞来源的EXOs中存在P-gp蛋白表达。经过阿霉素耐药细胞SGC7901/Adr外泌体处理后的敏感细胞,胞内可见阿霉素聚集减少,核区分布减少,荧光强度减弱。结论:胃癌耐药细胞分泌的EXOs可能通过传递P-gp蛋白的形式,具有传递耐药信息的作用。     

RPL6/Taxreb107在胃癌耐药细胞系SGC7901/ADR中的差异表达及其与MDR相关性的初步研究

目的 探讨BPL6／Taxreb107在胃癌耐药细胞系SGC7901／ADR与胃癌细胞系SGC7901的差异表达,以及与胃癌多药耐药(MDR)的相关性。方法 提取SGC7901和SGC7901/ADR细胞系总RNA;采用内对照RT-PCR检测RPL6基因和Northem杂交、基因克隆与表达、真核表达载体的构建;以电穿孔法基因转染;以流式细胞仪检测瞬时转染细胞的阿霉素蓄积和潴留。结果 内对照RT-PCR和Northern杂交证实RPL6/Taxreb 107在SGC7901/ADR中高表达。将PCR产物克隆人pUCm-T载体并经测序证实。构建正义和反义真核表达载体(pcDNA3．1)并经酶切鉴定证实后,以电穿孔法将正义真核表达载体转入SGC7901,反义真核表达载体转入SGC7901／ADR。转染48h后检测转染细胞的阿霉素蓄积和潴留,结果提示RPI6／Taxreb107转入细胞后对细胞的耐药性有影响。结论 BPI6／Taxreb107在耐药胃癌细胞中高表达,对胃癌的MDR有影响。     

胃癌单克隆抗体MG7相关抗原的初步分析

国内外研究表明应用单克隆抗体技术可能建立一种特异、敏感、快速的胃癌诊断方法。近年来,第四军医大学西京医院建立了10余株抗不同组织学类型胃癌的克隆杂交株。ABC免疫组化技术及阳性扫描研究提示该组单克隆抗体有较大的应用价值。初步研究表明:抗胃癌单克隆抗体MG_7的相关抗原可能为中性糖脂。本室应用糖脂的免疫染色技术(Immunostaining)对MG_7的相关糖脂抗原作了初步分析。     

胃癌单克隆抗体—柔红霉素结合物的制备及其细胞毒作用

柔红霉素(Daunomycin,DNR)是一种广谱抗癌药物。由于它对心肌、骨髓等正常组织有毒性作用而常常发生严重的毒副反应,使临床应用受到很大限制。应用抗肿瘤单克隆抗体与抗癌药交联制备免疫抗癌药,不仅可提高肿瘤组织中的药物浓度,且可减少毒副反应。     

锌带基因ZNRD1在胃癌耐药细胞中的表达和功能

目的 探讨锌带基因ZNRD1在多药耐药胃癌细胞中的表达和作用。方法 应用Northern blot和半定量RT—PCR,观察锌带基因ZNRD1在胃癌细胞SGC7901及其长春新碱(VCR)诱导的耐药细胞SGC7901／VCR中的表达;将反义核酸转染SGC7901／VCR细胞,通过免疫组化检测转导细胞与非转导细胞ZNRD1蛋白的表达;以流式细胞仪检测细胞周期的变化,以MTT实验检测细胞生长曲线和对VCR、阿霉素(ADM)的药敏性。结果 胃癌耐药细胞SGC7901／VCR与非耐药细胞相比,ZNBDl基因的表达明显增高。转导株antiZNRDl—SGC7901／VCR细胞的ZNRD1蛋白水平明显低于非转导株,C1期细胞比例增加而S期比例减少,生长受到抑制,且对VCR、ADM的敏感性明显增高。结论 胃癌耐药细胞与非耐药细胞相比,ZNRDl基因处于高表达状态。反义核酸转染可有效阻断ZNRDl蛋白的表达,在一定程度上逆转人胃癌耐药细胞SGC7901／VCR的多药耐药性。     

