羊口疮病毒F1L和B2L基因真核表达质粒构建及其在MDBK细胞中的表达

目的 为构建羊口疮病毒F1L和B2L基因真核表达质粒,同时验证其在MDBK细胞中的表达。方法 本试验以pVAX1为真核表达载体,在前期构建的克隆质粒pMD18-T-B2L和pMD18-T-F1L基础上,构建真核表达质粒pVAX1-F1L和pVAX1-B2L,对其分别进行双酶切和测序鉴定,将鉴定正确的真核表达质粒pVAX1-F1L和pVAX1-B2L转染至MDBK细胞,采用RT-PCR和间接免疫荧光试验(IFA)检测目的基因表达。结果 双酶切鉴定和序列测定表明真核表达质粒pVAX1-F1L和pVAX1-B2L构建成功,RT-PCR和IFA同时验证目的基因在MDBK细胞浆中能瞬时表达。结论 本试验构建成功的真核表达质粒为下一步羊口疮病毒核酸疫苗研究奠定基础。     

羊口疮病毒B2L基因DNA疫苗载体的构建及其在BHK-21细胞中的表达

目的 为构建羊传染性脓疱病毒(ORFV)B2L基因真核表达质粒并验证B2L基因在BHK-21细胞中的表达及表达的稳定性。方法 以ORFV主要免疫原性基因B2L为目标,以pVAX1为表达载体,构建重组真核表达质粒pVAX1-B2L,鉴定正确后转染仓鼠肾细胞(BHK-21),通过间接免疫荧光试验(IFA)验证B2L基因表达。结果 扩增出目的片段经序列测定和分析证明为ORFV B2L基因,经双酶切鉴定和序列测定分析证明了pVAX1-B2L质粒的正确性,IFA证实目的基因在BHK-21细胞中能够瞬时表达。结论 为进一步研制基于羊口疮病毒B2L基因的DNA疫苗奠定了基础。     

弓形虫抗原基因真核表达质粒pVAX1-SAG1和pVAX1-SAG4的构建

目的构建弓形虫抗原基因真核表达质粒pVAX1-SAG1和pVAX1-SAG4。方法根据弓形虫RH标准株SAG1和SAG4基因序列分别设计一对特异引物(分别含有HindⅢ/BamHⅠ和BamHⅠ/XbaⅠ内切酶位点),PCR扩增目的基因,并将这两段基因分别克隆至PEGM-T Easy载体,经菌落PCR和双酶切鉴定;用HindⅢ/BamHⅠ和BamHⅠ/XbaⅠ分别双酶切PEGM-T Easy-SAG1、PEGM-T Easy-SAG4和pVAX1,得到含内切酶位点的SAG1和SAG4基因片段,分别与pVAX1连接,构建pVAX1-SAG1和pVAX1-SAG4真核表达质粒,经菌落PCR和双酶切鉴定。结果PCR扩增得到目的基因SAG1和SAG4,测序结果分别与弓形虫RH标准株SAG1和SAG4基因比较,符合率均为100%。构建PEGM-T Easy-SAG1、PEGM-T Easy-SAG4克隆质粒和pVAX1-SAG1、pVAX1-SAG4真核表达质粒,分别经菌落PCR和双酶切鉴定,显示722bp的SAG1基因片段和511bp的SAG4基因片段均插入载体PEGM-T Easy和pVAX1中。结论成功克隆了pVAX1-SAG1、pVAX1-SAG4真核表达质粒,为弓形虫基因疫苗应用研究奠定了基础。     

汉坦病毒L99株G2糖蛋白基因的克隆及在真核细胞中的瞬时表达

从感染病毒的Vero-E6细胞中提取总RNA,采用RT-PCR和分子克隆技术将扩增到的C2糖蛋白基因插入含有CMV启动子的真核表达质粒pVAX1.通过脂质体介导转染cos-7细胞,用间接免疫荧光法检测瞬时表达的蛋白.结果获得含有编码汉坦病毒L99株包膜糖蛋白G2基因的重组质粒pVAX/C2.在转染cos-7细胞内.用IFA可检测到细胞内有特异性荧光.证实成功构建了汉坦病毒L99株包膜糖蛋白C2基因真核表达载体,并可在cos-7细胞中瞬时表达;为出血热综合征疫苗制备奠定了基础.     

