贝氏柯克斯体5种重组表面蛋白抗原包被酶联免疫吸附试验的特异性和敏感性分析

目的 使用贝氏柯克斯体5种重组表面蛋白作为包被抗原的酶联免疫吸附试验用于血清学检测的特异性和敏感性分析。方法 本研究建立由贝氏柯克斯体的Com1、GroEL、Mip、OmpH、RplL重组表面蛋白抗原分别包被的酶联免疫吸附试验(ELISA)方法,然后分别检测贝氏柯克斯体实验感染小鼠血清和Q热患者血清中IgG特异性抗体。结果 8份贝氏柯克斯体感染小鼠血清中除1份血清与RplL反应为阴性外其它均为阳性;11份Q热患者血清中除1份血清与RplL、1份血清与OmpH反应为阴性外,其它血清反应均为阳性。将这5种重组蛋白分别与莫氏立克次体、黑龙江立克次体、恙虫病东方体实验感染小鼠血清反应,除1份黑龙江立克次体感染小鼠血清与GroEL反应为阳性外,其它血清反应均为阴性。另外,Com1对斑疹伤寒、斑点热、恙虫病患者血清的阳性反应率平均为22.2%,GroEL为25.0%,Mip为25.0%,OmpH为25.0%,RplL为13.9%。结论 这些结果证明这5种重组蛋白抗原均可被贝氏柯克斯体感染血清所识别。所建立的ELISA方法具有良好特异性和敏感性,可用作Q热血清学诊断。     

贝氏柯克斯体的分子致病机理研究进展北大核心CSCD

贝氏柯克斯体(Coxiella burnetii,简写为Cb)是一类重要的人兽共患细胞内寄生菌,在家畜中广泛感染,感染人可导致不明发热—俗称Q热,或伴有肺炎、心内膜炎、肝炎、脊髓炎等。在我国Q热是一类被忽视的烈性传染病,误诊漏诊众多。需要警惕的是该病有突发爆发的可能。以荷兰为例,自2007至2010年,超过4 000荷兰人感染了Q热。近年来国外的Q热研究进展很快,特别是新出现的Cb无细胞培养和遗传学操作方法促进了Cb的致病机理研究,为研制新型实用的Q热防治策略提供了机遇。本文简要综述了Cb与宿主细胞间的相互作用机制,主要是脂多糖的免疫调节功能、囊泡发育机制及四型分泌系统的可能作用机理。     

氯仿-甲醇提取贝氏柯克斯体组分Q热疫苗的免疫保护性评价

目的动物实验评价采用国内分离株研制的氯仿-甲醇提取贝氏柯克斯体组分Q热疫苗(CMRV)的免疫保护性。方法将三批小量制备的CMRV和灭活贝氏柯克斯体Q热疫苗(WCV)分别用1μg、10μg、100μg三个剂量皮下注射免疫BALB/c小鼠,4周后用初次免疫的一半剂量腹腔注射加强免疫1次,2周后用107的贝氏柯克斯体强毒株腹腔注射感染免疫小鼠,感染第7d活杀小鼠、摘取小鼠脾脏,用荧光定量PCR检测小鼠脾脏组织的贝氏柯克斯体。结果所有Q热疫苗免疫组的小鼠脾脏荷菌量均显著少于非免疫组,100μg免疫组的荷菌量显著低于10μg免疫组,10μg疫苗组显著低于1μg免疫组。每批CMRV免疫组与相同剂量WCV免疫组之间的贝氏柯克斯体含量无显著差异。结论国内分离株研制的氯仿-甲醇提取贝氏柯克斯体组分Q热疫苗具有与灭活Q热疫苗一样良好的抗贝氏柯克斯体感染的免疫保护性。     

贝氏柯克斯体热休克蛋白B基因的克隆与表达

目的克隆贝氏柯克斯体(Coxiellaburnetii)热休克蛋白B(HspB)基因并在大肠杆菌细胞内高效表达。方法采用PCR方法,从贝氏柯克斯体新桥株基因组DNA中扩增出HspB的基因片段,鉴定后将目的片段与原核表达载体pQE30连接,构建重组表达质粒pQE30/hspB,IPTG诱导该重组质粒转化的大肠杆菌产生HspB重组蛋白。结果(1)PCR扩增获得长约1556bp的hspB基因片段。(2)SDS-PAGE证明,HspB重组蛋白的分子量为53.7kDa。(3)经薄层扫描分析,表达蛋白约占全菌体蛋白的71.2%。结论贝氏柯克斯体hspB基因在大肠杆菌中获得了高效表达,为Q热疫苗的研制提供了一易于获得的候选蛋白分子。     

