RNAi沉默PDCD4基因对人喉癌Hep-2细胞增殖及β-catenin表达的影响

目的 应用RNAi技术下调人喉癌Hep-2细胞中PDCD4基因的表达,探讨其对Hep-2细胞增殖及β-catenin表达的影响。 方法 设计并合成针对PDCD4基因的shRNA质粒与阴性对照质粒,分别转染Hep-2细胞。实时定量RT-PCR和Western blotting检测转染前后阴性对照组与干扰组PDCD4、β-catenin基因mRNA和蛋白的表达。克隆形成实验观察Hep-2细胞增殖能力的变化。 结果 与对照组相比,PDCD4干扰组的Hep-2细胞克隆形成率显著升高(P=0.01),PDCD4干扰组PDCD4mRNA和蛋白均显著减低(P<0.01)、β-catenin mRNA和蛋白均较对照组显著增加(P<0.01)。 结论 成功应用RNAi技术下调人喉癌Hep-2细胞中PDCD4基因的表达,Hep-2细胞克隆形成能力增强,β-catenin mRNA和蛋白表达显著升高。     

慢病毒介导的基质金属蛋白酶2基因沉默抑制喉癌侵袭生长的实验研究

目的 探讨siRNA(小干扰RNA)重组慢病毒介导的基质金属蛋白酶2(matrixmetalloproteinase-2,MMP-2)基因沉默对喉鳞癌侵袭生长的抑制作用.方法 采用RNA干扰技术,将MMP-2基因siRNA的重组慢病毒(MMP-2-RNAi-Lentivirus)转染喉鳞癌Hep-2细胞,并运用蛋白印记法检测Hep-2细胞MMP-2基因的蛋白表达;通过博伊登(Boyden)侵袭小室观察MMP-2-RNAi-Lentivirus转染后喉癌细胞侵袭能力的变化.构建喉癌移植瘤裸鼠模型,瘤内注射MMP-2-RNAi-Lentivirns,观察抑瘤效果;透射电镜观察肿瘤形态;运用免疫组化方法检测移植瘤中增殖细胞核抗原的表达,以评估细胞增殖的情况.结果 MMP-2-RNAi-Lentivirus能高效地转染靶细胞,转染效率在90%以上.蛋白印迹法检测显示,转染后的Hep-2细胞中MMP-2蛋白表达阴性.侵袭实验显示,MMP-2-RNAi-Lentivirus转染后的实验组Hep-2细胞中穿过人工基底膜的平均细胞数(x±s,以下同)为(12±4)个,明显少于空载体对照组的(35±6)个(t=14.492,P<0.01).体内实验显示,MMP-2-RNAi-Lentivirus瘤内注射后,裸鼠移植瘤平均重量和平均体积均明显小于对照组,抑瘤率为44.2%.透射电镜观察到MMP-2-RNAi-Lentivims治疗组肿瘤细胞侵袭表型降低,治疗组肿瘤增殖细胞核抗原指数(49.588±6.995)也明显小于对照组(71.434±7.043,t=9.573,P<0.01).结论 siRNA重组慢病毒介导的MMP-2基因沉默能有效地抑制喉癌的侵袭、生长及增殖,为喉癌的基因治疗提供一定的实验依据.     

微小RNA-106a-5p/E2F3/β-catenin轴增加NK细胞对喉癌细胞的杀伤作用

目的　分析微小RNA-106a-5p（miR-106a-5p）/E2F3/β-catenin轴对喉癌细胞恶性发展的影响及其可能的作用机制。方法　通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术检测喉癌组织和癌旁组织中miR-106a-5p和E2F3的基因表达量。生物信息学软件及其双荧光素酶实验检测miR-106a-5p和E2F3之间的关系。下调miR-106a-5p和E2F3表达,CCK-8试剂盒检测喉癌Hep-2细胞的增殖能力,Western blot实验检测Hep-2细胞上皮间质转化（epithelial mesenchymal transformation,EMT）能力,检测NK细胞对Hep-2细胞的杀伤活性,酶联免疫吸附实验（ELISA）检测γ干扰素（interferon-γ,IFN-γ）和肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor α,TNF-α）的分泌。estern blot分析miR-106a-5p通过E2F3对β-catenin通路的影响。进一步检测抑制β-catenin通路对Hep-2细胞恶性发展及NK细胞杀伤作用的影响。结果　喉癌组织中miR-106a-5p表达（0.62±0.08）低于癌旁组织（1.53±0.24）,E2F3表达（2.65±0.86）高于癌旁组织（1.48±0.74）。miR-106a-5p与E2F3特异性结合。下调miR-106a-5p促进Hep-2细胞增殖和EMT,抑制NK细胞对Hep-2细胞的杀伤活性,而下调E2F3表达抑制Hep-2细胞增殖和EMT,上调NK细胞对Hep-2细胞的杀伤活性。下调miR-106a-5p通过E2F3激活β-catenin通路。XAV939干扰β-catenin通路后显著逆转了下调miR-106a-5p通对Hep-2细胞恶性发展以及NK细胞杀伤作用的影响。结论 miR-106a-5p靶向E2F3激活β-catenin通路调控喉癌细胞的恶性发展。     