弓形虫pVAX1-SAG2真核表达质粒的构建及其诱导的小鼠免疫应答

目的　构建弓形虫主要速殖子表面抗原 2 (SAG2 )编码基因真核表达质粒pVAX1-SAG2 ,并接种小鼠 ,分析其所诱导的免疫应答。方法　以限制性内切酶EcoRⅠ与KpnⅠ双酶切从重组质粒 pGEM/SAG2中获得SAG2目的基因片段 ,约5 92个bp ,将其插入真核表达载体 pVAX1多克隆位点 ,构建重组质粒 pVAX1-SAG2 ,并转化大肠杆菌JM 10 9,阳性克隆以双酶切与PCR法鉴定。大量提取纯化重组质粒 pVAX1-SAG2 ,5 0 μg肌肉注射小鼠左后腿内侧肌肉 ,3周后加强免疫一次 ;RT-PCR检测SAG2在小鼠肌肉中的转录表达 ,流式细胞仪测定T细胞亚群 ,以速殖子虫体抗原作ELISA测定小鼠血清IgG抗体。结果　真核表达重组质粒 pVAX1-SAG2双酶切鉴定及PCR扩增结果与预期结果相符合。RT -PCR从注射部位肌肉组织总RNA中扩增出SAG2目的基因条带 ;重组质粒 pVAX1-SAG2免疫组CD+ 4 细胞数为 32 .35± 5 .38,显著高于空质粒pVAX1及生理盐水 (NS)二对照组 (P <0 .0 1) ,后二者CD+ 4 细胞数分别为 19.6 5± 4 .2 1与 17.84± 1.5 9;免疫组CD+ 8细胞数为 18.6 7± 2 .37,但与空质粒及NS对照组相比 ,差别不显著 (P >0 .0 5 )。ELISA测定结果显示 pVAX1/SAG2免疫组小鼠血清中出现抗弓形虫特异性IgG抗体。结论　构建成功SAG2真核表达重组质粒 pVAX1-SAG2 ,其能在     

幽门螺杆菌glmM DNA重组质粒的构建及体外表达

目的构建幽门螺杆菌(Hp)pVAX1-glmMDNA重组质粒,体外转染SGC-7901细胞并鉴定其表达蛋白的抗原性。方法RT-PCR方法从国际标准株NCTC11637中获取glmM全长基因,克隆插入T载体。测序后经酶切、连接反应将glmM的开放读码框架定向克隆入真核表达载体pVAX1,酶切初步鉴定后测序确认。通过脂质体法将pVAX1-glmMDNA重组质粒转染SGC-7901细胞,检测其转染效率,确定转染成功后RT-PCR法检测glmM在转录水平的表达,ELISA法鉴定表达蛋白的抗原性。结果DNA测序结果显示扩增出的glmM全长基因与GenBank公布的HpglmM序列有96%的同源性。PCR、酶切和测序结果证实glmM目的基因成功克隆入真核表达载体pVAX1。重组质粒转染的细胞经RT-PCR扩增获得1.4kb片段,与目的基因大小相符。ELISA结果显示重组质粒转染细胞的超声破碎物及培养上清液中抗原的滴度比对照组高2倍以上。结论成功构建了pVAX1-glmMDNA重组质粒,其表达蛋白具有良好的抗原性,为进一步研究其抗Hp感染的效果及制备相应有效DNA疫苗奠定基础。     

