裂谷热病毒Gn蛋白主要抗原区的表达、纯化及抗原性分析

目的 通过原核表达系统制备裂谷热病毒Gn片段主要抗原区蛋白,获取纯化蛋白,并分析抗原性。方法 将合成的裂谷热Gn基因用PCR的方法扩增具有保护性抗原表位的两段Gn1和Gn2,并将其定向插入原核表达质粒pColdⅠ中,构建重组表达质粒pColdⅠ-Gn1和pColdⅠ-Gn2,并将重组质粒转化到BL21(DE3)感受态中,以IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析表达蛋白和表达量,并利用His-tag Ni柱进行亲和层析纯化,Western-blot鉴定表达蛋白。结果 所构建的质粒pColdⅠ-Gn1和pColdⅠ-Gn2序列正确,SDS-PAGE检测到目的蛋白,Western-blot显示截断的Gn蛋白具有很好反应原性。结论 成功纯化了裂谷热病毒Gn主要抗原区的表达蛋白。     

埃博拉病毒科特迪瓦型核蛋白的原核表达及纯化

目的通过原核表达获得埃博拉病毒科特迪瓦型的重组核蛋白,并将蛋白纯化。方法将合成的埃博拉病毒科特迪瓦型核蛋白基因亚克隆入原核表达质粒pET-28（a）中,构建重组表达质粒pET-28（a）-C-NP,并将重组质粒转化BL21（DE3）感受态细菌,以IPTG诱导蛋白表达,SDS-PAGE分析表达蛋白及表达量,并用利用His-Band Ni＋柱进行亲和层析纯化,Western blot和蛋白序列分析鉴定表达蛋白。结果所构建的重组表达质粒pET-28（a）-C-NP序列正确,SDS-PAGE检测到目的蛋白表达,表达蛋白正确。结论成功表达并纯化了埃博拉病毒科特迪瓦型核蛋白,为后续研究奠定了基础。     

狂犬病病毒P基因的原核表达及间接ELISA方法的应用

目的以狂犬病病毒P蛋白作为检测抗原,用间接ELISA方法检测狂犬病病毒抗体。方法根据GenBank发表的狂犬病病毒(Rabies Virus,RV)LEP-Flury株的基因序列设计引物,通过RT-PCR扩增出P基因的全长序列,克隆于pGM-T载体中,获得重组质粒pGM-T-P,将重组质粒用限制性内切酶NotI和EcoRI进行双酶切,酶切产物定向克隆于原核表达载体pET-32a(+)中,构建原核重组表达质粒pET-32a-P,阳性重组质粒转化原核表达宿主菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达。SDS-PAGE和Western-blot分析确定蛋白表达量和特异性。用纯化的蛋白作为诊断抗原,通过对反应条件的优化,初步将间接ELISA方法应用于狂犬病病毒抗体的检测中。结果扩增RV P基因,构建了克隆质粒pGM-T-P、原核表达质粒pET-32a-P,高效表达了主要以可溶性形式存在的P蛋白,并能与RV阳性血清发生特异性反应。用表达的狂犬病病毒重组P蛋白建立了用于RV抗体检测的间接ELISA方法。结论成功表达了磷蛋白,用其作为固化抗原以间接ELISA方法检测RV抗体。     

乙型脑炎病毒膜蛋白B区多肽抗原的表达、纯化及血清学评价

目的在原核表达系统中对乙型脑炎病毒包膜糖蛋白(E蛋白)的B区多肽抗原进行高效表达、纯化及血清学评价。方法利用PCR技术从乙脑减毒活疫苗中扩增编码B区的DNA片段,酶切消化后连接到表达载体pET22b上,用此连接产物转化大肠埃希菌BL21(DE3)并表达B区多肽抗原,表达产物经液相层析纯化;用乙脑病人血清对纯化后的B区多肽抗原进行评价。结果重组质粒pET22b-JEB经双酶切,其插入的外源基因片段为372 bp,与预期DNA片段大小一致。将纯化前与纯化后的蛋白作SDS-PAGE电泳,均可见一条约16kD的外源基因蛋白带,与计算的相对分子质量相符。经WB和ELISA血清学评价,表明重组B区多肽抗原具有较高的灵敏性及特异性。结论成功构建了表达载体pET22b-JEB,在原核系统中表达的B区多肽抗原具有良好的血清学检测价值。     