胃癌多药耐药细胞端粒酶活性变化及其机制探讨

目的：探讨人胃腺癌细胞系SGC7901及其多药耐药亚系SGC7901／VCR中端粒酶活性变化及其机制，为胃癌多药耐药机制研究提供新靶点。方法：采用TRAP银染方法检测SGC7901和SGC7901／VCR中端粒酶的活性；应用反转录聚合酶链反应（RT—PCR）技术检测SGC7901和SGC7901／VCR中端粒酶hTERT、Madl及c—myctuRNA的表达；将hTERT启动子构建的报告基因质粒（pGL3B—TRTP），转染入SGC7901和SGC7901／VCR中，应用双荧光素酶报告基因检测系统（Dual—Luciferasereporterassaysystem）检测端粒酶hTERT启动子的活性。结果：SGC7901／VCR细胞中的端粒酶活性及端粒酶hTERTmRNA表达均显著高于SGC7901细胞，且SGC7901／VCR中hTERT启动子的活性显著高于SGC7901，在SGC7901／VCR中捡测到c—mycmRNA的表达，但未检测到MadlmRNA的表达，而在SGC7901细胞中分别检测到MadlmRNA和c—mycmRNA的表达，且SGC7901细胞中c—mycmRNA的表达也高于SGC7901／VCR。结论：端粒酶活性及端粒酶hTERT转录水平升高与胃癌细胞的多药耐药性密切相关，转录因子Madl／c—myc的表达高低是其作用机制之一。     

不同mRNA差异显示法筛选胃癌细胞耐药相关基因的研究

 目的　比较银染和放射自显影mRNA差异展示方法在分离、克隆胃癌细胞耐药相关基因过程中的优缺点。方法　长春新硷诱导人胃癌SGC790 1细胞 ,建立稳定的耐药细胞亚系SGC790 1/VCR。同时应用银染和放射自显影的mRNA差异展示方法筛选胃癌SGC790 1细胞和耐药细胞亚系SGC790 1/VCR之间mRNA表达的差异。结果　显示银染法省时 ,花费少 ,操作方便 ;在获得差异条带方面放射自显影法明显优于银染法 ,且其能得到较多低丰度的差异表达基因 ;而两者在二次PCR扩增 ,克隆 ,测序 ,杂交鉴定及假阳性率方面无明显差异。结论　银染mRNA差异展示法适合于高丰度差异表达基因的快速筛选 ,而放射自显影mRNA差异展示则能较彻底地显示两种细胞中多数mRNA的差异     

胃癌单克隆抗体MGd1,CEA在胃癌的免疫组化观察

本文应用胃癌单克隆抗体MG d_1检查了100例不同组织类型的胃癌及非癌性胃粘膜,并与CEA单克隆抗体检查对比,以探讨胃癌单克隆抗体MG d_1与CEA在胃癌中表达的特征及其意义。     

蛋白激酶C同工酶PKC-α及PKC-βⅠ在胃癌及其耐药细胞中的表达和功能

目的：探讨蛋白激酶C（PKC）不同的同工酶亚型在胃癌细胞多药耐药中的作用。方法应用免疫组织化学、激光共聚焦显微镜及Western blot,观察传统型PKC（cPKCs)的PKC-α与PKC－βⅠ在胃癌细胞SGC7901及其不同剂长春新碱（VCR0．3,0．7,1．0mg/L)诱导的耐药细胞SGC7901／VCR中的表达与分布;以阿霉素（AMD）为指示剂,通过流式细胞仪检测PKC-αP与PKC－βⅠ的相应抗体对SGC7901／VCR细胞内药物蓄积浓度的影响。结果（1）KC-α在SGC7901呈阳性表达;在SGC7901／VCR呈强阳性,其表达强度随耐药剂量的增加而呈增加趋势。（2）PKC－βⅠ在SGC7901及其不同耐药剂量的耐药细胞SGC7901／VCR中均呈弱阳性有表达,相互之间差异无显著性。（3）以ADM为荧光指示剂,通过流式细胞仪检测显示,SGC7901／VCR细胞内药物浓度比SGC7901明显降低,并且随耐药剂量的增加而呈逐渐减少趋势;SGC7901／VCR细胞内药物浓度比SGC7901明显降低,并且随耐药剂量的增加而呈逐渐减少趋势,SGC7901／VCR与抗PKC-α抗体共同孵育后,其细胞内ADM蓄积增加,而与抗PKC－βⅠ抗体共同孵育后,其细胞内ADM浓度无明显变化。结论胃癌细胞SGC701／VCR的耐药机制可能与PKC-α有关,而与PKC－βⅠ无明显相关性。     