新城疫病毒NP和P基因辅助质粒的构建及鉴定

目的构建新城疫病毒JL02/2000株P和NP基因真核表达质粒,并在BHK-21细胞中表达,为该病毒的反向遗传操作系统的建立奠定了基础。方法根据新城疫病毒(JL02/2000毒株)的全基因组中的NP、P基因分别设计引物,应用RT-PCR方法扩增NP基因和P基因,将扩增的NP基因和P基因片段连接到pMD18-T载体上,限制性内切酶EcoRⅠ和XbaⅠ酶切鉴定确认后回收目的条带,分别插入到真核表达载体pCI上,经测序确认pCI-NP、pCI-P辅助质粒的构建。将pCI-NP、pCI-P转染BHK-21细胞,两次换液,72h后回收细胞,经RT-PCR检测NP和P基因片段。结果构建的辅助质粒pCI-NP和pCI-P经双酶切和测序鉴定到目的片段。pCI-NP、pCI-P转染后,RT-PCR检测到NP和P基因片段。结论新城疫病毒pCI-NP、pCI-P辅助质粒构建成功,pCI-NP、pCI-P可在BHK-21细胞中表达,为该病毒的反向遗传操作系统的建立奠定了基础。     

甲型H1N1流感病毒血凝素HA1蛋白的真核表达与纯化

目的构建甲型SWH1N1流感病毒血凝素HA1蛋白的杆状病毒真核表达载体,转染sf9细胞表达并纯化其编码蛋白。方法从江苏甲型H1N1流感病毒毒株[A/Jiangsu/1/2009（H1N1）]提取病毒RNA,采用RT-PCR技术扩增HA1基因,将其克隆至pMD18-T Simple Vector中构建pMD18-T/HA1质粒,双酶切pMD18-T/HA1与p-fast后,连接构建真核表达载体p-fast-HA1,转化DH10Bac细胞,转座构建杆状病毒HA1-Bacmid,经酶切及测序鉴定后将HA1-Bacmid转染到sf9细胞中,通过免疫印迹法鉴定HA1蛋白的表达,采用亲和层析法纯化HA1蛋白。结果经双酶切、测序鉴定证实HA1基因的真核表达载体构建成功;免疫印迹法证实HA1基因的表达;纯化获得了高纯度的HA1蛋白。结论成功克隆了HA1基因,并构建了其杆状病毒真核表达载体,该表达载体的构建为后期的流感快速检测以及基因工程疫苗制备奠定了良好的基础。     

仙台病毒HN基因核酸疫苗的构建及表达

用逆转录一聚合酶链反应(RT-PCR)从仙台病毒cDNA中扩增出HN全长序列片段,构建HN基因的真核表达载体pVAX1-HN,用PCR法、酶切进行鉴定.将重组质粒用脂质体法转染至COS 7细胞,用流式细胞术检测抗原蛋白表达,RT-PCR法检测HN基因mRNA表达情况.发现经PCR法和酶切鉴定,目的 片段大小与预期相符,经测序目的 基因序列与GenBank公布结果一致.转染后抗原蛋白表达达到68.3%,明显高于转染前(P＜0.01),HN基因mRNA明显表达.提示成功构建核酸疫苗pVAX1-HN,并在COS 7中能够瞬时表达,为进一步进行免疫学评价奠定基础.     

弓形虫表面抗原SAG2的DNA疫苗载体构建及在Vero细胞中的表达

目的　构建弓形虫表面抗原SAG2的DNA疫苗载体 ,并在Vero细胞中表达。　方法　设计 1对引物 ,从弓形虫RH株速殖子基因组DNA中扩增SAG2全长编码基因 ,构建 pVAX1 SAG2真核表达重组质粒。以限制性内切酶KpnⅠ和EcoRⅠ进行双酶切、PCR鉴定 ,纯化后进行测序鉴定。脂质体介导法瞬时转染Vero细胞 ,同时以 pVAX1为对照 ,48h后收集细胞 ,Western blot鉴定。　结果　从弓形虫RH株DNA中扩增出了 5 77bp的SAG2基因 ,构建了真核表达载体 pVAX1 SAG2 ,在质脂体介导下转染Vero细胞 ,质粒DNA成功的转染到细胞中。通过Westen blot分析 ,细胞裂解液样品有 1条可被弓形虫免疫血清所识别的约 17ku大小的条带 ,与预计大小一致。　结论　真核表达载体pVAX1 SAG2在Vero细胞中有一定表达 ,且有一定的活性。     