细粒棘球绦虫(中国大陆株)诊断抗原P-29基因的表达、纯化及免疫原性初步分析

目的对细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus,Eg)诊断抗原P-29(diagnostic antigen P-29)重组质粒进行原核表达、纯化,并初步分析重组蛋白的免疫原性。方法从重组质粒EgP-29/pGEM-T中获取诊断抗原P-29基因,亚克隆于表达载体pET-28a构建基因工程菌株,并表达、纯化重组蛋白,经Western-blot、ELISA分析重组蛋白的免疫原性。结果成功构建原核重组表达载体EgP-29/pET-28a/BL21(DE3)plysS,并纯化出浓度较高的重组蛋白。ELISA检测显示,用表达、纯化的重组蛋白免疫小鼠,诱导产生了特异性抗体IgG,Western-blotting鉴定该抗体能识别重组抗原及天然抗原原头蚴。结论重组蛋白具有良好的免疫原性。     

GⅡ.2型诺如病毒VP1蛋白原核表达及蛋白纯化

目的利用原核表达系统,表达了GⅡ.2型诺如病毒VP1蛋白,优化诱导条件并进行蛋白的纯化。方法扩增诺如病毒的VP1基因,克隆至pET32a(+)载体,构建重组质粒pET32a-VP1。将pET32a-VP1转化至大肠埃希菌BL21(DE3),加入IPTG进行诱导表达并优化诱导条件。利用His标签镍离子蛋白纯化柱纯化表达蛋白,SDS-PAGE电泳鉴定蛋白纯度。结果成功扩增大小为1 659 bp的诺如病毒VP1基因。PCR检测重组质粒pET32a-VP1构建成功。将重组质粒转化至BL21(DE3),IPTG诱导表达70×10~3的VP1重组蛋白,优化的最佳诱导表达条件为37℃,0.6 mmol/L IPTG诱导5 h。重组蛋白以包涵体的形式表达,并SDS-PAGE鉴定镍柱纯化产物为单一电泳条带的目的蛋白。结论利用原核表达系统成功构建了重组质粒pET32a-VP1,并表达纯化了诺如病毒VP1重组蛋白,为单克隆及多克隆抗体的制备、检测试剂盒以及新型疫苗的研发奠定了基础。     

肺孢子虫（菌）p55抗原嵌合基因的克隆及表达产物分析

目的构建肺孢子虫（菌）p55蛋白嵌合基因的原核表达载体,分析、鉴定及纯化表达产物。方法自NCBI网站的蛋白数据库中获取p55抗原及4个变异体信息,运用生物信息学方法预测可能的抗原表位,设计包含多个可能抗原表位的多肽,根据遗传中心法则及大肠杆菌密码子偏好性进行密码子优化,将氨基酸序列转化为核苷酸序列,将人工合成的嵌合基因（CAG）片段连接到质粒pGEX-6p-1（含GST标签）上,构建原核表达载体pGEX-6p-1/CAG,酶切、测序鉴定。pGEX-6p-1/CAG转化大肠杆菌,异丙基-β-D硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达重组融合蛋白CAG-GST。表达产物用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）及Western-blotting分析鉴定。结果双酶切及测序结果显示重组质粒pGEX-6p-1/CAG构建成功。SDS-PAGE显示重组融合蛋白相对分子量约为69 000。Western-blotting结果显示,表达的融合蛋白为CAG-GST。结论成功构建表达p55蛋白嵌合基因的原核表达载体pGEX-6p-1/CAG,建立表达重组蛋白的原核表达系统。     

狂犬病病毒基质蛋白的原核表达及其间接ELISA方法的建立

目的以原核表达的狂犬病病毒M蛋白作为检测抗原,建立间接ELISA方法用来检测狂犬病病毒抗体。方法为表达狂犬病病毒(RV)基质蛋白(M),采用RT-PCR方法从狂犬病病毒Flury-LEP株中扩增RV基质蛋白基因,双酶切后定向克隆至原核表达载体pET-32a(+),构建重组质粒pET-M。将重组质粒pET-M转化至宿主菌E.coli Rosetta中进行表达。SDS-PAGE和Western blot分析确定蛋白表达量和特异性。用纯化的重组M蛋白作为包被抗原建立检测犬RV抗体的间接ELISA方法,通过优化反应条件,确定抗原最佳包被量、血清的最佳稀释度、Protein A-HRP的最佳稀释度。结果经PCR、双酶切及测序鉴定,重组质粒pET-M构建成功,将重组质粒进行转化后诱导表达,经SDS-PAGE电泳分析得到高效表达的M蛋白,重组蛋白可被RV阳性血清特异性识别,表明基质蛋白具有良好的反应原性。用表达的狂犬病病毒M蛋白建立了检测RV抗体的间接ELISA方法,用该间接ELISA方法与以狂犬病病毒作为诊断抗原的商品化ELISA试剂盒分别对93份临床血清样品进行检测,结果两者的符合率为89.2%。结论用原核表达的重组M蛋白作为包被抗原建立的间接ELISA方法可用做检测犬RV抗体水平的参考。     