Bmi-1基因RNAi对喉癌细胞Hep-2生物学行为的影响

目的:构建Bmi-1基因的RNAi表达载体,观察其对喉癌细胞Hep-2增殖、侵袭能力的影响。方法:利用慢病毒表达体系pHelper1.0/pHelper2.0/pGCL2GFP,构建Bmi-1基因的RNAi重组质粒vshRNA-Bmi-1。实时定量PCR和蛋白质印迹法分别检测稳定转染vshRNA-Bmi-1后喉癌细胞中Bmi-1mRNA及蛋白的表达;克隆形成实验及小室侵袭实验检测喉癌细胞增殖和侵袭能力的变化。结果:稳定转染vshRNA-Bmi-1后Hep-2细胞Bmi-1mRNA表达均明显下降,Hep-2细胞中Bmi-1蛋白表达明显下降。抑制率分别为79%及88%。Bmi-1干扰后Hep-2细胞增殖减慢、侵袭能力减弱。结论:成功构建Bmi-1基因的RNAi表达载体,vshRNA-Bmi-1重组质粒明显下调Bmi-1mRNA和蛋白在喉癌细胞Hep-2中的表达。Bmi-1基因的RNAi能抑制喉癌细胞Hep-2的增殖和侵袭能力。     

RNAi沉默miRNA-224-5p对喉鳞状细胞癌Hep-2细胞增殖、凋亡及侵袭能力的影响

目的通过慢病毒载体介导的RNA干扰技术,来探讨沉默miRNA-224-5p对人喉鳞状细胞癌（简称喉鳞癌）Hep-2细胞增殖、凋亡及侵袭能力的影响。方法针对目标序列合成特异性siRNA干扰片段并克隆入慢病毒载体,将重组miRNA-224-5p-RNAi-LV3转染喉鳞癌Hep-2。设为干扰组（miRNA-224-5p-siRNA,SI组）、阴性对照组（NC组）和空白对照组（BC组）,分别采用聚合酶链反应方法检测miRNA-224-5p的表达情况,用CCK8法检测细胞增殖情况,流式细胞仪检测细胞周期及凋亡情况、Transwell侵袭实验检测细胞侵袭情况。结果 miRNA-224-5p-RNAi-LV3可显著降低miRNA-224-5p的表达,转染后Hep-2细胞增殖能力显著降低,细胞侵袭能力明显减弱,细胞周期及细胞凋亡均未见明显影响。结论 RNAi沉默miRNA-224-5p可以抑制Hep-2细胞增殖,并降低其侵袭能力。     