弓形虫表面抗原SAG1 DNA疫苗的构建

目的　构建真核重组表达质粒 pVAX1-SAG1,并探讨其诱导的体液免疫应答。 方法　采用多聚酶链反应技术 ,从弓形虫RH株基因组DNA中扩增截短型的SAG1基因片断 ,并克隆至载体pMD18-T ,经菌落PCR鉴定和测序分析后 ,亚克隆至真核表达载体 pVAX1,构建重组真核表达质粒pVAX1-SAG1,并予菌落PCR和双酶切鉴定。以此为疫苗候选分子免疫小鼠 ,检测其诱导产生的抗体。结果　PCR扩增出SAG1基因的截短型片段 ,其大小约 780bp ;测序的阳性TA克隆除两处发生同义突变外 ,其余序列与原序列一致 ;TA克隆的插入片段被亚克隆到真核表达载体 pVAX1,构建了重组表达质粒pVAX1-SAG1;该质粒诱导小鼠产生了抗弓形虫抗原的抗体。 结论　成功构建了弓形虫表面抗原SAG1的DNA疫苗。     

双亚型(H5/H7)流感病毒血凝素基因真核表达质粒的构建及其在BHK细胞中的表达

目的 构建双亚型(H5/H7)流感病毒血凝素真核表达载体,并在幼仓鼠(BHK)细胞中进行表达.方法 通过PCR方法分别改造流感病毒H5亚型血凝素(HA)和H7亚型HA基因片段,在融合片段间引入具有柔性功能的(G_4S)_3 linker和具有自裂解功能的口蹄疫蛋白2A linker.将融合后的基因片段H5HA-H7HA克隆至真核表达载体pVAX1.选用BHK真核表达细胞系,用脂质体转染法将纯化后的表达质粒在细胞进行表达,转染后48 h,用间接免疫荧光法(IFA)检测目的基因的表达情况.结果 表达双亚型(H5/H7)流感病毒血凝素基因的重组真核表达质粒pVAX1-H5HA-H7HA 经酶切和测序证明构建正确.转染重组质粒的BHK细胞可检测到目的蛋白的表达.结论 成功构建了真核表达质粒pVAX1-H5HA-H7HA,并在BHK真核细胞中正确表达,为H5、H7双亚型核酸疫苗的研究奠定了基础.     

弓形虫表面抗原SAG2的DNA疫苗载体构建及在Vero细胞中的表达

目的构建弓形虫表面抗原SAG2的DNA疫苗载体，并在Vero细胞中表达。方法设计1对引物，从弓形虫RH株速殖子基因组DNA中扩增SAG2全长编码基因，构建pVAXl—SAG2真核表达重组质粒。以限制性内切酶Kpn Ⅰ和EcoR Ⅰ进行双酶切、PCR鉴定，纯化后进行测序鉴定。脂质体介导法瞬时转染Vero细胞，同时以pVAX1为对照，48h后收集细胞，Western—blot鉴定。结果从弓形虫RH株DNA中扩增出了577bp的SAG2基因，构建了真核表达载体pVAX1—SAG2，在质脂体介导下转染Vero细胞，质粒DNA成功的转染到细胞中。通过Westen-blot分析，细胞裂解液样品有1条可被弓形虫免疫血清所识别的约17ku大小的条带，与预计大小一致。结论真核表达载体pVAX1—SAG2在Vero细胞中有一定表达，且有一定的活性。     