弓形虫致密颗粒蛋白GRA8截短型片段在原核中的表达

目的 构建弓形虫GRA8原核重组表达质粒，分析其表达状况。 方法 采用PCR技术扩增GRA8及其截短型片段的基因序列，经克隆后，亚克隆至原核表达载体中，构建GRA8及其截短型片段的重组表达质粒，分析GRA8的表达；将各重组菌进行诱导，将裂解上清用谷胱甘肽-琼脂糖亲合层析法和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)纯化目的蛋白，免疫印迹法(Western blotting)分析纯化蛋白的活性。 结果 GRA8基因被正确插入原核表达质粒中，原核重组表达质粒在大肠埃希菌JM109中表达GRA8的水平低，几乎无完整GRA8的表达，截短型GRA8经谷胱甘肽-琼脂糖亲合层析法和SDS-PAGE获得纯化。纯化的截短型GRA8能被弓形虫感染兔血清识别。 结论 GRA8的原核重组表达质粒表达GRA8的水平低，纯化的截短型GRA8具一定的抗原反应性。     

登革热病毒Ⅰ型外膜蛋白DⅢ区的克隆、表达及重组蛋白的应用

目的选取DVⅠ外膜蛋白DⅢ区基因进行克隆、表达和纯化,以获得能应用于血清学诊断的纯化重组蛋白。方法用RT-PCR和套式PCR法扩增登革病毒Hawaii株外膜蛋白DⅢ区基因,与表达载体pET-30a连接,构建重组表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,重组蛋白经Western-blot鉴定活性后用电洗脱法进行纯化。纯化的重组蛋白用间接ELISA法和捕获ELISA法应用于血清学检测,检测结果与间接免疫荧法进行比较。结果重组表达质粒在大肠杆菌中表达高产量的重组蛋白,Western-blot结果显示重组蛋白具有免疫活性。纯化的重组蛋白对登革热病毒Ⅰ型感染者具有很高的检出率,与间接免疫荧光法检测结果基本相符。结论DVⅠ外膜蛋白DⅢ区基因在大肠杆菌中成功表达,重组蛋白可应用于血清学检测。     

SARS冠状病毒N蛋白的表达及其诱导的免疫应答

目的表达和纯化SARS冠状病毒的N蛋白,分析其诱导的免疫应答。方法从重组克隆pMD18-N中切取N基因的插入片段,亚克隆至原核表达质粒pET-23a(+)中,转化大肠杆菌BL21,PCR和酶切鉴定转化菌落的插入序列;将构建的原核表达菌株经IPTG诱导,SDS-PAGE分析重组蛋白的表达;大量诱导表达N蛋白,金属螯合层析予以纯化,将纯化蛋白免疫小鼠,观察其诱导的免疫应答。结果N基因的特异片段被亚克隆到原核表达质粒pET-23a(+),在大肠杆菌表达了SARS冠状病毒的N蛋白;表达的蛋白经金属螯合层析获得纯化;纯化蛋白能被重组N蛋白的GST融合蛋白的免疫血清识别,并诱导小鼠产生了高滴度的抗体和Th1/Th2型的免疫应答。结论成功构建了N蛋白的原核重组表达质粒,纯化的蛋白具有良好的抗原性。     

弓形虫Rhomboid-1蛋白基因的克隆及原核表达

目的克隆并原核表达刚地弓形虫（Toxoplasmagondii）Rhomboid-1（TgROMl）蛋白。方法收集、纯化弓形虫速殖子,用Trizol法提取总RNA,应用RTPCR技术扩增TgROMl基因,回收的PCR产物与pMDl8-T载体连接,构建重组克隆质粒pMDl8-T-TgROMl。将重组克隆质粒亚克隆至原核表达载体pGEX一4T—l中,构建重组表达质粒pGEX-4Tl-TgR（）M1并转化至Rosetta感受态,用IPTG诱导表达,表达产物进行SDS-PAGE和Westernblot分析。结果成功克隆了643bp的TgROMl基因,双酶切鉴定重组表达质粒pGEX-4T-1-TgROMl构建正确。SDS-PAGE检测重组表达质粒表达的TgROMl蛋白分子质量约为48ku,Westernblot检测表明该蛋白能被鼠抗弓形虫血清识别。结论成功克隆了弓形虫ROMl基因并原核表达了具有反应原性的重组TgROMl蛋白,为该蛋白的功能研究奠定了基础。     