靶向血小板衍生生长因子-B siRNA对喉癌Hep-2细胞增殖的影响

目的探讨血小板衍生生长因子(platelet derived growth factor,PDGF)B链mRNA的siRNA质粒转染喉癌细胞株Hep-2细胞,沉默Hep-2细胞中PDGF-B mRNA并检测细胞增殖。方法以脂质体lip2 0 0 0为载体,设计4组针对PDGF-B的siRNA片段瞬时转染喉癌Hep-2细胞,实时荧光定量PCR、Westernblot分别检测各组PDGF-B mRNA、PDGF-B蛋白的表达及干扰效果,噻唑蓝(MTT)法检测各组细胞增殖抑制率,并与阴性对照组和空脂质体组进行比较。结果实时荧光定量PCR检测显示:SiRNA2、SiRNA3、SiRNA4组PDGF-B mRNA表达均有明显抑制,其中SiRNA2抑制率最高;与SiRNA1、阴性对照组及空脂质体组进行比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。Westernblot检测显示:SiRNA-1、SiRNA-2、SiRNA-3组PDGF-B mRNA蛋白表达均有下降,其中SiRNA-2下降最明显,而SiRNA-4、阴性对照组及空脂质体组对PDGF-B蛋白表达无明显抑制作用。MTT法检测显示:SiRNA-1、SiRNA-2、SiRNA-3均明显抑制Hep-2细胞增殖,其中SiRNA-2对Hep-2细胞的抑制作用最明显;且与SiRNA-4、阴性对照组及空脂质体组比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论成功运用siRNA干扰喉癌Hep-2细胞PDGF-B mR-NA,靶向沉默PDGF-B mRNA能有效抑制细胞增殖。     

转化生长因子β1联合表皮生长因子诱导上皮向间质转化对人喉癌细胞株Hep-2侵袭能力影响的研究

目的探讨转化生长因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)联合表皮生长因子(epithelial growth factor,EGF)诱导上皮向间质转化对人喉癌细胞株Hep-2侵袭能力的影响。方法应用TGF-β1单独刺激和TGF-β1联合EGF刺激人喉癌细胞株Hep-2后24、48 h观察细胞形态学的动态变化。应用Transwell检测细胞侵袭能力及RT-PCR和Western blot技术检测细胞上皮钙依赖黏附蛋白(E-cadherin)和波形蛋白(vimentin)的表达。结果①TGF-β1单独处理48 h组和TGF-β1联合EGF处理24、48 h组均能刺激喉癌细胞株Hep-2发生细胞形态改变。②TGF-β1联合EGF处理组无论是24 h还是48 h,其Hep-2细胞的侵袭能力都明显强于相同时段TGF-β1单独处理组(P<0.05);TGF-β1单独处理48 h组细胞侵袭能力又明显强于对照组(P<0.05)。③TGF-β1联合EGF处理组E-cadherin的表达降低,而Vimentin表达却明显上升。结论 EGF能够协同TGF-β1诱导上皮向间质转化,从而使喉癌具有更强的侵袭能力。     

RNA干扰对喉癌细胞MMP-9基因表达的抑制效应及其与瘤细胞增殖活性和侵袭潜能的相关性

目的 探讨RNA干扰(RNAi)对喉癌细胞基质金属蛋白酶-9基因(MMP-9)表达活性的抑制作用及其与瘤细胞增殖和侵袭潜能的相关性.方法 于MMP-9基因编码区选择1对目标序列(A组)及1对非特异性序列(B组)构建小分子干扰RNA(siRNA)表达元件,转染Hep-2喉癌细胞,以未转染的母代细胞作为对照组(C组),RT-PCR法检测MMP-9 mRNA转录活性,蛋白印迹法检测MMP-9蛋白表达活性,细胞侵袭重建基底膜实验检测细胞体外侵袭潜能.结果 A、B、C组细胞MMP-9mRNA相对表达水平分别为0.51±0.05、0.87±0.09、0.89±0.07,MMP-9蛋白相对表达水平分别为0.29±0.07、0.595±0.11、0.61±0.10,A组的相对表达水平均明显下降(P<0.05);A、B组细胞侵袭抑制率分别为48.0%和11.5%,组间差异有统计学意义(P<0.05),但细胞增值活性却无明显变化(P>0.05).结论 Hep-2喉癌细胞中存在RNAi现象,MMP-9 siRNA特异性抑制MMP-9基因表达,伴随以细胞侵袭潜能明显减弱.     