胃癌多药耐药表达与凋亡指数相关性

目的：研究多药耐药（multidrug resistance,MDR)基因表达与凋亡指数（apoptosis index,AI)在胃癌中的表达及与预后的关系,探讨它们之间相关性。方法：应用抗鼠抗人P-gp。GST-π和拓扑异构酶Ⅱ（topoisomeraseⅡ,ToPoⅡ）单克隆抗体对80例胃癌进行免疫组化研究,用Tunel法测定细胞凋亡指数。结果：AI、P-糖蛋白（P-glycoprotein,P-gp)表达与临床分期呈正相关（P＜0.05),谷胱甘肽转移酶π（glutathione-s-transferase-π,GST-π）表达强度与生存期相关（P＜0.05),ToPoⅡ表达与组织分化程度相关（P＜0.05),其中P-gp表达与GST-π高度相关（P＞0.01)。GST-π与ToPoⅡ表达相关（P＜0.05),而细胞凋亡指数与MDR表达不相关（P＞0.05)。结论：MDR基因产物表达（P-gp,GST-π和ToPoⅡ）具相关性,但与Al不相关。MDR表达可能由一系列相同基因组调控,而细胞凋亡则可能属于不同基因调控系列。     

miR-187通过抑制胃癌细胞凋亡影响胃癌多药耐药

目的:探讨miR-187对胃癌多药耐药的影响。方法:应用qPCR检测miR-187在胃癌SGC7901细胞和SGC7901ADR细胞中的表达。miR-187 mimics转染上述细胞,MTT检测转染后细胞对多种化疗药物的敏感性,流式细胞仪检测细胞凋亡。结果:SGC7901ADR细胞中miR-187的表达明显高于SGC7901细胞。MTT实验显示转染miR-187 mimics后胃癌细胞对化疗药物的敏感性均明显降低(P＜0.05)。流式细胞检测表明miR-187 mimics转染可以减少SGC7901细胞的凋亡(P＜0.05)。结论:miR-187通过抑制胃癌细胞凋亡参与胃癌多药耐药,可能成为逆转胃癌多药耐药的新靶点。     

胃癌耐药细胞株SGC-7901/5-FU的建立及其耐药机制的初步探讨

目的构建耐5-FU的胃癌耐药细胞株,初步探讨细胞发生5-FU耐药的可能机制.方法 通过药物耐药间歇冲击并浓度梯度递增法诱导建立胃癌耐药细胞株SGC-7901/5-FU.应用MTT法检测亲代细胞对4种化疗药物的IC50并计算耐药指数(RI).通过MTT法绘制细胞的生长曲线计算细胞倍增时间.流式细胞仪分析细胞周期分布.RT-PCR检测抑癌基因P53、癌基因Bcl-2、促凋亡基因半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶-3(caspase-3)、死亡相关蛋白激酶(death associated protein kinase,DAPK)家族成员(DAPK-1、DAPK-2、DAPK-3)、多药耐药蛋白(multidrug resistance proteins,MRP)亚家族中的MRP-6、多药耐药基因1(multidrug resistance 1,MDR1)、切除交叉互补修复基因(excision repair cross-complementing 1,ERCC-1)的表达.Western Blot检测MDR1 编码的P糖蛋白(P-gp)的表达水平.结果SGC-7901/5-FU对5-FU、顺铂、环磷酰胺的耐药指数分别为6.26、3.71、5.25.SGC-7901与SGC-7901/5-FU细胞倍增时间分别为(30.82±1.46)h和(46.01±4.15)h,SGC-7901/5-FU细胞增殖速率显著变缓(P＜0.05).与亲代细胞比较,耐药子株S期细胞显著减少,G0/G1期细胞则显著增高(P＜0.01),而G2/M期细胞无显著差异(P＞0.05).耐药子株SGC-7901/5-FU细胞MDR-1、MRP-6、DAPK-3和P-gp表达显著上调(P＜0.01),而ERCC-1、caspase-3、P53、DAPK-1、DAPK-2、Bcl-2的表达均无显著变化(P＞0.05). 结论成功构建胃癌耐5-FU细胞株SGC-7901/5-FU,其对顺铂、环磷酰胺具有交叉耐药,耐药机制与细胞周期S期细胞比例减少、G0/G1期细胞比例升高有关,可能与MDR-1、MRP-6、DAPK-3基因及P-gp蛋白表达上调有关.     