尘螨变应原Der f 2编码基因重组pCold TF体系构建及可溶性表达

目的建立尘螨变应原Der f 2编码基因重组pCold TF体系并诱导表达。方法以质粒pMD19-T-Der f 2为模板扩增目的基因Der f 2,克隆至pCold TF DNA载体,转化BL21细菌,用IPTG诱导表达,用SDS-PAGE和West-ern blot鉴定表达产物。结果 PCR扩增获得Der f 2编码基因,成功构建表达质粒pCold TF-Der f 2。SDS-PAGE检测表明该质粒在大肠埃希菌中正常表达,且基本为可溶性表达,表达产物分子质量单位为69ku,Western blot检测该蛋白能被鼠抗Penta-His抗体识别。结论成功建立尘螨变应原Der f 2编码基因重组pCold TF体系,并实现其可溶性原核表达。     

Stx1B基因克隆、表达及重组蛋白的纯化

目的构建志贺样毒素1B亚单位(Stx1B)的原核表达载体,获取高纯度的Stx1B重组蛋白。方法用PCR法扩增Stx1B,通过基因重组技术克隆入原核表达载体pGEX4T-2,将该重组质粒转化E.coli BL21,IPTG诱导表达,Glutathione Sepharose 4B亲和层析柱纯化重组蛋白,进行SDS-PAGE电泳分析及Westernblot检测。结果重组质粒经诱导后表达分子量为34kD的重组蛋白,Western blot检测显示特异性条带,亲和层析柱纯化后得到重组蛋白的纯度在90%左右。结论成功构建了Stx1B重组质粒,表达并纯化出高纯度重组蛋白,为进一步的生物性质研究奠定了基础。     

淡色库蚊抗性转录因子FTZ-F1蛋白原核表达与鉴定

目的 对淡色库蚊抗性转录因子FTZ-F1蛋白进行原核表达并鉴定。方法 对转录因子FTZ-F1蛋白进行生物信息学分析,包括蛋白的理化性质,二级结构及三维同源模型。采用PCR技术扩增FTZ-F1基因,比对分析后选取FTZ-F1基因保守区和功能区片段,片段长度为1122bp,然后将其连接至pET-32a(+)载体,构建重组质粒pET-32a(+)-FTZ-F1,再转化入感受态细胞BL21(DE3)后用IPTG诱导重组质粒pET-32a(+)-FTZ-F1的表达,运用SDS-PAGE和Western blot初步鉴定重组蛋白FTZ-F1的表达,采用His标签镍离子蛋白纯化柱对表达产物进行纯化和增加蛋白的量,用SDS-PAGE和Western blot鉴定重组蛋白FTZ-F1的表达。结果 FTZ-F1蛋白有744个氨基酸,相对分子质量为79.57×10³。1%琼脂凝胶鉴定PCR扩增为单一条带,大约为2 240 bp,测序结果表明重组质粒pET-32a(+)-FTZ-F1构建正确。采用SDS-PAGE检测重组蛋白FTZ-F1,结果表明蛋白FTZ-F1在原核表达系统中主要以可溶...     

卡氏肺孢子菌55kDa抗原的原核表达与纯化

目的体外扩增卡氏肺孢子菌(Pneumocystis carinii,Pc)55kDa抗原(p55)570bp的基因片段,构建原核表达载体pGEX-570,诱导表达并纯化重组蛋白。方法以卡氏肺孢子菌DNA为模板,扩增其基因片段,连接至pGEM-T载体,随后构建pGEX-570重组表达质粒,经双酶切、PCR及测序鉴定后将其转化入BL21大肠杆菌中,经IPTG诱导表达融合蛋白。采用透析袋电泳法纯化融合蛋白。结果重组表达质粒pGEX-570经酶切,PCR鉴定及测序结果表明构建成功。IPTG诱导表达融合蛋白GST-p55/570,分子量约为47kDa。用透析袋电泳法纯化重组蛋白,经SDS-PAGE确认正确。结论本研究成功构建了pGEX-570原核表达载体,诱导表达并纯化GST-p55/570融合蛋白。为进一步开展肺孢子菌55kDa抗原的研究奠定了基础。     