Tiam1过表达调控喉癌生长及侵袭转移的体内外实验研究

目的 前期研究显示T淋巴瘤侵袭转移诱导因子1(Tiam1)与喉癌临床预后密切相关。为了进一步明确Tiam1对喉癌生物学行为的影响,通过上调Tiam1在喉癌细胞中的表达,观察Tiam1上调后对喉癌细胞体内外增殖和侵袭转移能力的影响。方法 通过质粒转染构建Tiam1稳定过表达的喉癌Hep-2细胞(Hep-2/Tiam1);本实验以pcDNA3(Mock)质粒作为转染对照。实验共分3组：空白对照组(Hep-2),转染pcDNA3(Mock)的Hep-2细胞株(Hep-2/Mock)和稳定转染Tiam1基因的Hep-2细胞株(Hep-2/Tiam1)。通过MTT、划痕实验及Transwell侵袭实验观察Tiam1过表达后对Hep-2细胞体外增殖、迁移及侵袭能力的影响。通过构建喉癌裸鼠移植瘤动物模型,进一步在体内水平观察Tiam1对喉癌的增殖及侵袭转移能力的影响。结果 MTT实验显示Hep-2/Tiam1与对照组Hep-2及转染空载体的Hep-2比较,各组之间细胞的增殖能力无明显差异(P>0.05)。划痕实验显示Hep-2/Tiam1细胞的迁移距离明显多于另两组(P<0.05)。Tr...     

上调miR-200b对人喉癌Hep-2细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响

目的 探讨上调miR-200b对人喉癌Hep-2细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。 方法 培养人喉癌Hep-2细胞,随机分为miR-200b模拟物组、miR-对照序列组和空白对照组,利用实时荧光定量PCR技术检测各组细胞中miR-200b表达,MTT法检测细胞增殖能力,Transwell法检测细胞迁移和侵袭能力,Western blotting法检测各组细胞中E-cadherin、N-cadherin、β-catenin蛋白表达。 结果 与空白对照组和miR-对照序列组相比,miR-200b模拟物组细胞中miR-200b相对表达量显著升高,差异有统计学意义(F=70.766, P<0.001);与空白对照组［(0.22±0.05)、(0.45±0.07)、(0.59±0.06)、(0.72±0.08)和(0.85±0.07)］和miR-对照序列组［(0.24±0.06)、(0.46±0.08)、(0.61±0.07)、(0.70±0.05)和(0.84±0.06)］相比,miR-200b模拟物组细胞24、48、72、96 h时吸光度A值［(0.21±0.04)、(0.29±0.06)、(0.40±0.04)、(0.53±0.07)和(0.58±0.05)］均降低,差异均有统计学意义(F=0.134, P=0.876; F=6.449, P=0.010; F=37.299, P<0.001; F=5.352, P=0.018; F=29.921, P<0.001);与空白对照组［(140.2±2.3)、(127.9±6.0)］和miR-对照序列组［(141.0±1.2)、(130.4±7.4)］相比,miR-200b模拟物组迁移细胞数和侵袭细胞数［(98.5±2.4)、(90.9±2.8)］均减少,差异均有统计学意义(F=845.523, P<0.001; F=88.859, P<0.001);与空白对照组［(0.35±0.07)、(0.54±0.10)、(0.76±0.12)］和miR-对照序列组［(0.24±0.03)、(0.60±0.14)、(0.65±0.24)］相比,miR-200b模拟物组细胞中E-cadherin蛋白相对表达量(0.54±0.14)升高,而N-cadherin、β-catenin蛋白相对表达量［(0.31±0.10)、(0.35±0.06)］降低,差异均有统计学意义(F=17.287, P<0.001; F=10.083, P=0.002; F=10.434, P=0.001)。 结论 上调喉癌细胞中miR-200b基因表达可减少细胞增殖,抑制细胞迁移和侵袭能力,其机制可能与抑制上皮-间质转化过程有关。     

甲状腺癌相关基因1在喉癌组织中的表达及对喉癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响CSCD

目的 探讨甲状腺癌相关基因1(thyroid cancer gene-1,TC-1)在喉癌组织中的表达及对喉癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。方法 采用免疫组织化学方法检测48例喉癌患者的喉癌组织及对应癌旁正常喉黏膜中TC-1的表达水平。Lenti-GFP-Puro(对照质粒)、Lenti-TC-1-GFP-Puro、siRNA N-CTL(阴性对照)及siRNA TC-1转染喉癌细胞，分别命名为Control组、TC-1组、siRNA-Control组及siRNA-TC-1组。采用CCK-8法、划痕实验及Transwell实验检测喉癌细胞的增殖、迁移及侵袭能力。采用Western blot检测β-catenin、c-Myc及MMP-7蛋白表达的变化。结果 TC-1在喉癌组织中的阳性表达率高于正常喉黏膜组织(χ2=15.875,P<0.001)。喉癌组织中TC-1的表达强度与肿瘤部位(χ2=8.261,P=0.041)、TNM临床分期(χ2=8.308,P=0.040)及病理分级(χ2=15.808,P=0.015)相关。与Control组比较，TC-1组喉癌细胞的增殖、迁移及侵袭能力增强(t=-4.671、-8.179、-26.130,P<0.001、P=0.004、P<0.001),c-Myc与MMP-7蛋白表达升高(t=-7.391、-4.793,P=0.018、0.041)。与siRNA-Control组比较，siRNA-TC-1组喉癌细胞的增殖、迁移及侵袭能力减弱(t=9.144、4.213、6.684,P <0.001、P=0.015、P=0.004),c-Myc与MMP-7蛋白表达降低(t=15.989、13.021,P=0.004、0.006)。结论 TC-1在喉癌组织中呈高表达，其表达强度与肿瘤发生部位、TNM临床分期及病理分级相关。过表达TC-1或干扰TC-1的表达能增强或减弱喉癌细胞的增殖、迁移及侵袭能力，其机制可能为TC-1调节Wnt/β-catenin信号通路靶基因的表达有关。     