ERβ重组质粒的构建及其在结肠癌细胞株Caco-2中的表达

目的: 基因重组技术构建重组质粒pEGFP-C1-ERbeta并检测其在结肠癌细胞株Caco-2中的表达. 方法: 应用RT-PCR从人结肠癌手术患者正常切缘组织中分离、扩增目的基因片段, 将所得cDNA定向克隆到真核表达载体pEGFP-C1中, 采用双酶切和测序分析鉴定插入基因的序列; 脂质体介导重组质粒pEGFP-C1-ERbeta瞬时转染Caco-2并上流式细胞仪分选, 获得比较单一的转染细胞; 分别采用RT-PCR、Western blot检测转染前后ERbeta基因不同分子水平表达. 结果: 酶切鉴定和测序分析表明重组表达质粒pEGFP-C1-ERbeta构建无误; RT-PCR和Western blot分析均表明, 与转染空质粒pEGFP-C1组和空白对照组细胞相比, 转染重组表达质粒pEGFP-C1-ERbeta组细胞ERbeta基因表达水平明显提高. 结论: 成功构建重组质粒pEGFP-C1-ERbeta并在Caco-2细胞株中表达, 为进一步研究ERbeta如何通过雌激素受体通路调控下游靶基因表达和参与结肠癌表遗传学发生机制奠定了基础.     

ERβ重组质粒的构建及其在结肠癌细胞株Caco-2中的表达

目的:基因重组技术构建重组质粒pEGFP-C1ERβ并检测其在结肠癌细胞株Caco-2中的表达.方法:应用RT-PCR从人结肠癌手术患者正常切缘组织中分离、扩增目的基因片段,将所得cDNA定向克隆到真核表达载体pEGFP-C1中,采用双酶切和测序分析鉴定插入基因的序列;脂质体介导重组质粒pEGFP-C1-ERβ瞬时转染Caco-2并上流式细胞仪分选,获得比较单一的转染细胞:分别采用RT-PCR、Western blot检测转染前后ERβ基因不同分子水平表达.结果:酶切鉴定和测序分析表明重组表达质粒pEGFP-C1-ERβ构建无误:RT-PCR和Western blot分析均表明,与转染空质粒pEGFP-C1组和空白对照组细胞相比,转染重组表达质粒pEGFP-C1-ERβ组细胞ERβ基因表达水平明显提高.结论:成功构建重组质粒pEGFP-C1-ERβ并在Caco-2细胞株中表达,为进一步研究ERβ如何通过雌激素受体通路调控下游靶基因表达和参与结肠癌表遗传学发生机制奠定了基础.     

Stat3对Foxp3表达的影响

目的构建并鉴定pcDNA3.1-Stat3真核表达质粒,探讨信号转导和转录激活因子Stat3对Foxp3表达的影响。方法以EL4细胞cDNA为模板,PCR法获取目的基因Stat3。构建含有目的基因的T载体pMD19-T-Stat3。用HindⅢ和ECOR I双酶切pcDNA3.1载体及pMD19-T-Stat3,纯化后在T4 DNA连接酶作用下连接,构建pcDNA3.1-Stat3真核表达质粒,并进行PCR、双酶切及测序鉴定。将构建正确的pcDNA3.1-Stat3电转入EL4细胞,采用Western blot法及细胞免疫荧光法检测Foxp3的表达。结果 PCR和双酶切鉴定重组质粒pcDNA3.1-Stat3构建成功,测序鉴定插入片段无突变,序列完全正确。pcDNA3.1-Stat3转入EL4细胞后,能上调目的蛋白Stat3的表达,且能进一步促进Foxp3表达。结论 pcDNA3.1-Stat3重组质粒转化入EL4细胞后能高表达Stat3,且能诱导Foxp3的表达。     

Stat3对Foxp3表达的影响北大核心CSCD

目的构建并鉴定pcDNA3.1-Stat3真核表达质粒,探讨信号转导和转录激活因子Stat3对Foxp3表达的影响。方法以EL4细胞cDNA为模板,PCR法获取目的基因Stat3。构建含有目的基因的T载体pMD19-T-Stat3。用HindⅢ和ECOR I双酶切pcDNA3.1载体及pMD19-T-Stat3,纯化后在T4 DNA连接酶作用下连接,构建pcDNA3.1-Stat3真核表达质粒,并进行PCR、双酶切及测序鉴定。将构建正确的pcDNA3.1-Stat3电转入EL4细胞,采用Western blot法及细胞免疫荧光法检测Foxp3的表达。结果 PCR和双酶切鉴定重组质粒pcDNA3.1-Stat3构建成功,测序鉴定插入片段无突变,序列完全正确。pcDNA3.1-Stat3转入EL4细胞后,能上调目的蛋白Stat3的表达,且能进一步促进Foxp3表达。结论 pcDNA3.1-Stat3重组质粒转化入EL4细胞后能高表达Stat3,且能诱导Foxp3的表达。     