胃癌单克隆抗体在胃癌及胃粘膜上皮异型增生的诊断意义

用胃癌单克隆抗体免疫标记胃肠及胃粘膜上皮异形增生国内、外报道较少。我科从1987年始用胃癌单抗(MGD_1)对90例胃癌及60例胃粘膜上皮异形增生进行了免疫标记研究。材料和方法 (一)试剂:胃癌单克隆抗体(MGD_1)     

抗p16单克隆抗体的制备及鉴定

目的：制备抗Ｐ１６单克隆工进行鉴定。方法：以Ｐ１６合成肽为抗原免疫纯系小鼠。利用杂交瘤技术制备单克隆抗体,并利用亲和层析等法纯化抗体。通过酶免疫测定及免疫印迹等法对单克隆抗体进行分析及鉴定,并通过免疫组化方法与进我克隆抗体进行比较。结果：获得４株稳定分泌抗Ｐ１６单克隆抗体杂交瘤株,与进口多克隆坑体比较,检测阳性及阴性符合率达１００％,但使用单克隆抗体时,组织切片不需进行抗原修复,染色效果稳定。结论     

人源性抗肝癌单克隆抗体的制备及初步鉴定

目的建立产生人源性抗肝癌单克隆抗体的人-鼠杂交瘤.方法用IL-2和美洲商陆(PWM)体外刺激肝癌病人外周血淋巴细胞,再与小鼠骨髓瘤细胞NS-1融合,待杂交瘤生长进行筛选、克隆化及特性分析.结果建立了3株产生人源性抗肝癌单克隆抗体的人-鼠杂交瘤-AF3,CB7、CH1.三种单抗均识别肝癌细胞表面抗原,并具有显著的补体依赖的细胞毒活性.其中AF3的效价最高.结论通过人-鼠杂交瘤技术获得了产生人源性抗肝癌单克隆抗体的杂交瘤细胞系.抗体效价高,是一种较理想的单克隆抗体.     

PTEN表达与胃癌多药耐药的相关性研究

目的探讨PTEN、P-gp在胃癌中的表达及相关性,探讨PTEN参与胃癌多药耐药性的可能机制。方法采用免疫组化SP法检测51例胃癌标本中正常、癌旁、癌组织中PTEN及P-gp的表达。结果胃癌组织中PTEN阳性表达率显著低于癌旁及正常组织(P<0.05);胃癌组织中P-gp阳性表达率明显高于正常组织(P<0.05);胃癌组织中PTEN的表达与P-gp表达呈负相关(r=-0.42,P<0.05)。结论 PTEN的失活可能与胃癌的发生发展相关,同时可能使P-gp的表达上调而参与胃癌的多药耐药。     

胃癌MG7单克隆抗体的免疫电镜研究

早期胃癌的病变特点、临床治疗和预后都有别于进展期胃癌。目前,单从组织学上还难确定癌前病变何时转化为原位癌。随着细胞杂交瘤技术的出现和应用,国内外已有多株胃癌单克隆抗体产生的报告。用单克隆抗体对胃癌组织进行免疫组化研究,对于认识胃癌的生物学特性,识别组织病理不易确诊的早期胃癌有重要意义。我们用胃癌MG_7单克隆抗体,对29例胃癌活检组织进行了免疫电镜研究,观察其相应抗原物质在不同类型胃癌组织内的分布形式和含量,探讨不同类型胃癌的生物学特性改变,协助