RNA干扰DJ-1基因抑制喉癌细胞的增殖

目的 探讨RNA干扰(RNAi)抑制喉癌Hep-2细胞DJ-1基因的表达及观察其细胞效应.方法 设计合成3对特异性针对人DJ-1基因的小干扰RNA(siRNA),脂质体法转染Hep-2细胞,实验分为4组:瞬时转染非特异性siRNA对照组及转染特异性siRNA 3组(siRNA1、siRNA2、siRNA3).采用RT-PCR检测DJ-1 mRNA,蛋白免疫印迹法检测DJ-1蛋白,流式细胞仪检测细胞凋亡及四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测特异性siRNA1组对Hep-2细胞效应.结果 本实验设计合成的3对特异性siRNA均不同程度地抑制DJ-1基因表达,其中特异性siRNA1组抑制效果最佳.M1Tr比色法结果显示特异性siRNAl组(终浓度50 nmo~L、100 nmolZL)对Hep-2细胞增殖具有抑制作用.流式细胞仪检测结果最示特异性siRNA1组能诱导Hep-2细胞凋亡,转染特异性siRNA1组凋亡率为(15.7±4.8)%,非特异性siRNA对照组凋亡率为(4.5±0.4)%,非特异性siRNA对照组与特异性siRNA1组凋亡率比较差异有统计学意义(t=4.736,P<0.01).结论 转染特异性siRNA组能有效抑制Hep-2细胞增殖,诱导Hep-2细胞凋亡.     

Beclin1对喉鳞癌细胞Hep-2紫杉醇敏感性影响的体外研究

目的:通过检测不同Beclin1表达水平对喉癌细胞紫杉醇敏感性的影响。方法:本研究利用以喉癌细胞株Hep-2、稳定转染pcDNA3.1-Beclin1质粒的喉癌细胞株Hep-2-Beclin1、稳定转染pcDNA3.1质粒载体的喉癌细胞株Hep-2-pcDNA3.1为研究对象,对3组细胞施加不同浓度的化疗药物紫杉醇(1、2、5、10、20μg/L)干预24h,利用MTT法及流式细胞术检测紫杉醇对3组细胞增殖和凋亡的影响。利用Western blot检测3组细胞Akt和p-Akt蛋白表达水平。结果:不同浓度的紫杉醇处理后的3组喉癌细胞与药物终浓度正相关地出现生长抑制率提高。当紫杉醇浓度大于5μg/L时,紫杉醇对Hep-2-Beclin1的生长抑制率高于对另两株细胞的生长抑制率。以终浓度为10、20μg/L的紫杉醇处理3株喉癌细胞24h后,流式细胞术检测结果显示:各组细胞20μg/L紫杉醇处理后细胞的凋亡率均高于10μg/L紫杉醇处理后细胞的凋亡率(P<0.05)。紫杉醇处理后Hep-2-Beclin1组细胞凋亡率均高于Hep-2组和Hep-2-pcDNA3.1组(P<0.05)。Western blot结果显示:Hep-2、Hep-2-pcDNA3.1、Hep-2-Beclin1细胞Akt相对蛋白表达量分别为:1.24±0.03、1.25±0.05、1.27±0.09,3组细胞间Akt相对蛋白表达量差异无统计学意义(P>0.05);Hep-2、Hep-2-pcDNA3.1、Hep-2-Beclin1细胞p-Akt即活化型Akt相对蛋白表达量分别为:0.98±0.09、1.03±0.04、0.54±0.03,Hep-2-Beclin1细胞p-Akt相对蛋白表达量低于Hep-2、Hep-2-pcDNA3.1组细胞(P<0.05)。结论:Beclin1可能通过抑制PI3K/Akt信号通路的活化上调喉癌细胞对紫杉醇的敏感性。     