大鼠源肺孢子菌p55基因片段真核表达质粒的构建及表达

目的构建大鼠源肺孢子菌抗原p55基因片段真核表达质粒,并研究该质粒在真核细胞COS-7中的有效表达。方法以含有p55全长基因的质粒为模板,通过PCR扩增p55基因片段,克隆至pGEM-T载体中,经酶切后再将p55基因重组至真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建重组真核表达质粒pcDNA3.1(+)-582,经限制性内切酶酶切分析及测序鉴定正确后,应用脂质体转染技术转染入COS-7细胞,RT-PCR检测其基因转录情况,SDS-PAGE鉴定其表达相应的目的蛋白质情况。结果成功扩增了p55基因片段,酶切和测序证明正确构建了重组真核表达质粒pcDNA3.1(+)-582,RT-PCR和SDS-PAGE方法证实该片段能在COS-7细胞中有效表达目的蛋白质。结论成功构建了大鼠源肺孢子菌p55基因片段的真核表达质粒载体,并在COS-7细胞中表达,为进一步进行核酸疫苗的研究奠定了基础。     

周期型马来丝虫半胱氨酸蛋白酶基因原核和真核表达质粒的构建

目的构建我国流行的周期型马来丝虫半胱氨酸蛋白酶（BmCP）基因原核和真核表达质粒，为进一步研究奠定基础。方法从周期型马来丝虫虫体中提取总RNA，反转录成cDNA，设计合成引物，以eDNA为模板，通过PCR从eDNA中扩增出目的基因，扩增产物经初步鉴定后将其克隆入pMD18-T载体，进行双酶切及PCR扩增鉴定，获得阳性重组质粒，进行测序分析和同源性比较。阳性克隆的质粒亚克隆至真核表达质粒peDNA3．1（＋），转化感受态大肠埃希菌（E-coli）DH5α，筛选阳性克隆，用PCR和双酶切鉴定阳性重组子。结果RT—PCR扩增出1条约1201bp的特异性条带，重组质粒双酶切和以质粒为模板的PCR结果与预期相符．DNA序列分析与GenBank已知的基因序列同源性为99％。构建了真核重组表达质粒peDNA3．1-BmCP。结论成功构建了周期型BmCP原核和真核重组表达质粒，为进一步研究该基因的功能提供了条件。     

FAT10真核质粒的构建、转染及其蛋白的表达

目的构建类泛素基因FAT10的真核表达质粒,观察其蛋白在转染人胚肾细胞系293T中的表达。方法采用RT-PCR法扩增FAT10全长基因片段后,克隆至pMD18-T载体进行测序分析,将FAT10克隆至pcDNA5-FRT表达载体并行酶切鉴定;用脂质体LipofectamineTM2000分别介导空质粒（空载组）及重组质粒（FAT10质粒组）转染293T细胞,以脂质体混合PBS（PBS组）及未加入脂质体（未转染组）作为对照。转染48 h后,收集细胞。采用Western blot法检测293T细胞中的FAT10蛋白。结果 pMD18-FAT10重组质粒经双酶切获得498 bp片段,对PCR产物及498 bp片段进行测序,结果与GenBank报道序列完全一致。FAT10质粒组、未转染组、空载体组和PBS组FAT10蛋白表达量分别为1.556±0.072、0.334±0.051、0.425±0.095、0.382±0.063,FAT10质粒组与未转染组、空载体组和PBS组比较,P均〈0.05。结论成功构建了FAT10的真核表达质粒pcDNA5-FRT-FAT10,FAT10蛋白在293T细胞中高表达。