2型猪链球菌中国强毒株溶血素样蛋白基因的原核表达及其抗血清制备

目的克隆2型猪链球菌溶血素样蛋白(Hemolysin-like protein,HLP)编码基因并进行原核表达,纯化重组蛋白并制备相应的多克隆抗体。方法采用PCR法,从2型猪链球菌中国强毒株05ZYH33基因组扩增基因hlp,构建重组表达质粒pET32a::hlp,转化E.coliBL21(DE3),筛选阳性转化子进行IPTG诱导表达,SDS-PAGE鉴定表达产物;His亲和层析柱纯化重组蛋白;重组蛋白免疫新西兰兔制备多克隆抗体,间接ELISA和Western blot检测多抗血清。结果构建的重组质粒在宿主菌中可高效表达,His亲和层析柱纯化获得较高纯度的重组蛋白;重组蛋白免疫新西兰兔后获得高效价的抗血清。结论在原核系统中成功地表达了hlp基因编码的蛋白,并以重组蛋白为抗原制备出高效价的多抗血清,为进一步研究hlp基因的功能奠定了基础。     

3种截短的泡球蚴Eml8基因原核表达质粒的构建、表达及鉴定

目的 构建3种截短的泡球蚴18（Eml8）基因的原核表达质粒，获得高效表达、有生物活性的3种重组蛋白，并对其进行初步鉴定。方法 DNAman软件设计引物，PCR法扩增并构建3种截短的pET41a-Eml8．1、Eml8．2和Eml8．3原核表达质粒，测序鉴定插入序列正确性；IPTG诱导、表达和纯化rEml8．1-GST、rEml8．2-GST和rEml8．3一GST重组蛋白，SDS-PAGE电泳及Westernblot进行初步鉴定。结果 成功构建了3种截短的pET41a—Eml8．1、Eml8．2和Eml8．3重组表达质粒；SDS-PAGE检测表明rEml8．1-GST、rEinl8．2-GST、rEml8．3-GST重组蛋白得到成功表达，在分子质量单位为41、45．5和45．5ku处有表达条带；Westernblot显示3种重组蛋白均能被AE病人血清识别。结论 成功构建了截短的pET41a-Eml8．1、pET41a-Eml8．2和pET41a—Eml8．3原核表达质粒，表达的3种重组蛋白均具有良好的抗原性，为Eml8抗原表位分析奠定了基础。     

重组弓形虫GRA8的表达及其诱导的免疫应答

目的表达和纯化弓形虫RH株GRA8的截短型片段,分析其诱导的免疫应答。方法从重组克隆pMD18-GRA8中切取GRA8的插入片段,亚克隆至原核表达质粒pET-23a(+)中,转化大肠杆菌BL21,PCR和酶切鉴定转化菌落的插入序列;将构建的原核表达菌株经IPTG诱导,SDS-PAGE分析重组蛋白的表达;大量诱导表达GRA8,金属螯合层析予以纯化,将纯化蛋白免疫小鼠,观察其诱导的免疫应答。结果GRA8基因的特异片段被亚克隆到原核表达质粒pET-23a(+),在大肠杆菌中未见GRA8的明显表达;表达的蛋白经金属螯合层析获得纯化;纯化蛋白能被弓形虫感染兔血清识别。结论成功构建了GRA8的原核重组表达质粒,纯化的蛋白具有良好的抗原性。     

细粒棘球绦虫硫氧还蛋白过氧化物酶基因的表达及抗原性分析

目的在原核系统表达并初步鉴定细粒棘球绦虫硫氧还蛋白过氧化物酶(EgTPx)基因重组蛋白的抗原性。方法对已构建的重组质粒pMD-18T-EgTPx进行限制性酶切,获取目的基因片段后连接到表达质粒载体pET30a,构建重组表达质粒pET30a-EgTPx,转化大肠杆菌DH5α。筛选阳性克隆,经限制性酶切分析、PCR及测序鉴定后,转化大肠杆菌BL21(DE3),以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析表达产物,对表达产物纯化后用Western-blot方法和ELISA鉴定重组EgTPx蛋白的抗原性。结果构建的重组表达质粒pET30a-EgTPx阳性克隆经PCR与双酶切鉴定,与预期结果一致,测序鉴定无基因突变,开放阅读框正确;含有pET30a-EgTPx重组表达质粒的大肠杆菌BL21(DE3)诱导后得到了高效表达,SDS-PAGE显示表达产物分子量约为27 kDa,而且主要以包涵体形式存在;Western-blot和ELISA结果表明EgTPx重组抗原可以被棘球蚴感染羊阳性血清特异性识别。结论成功构建了pET30a-EgTPx表达质粒,EgTPx重组蛋白得到了高效表达,表达产物具有良好的抗原性。