RNA干扰抑制c-Met表达对喉癌Hep-2细胞体内外生长的影响

目的 采用RNA干扰(RNAi)技术抑制人喉癌Hep-2细胞c-Met基因表达,观察对其体外生物学活性和体内生长的影响.方法 构建能够表达针对c-Met的小干扰RNA的RNAi质粒和表达不针对任何已知mRNA的siRNA的阴性对照RNAi质粒,采用阳离子脂质体Lipofectamine2000作为转染试剂将其转染人喉癌细胞株Hep-2,通过RT-PCR及Western Blot方法检测转染效率,筛选出抑制效果最好的c-Met-siRNA序列;通过四甲基偶氮唑蓝(MTT)法、运动实验及侵袭实验比较转染前后细胞的生长、运动及侵袭能力.在裸鼠喉癌皮下荷瘤模型模拟c-Met-siRNA基因治疗实验中,采用Western Blot法检测重组质粒对c-Met基因及MMP-9、VEGF基因表达的影响.结果 pSilencer2.0/c-Met-shRNA转染人喉癌细胞株Hep-2后,c-Met的mRNA和蛋白表达水平显著降低(P值分别为0.003和0.02),细胞的生长、运动及侵袭均受到明显抑制(P值分别为0.001,0.004和0.004).肿瘤接种到裸鼠后第35天,重组质粒组肿瘤体积为(138±27)mm~3,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.01);重组质粒组瘤体内c-Met、MMP-9、VEGF基因表达率比对照组明显降低(P<0.05).结论 c-Met-siRNA能成功下调靶基因的表达,并能显著抑制喉癌Hep-2细胞的生长、运动、侵袭及移植裸鼠成瘤后的生长,siRNA表达质粒介导的基因治疗有希望成为喉癌靶向性c-Met治疗的新策略.     

EGFL7基因RNAi重组慢病毒的构建及其对喉癌细胞侵袭的抑制

目的:构建类表皮生长因子域7(EGFL7)基因RNA干扰(RNAi)重组慢病毒,观察其对喉癌体外侵袭的抑制作用。方法:筛选确定的EGFL7基因RNAi有效靶序列,合成靶序列的Oligo DNA,与含H1启动子和绿色荧光蛋白(GFP)的pLV载体连接产生LV-sh EGFL7慢病毒载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定。用重组慢病毒体外转导喉癌细胞,Western blot法检测喉癌细胞EGFL7蛋白表达。Boyden侵袭小室法实验观察转导shRNA后的喉癌细胞侵袭能力的变化。利用克隆形成实验检测EGFL7基因沉默对Hep-2细胞集落形成能力的影响。结果:成功构建EGFL7的慢病毒载体LV-sh EGFL7,包装慢病毒,浓缩病毒悬液的滴度为5×108 TU/L。转导siRNA的喉癌细胞EGFL7蛋白表达阴性。EGFL7siRNA转导后喉癌胞体外侵袭能力下降。EGFL7基因沉默组细胞克隆集落形成率与Hep-2组细胞及空载体组细胞比较,细胞克隆集落形成率显著减低。结论:成功构建人EGFL7基因RNAi慢病毒载体,EGFL7基因沉默对喉癌细胞体外侵袭有明显的抑制作用。沉默EGFL7后,Hep-2细胞集落形成能力显著减低,...     

小RNA干扰细胞周期蛋白Y基因表达对喉癌Hep-2细胞增殖的影响

目的 利用RNA干扰技术下调细胞周期蛋白Y(Cyclin Y,CCNY)基因的表达,观察其对喉癌Hep-2细胞增殖的影响.方法 构建针对CCNY基因的短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)真核表达载体,包装慢病毒感染喉癌Hep-2细胞.将细胞分为2组,对照组和实验组(感染CCNY shRNA慢病毒组).运用Real-time PCR检测CCNY在RNA水平的变化;四甲基偶氮唑蓝法和平板克隆形成实验检测CCNY表达下调对细胞增殖的影响.结果 成功包装表达CCNYshRNA的慢病毒并感染Hep-2细胞,shRNA下调CCNY的表达后,与对照组相比CCNY在mRNA水平的表达显著下降,抑制率为75.3％ (P ＜0.05).表达CCNY shRNA的慢病毒感染5d后,继续培养6d,细胞的生长明显受到抑制(P ＜0.001).细胞在体外培养10 d后形成克隆的潜力降低了60％.结论 靶向CCNY基因RNA干扰能够阻抑喉癌Hep-2细胞的CCNY表达,抑制细胞增殖,CCNY基因有望成为喉癌基因治疗靶点.     

RAN干扰抑制AQP1表达对Hep-2细胞迁移能力影响的实验

目的通过RNA干扰（RNA interference,RNAi）抑制Hep-2细胞中水通道蛋白-1（aquaporin-1,AQP1）的表达,探讨AQP1对喉癌细胞黏附、运动及侵袭能力的影响。方法构建AQPl特异性的siRNA重组质粒,免疫组化检测RNAi抑制AQP1表达的效果;分别用细胞基质黏附实验、Transwell小室和Matrigel基质侵袭实验检测细胞黏附、运动和侵袭能力。结果AQP1-siRNA重组质粒有效的抑制了Hep-2细胞中AQP1的表达。细胞基质黏附实验结果显示：Hep-2细胞与细胞外基质的黏附率,AQP1-siRNA实验组为（41．6±4．2）％与阴性对照组（43．6±3．9）％和空白对照组（45．2±4．0）％无明显差异（尸均〉0．05）;体外细胞运动和侵袭实验结果显示：Hep-2的穿膜细胞数,实验组分别为（36±3）和（23±4）个／高倍镜,显著低于空白对照组的（70±5）和（65±4）个,高倍镜以及阴性对照组的（72±4）和（69±4）个／高倍镜（P均〈0．01）,而后两组细胞间运动和侵袭能力方面差异均无显著性（P〉0．05）。结论AQP1 RNAi重组质粒能够阻断AQP1的表达,对Hep-2细胞的黏附力没有影响,但能够抑制喉癌细胞的运动和侵袭能力,与喉癌的转移机制密切相关。     

肺腺癌转移相关转录本-1沉默对喉癌细胞增殖、凋亡及丝氨酸苏氨酸蛋白激酶通路的影响

目的　探讨RNA干扰技术（RNAi）沉默肺腺癌转移相关转录本-1（MALAT-1）基因对喉癌细胞增殖、凋亡及丝氨酸苏氨酸蛋白激酶（Akt）信号通路影响。方法  体外培养人喉癌细胞Hep-2、正常永生化表皮细胞Hacat,采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测细胞中MALAT-1mRNA表达水平。采用RNAi技术将MALAT-1阴性对照质粒、si-MALAT1分别转染至Hep-2细胞,命名为si-NC组、si-MALAT1组,未处理组作为空白对照组,分别检测三组Hep-2细胞中MALAT-1及B淋巴细胞瘤-2基因（Bcl-2）、Bax、caspase-3 mRNA表达水平、Bcl-2、Bax、caspase-3、磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）及其磷酸化蛋白（p-PI3K）、Akt及其磷酸化蛋白（p-Akt）蛋白表达情况以及细胞增殖及凋亡情况。结果　与正常细胞相比,喉癌Hep-2细胞中MALAT-1 mRNA表达水平（3.24±1.02）升高（P＜0.05）;与空白对照组、si-NC组相比,si-MALAT-1组Hep-2细胞中MALAT-1 mRNA表达水平（0.47±0.08）及Bcl-2 mRNA（0.56±0.09）及蛋白（0.31±0.05）表达降低,细胞增殖抑制率及凋亡率[（20.48±3.41）%]均升高,Bax、caspase-3mRNA（3.02±0.50、2.58±0.43）及蛋白表达（0.86±0.14、0.94±0.16）均升高,p-PI3K、p-Akt蛋白表达（0.57±0.10、0.51±0.08）均降低（P 均＜0.05）。结论　MALAT-1沉默可抑制人喉癌细胞系Hep-2细胞增殖并提高其凋亡率,推测可能通过影响Akt信号通路诱导癌细胞凋亡。