PCR和DNA斑点杂交分析贝氏柯克斯体的核酸标识

目的确认贝氏柯克斯体特异的核酸标识。方法用PCR法特异扩增贝氏柯克斯体24kDa,27kDa、30kDa、34kDa、热休克蛋白B等表面蛋白基因,以及23SrRNA插入序列和16S23SrRNA间区序列等基因片段,从DNA电泳凝胶中回收纯化PCR扩增的目的DNA片段,用地高辛随机引物标记法标记目的DNA片段作探针,行DNA斑点杂交。结果PCR扩得的7个贝氏柯克斯体DNA片段探针只能与贝氏柯克斯体基因组DNA杂交而不能与其他种属的立克次体的基因组杂交,每种探针检测同源目的基因的灵敏度可达到10pg。结论这7种贝氏柯克斯体DNA片段是贝氏柯克斯体特异的DNA片段,可作为贝氏柯克斯体的核酸标识,基于它们的序列设计的引物和探针具有极高的贝氏柯克斯体种特异性。     

贝氏柯克斯体感染小鼠血清与其毒力相关蛋白的免疫印迹反应

目的筛选与贝氏柯克斯体感染血清反应的贝氏柯克斯体毒力相关蛋白。方法以贝氏柯克斯体标准株九里株为模板,采用PCR扩增包括IV型分泌系统、分泌性蛋白和膜蛋白在内的毒力及毒力相关的基因,将扩得目的基因片段与原核表达质粒pET32a重组,将重组质粒转化大肠杆菌,用贝氏柯克斯体实验感染小鼠血清与转化大肠杆菌作免疫印迹。结果设计173对引物共扩增出170个目的基因,经PCR及酶切鉴定,有155个基因与pET32a质粒重组成功,SDS-PAGE电泳分析发现,共有104个转化菌表达目的蛋白,在104个重组蛋白中,筛选到32个与贝氏柯克斯体感染小鼠血清反应的重组蛋白。结论这些与贝氏柯克斯体感染血清反应的毒力相关蛋白具有良好的免疫原性和免疫反应性。     

滇西鼠疫疫源地野外鼠形动物感染贝氏柯克斯体的调查

目的调查滇西鼠疫疫源地野外鼠形动物贝氏柯克斯体感染情况。方法2015年12月至2016年10月,课题组以云南省玉龙县、剑川县和梁河县鼠疫疫源地为采样点,使用夹夜法在不同季节、不同海拔、不同生境捕获野外鼠形动物,收集到2 524份肝脾样本。采用巢氏PCR方法对Q热病原体贝氏柯克斯体(Coxiella burnetii,Cb)Com1基因的保守片段进行扩增。应用SPSS20.0软件,采用χ²检验或Fisher确切概率法分析不同疫源地、海拔梯度、生境、季节、性别间Cb在野外鼠形动物中的流行分布情况。结果检测2 524份样本,Cb阳性23份,阳性率为0.91%。检出Cb的鼠形动物包括齐氏姬鼠、中华姬鼠、黄胸鼠、社鼠、锡金小鼠、大绒鼠、臭鼩鼱和毛猬。不同生境、性别间野外鼠形动物Cb阳性率无差异(χ_生境²=6.514,χ_性别²=0.076,P>0.05);季节间Cb阳性率春季(2.44%)高于秋季(0.37%)(χ²=11.550,P<0.008);剑川鼠...     

贝氏柯克斯体新桥株刺激人树突状细胞的表型分析

目的树突状细胞(dendritic cell,DC)具有成熟与未成熟两种形态,前者是早期免疫应答强有力的抗原呈递细胞,后者能诱导免疫耐受。分析贝氏柯克斯体(Coxiella burnetii,Cb)、Cb脂多糖(LPS)、去除LPS的Cb对DC的激活作用,探讨Cb逃逸宿主免疫清除的机理。方法从健康成年人的外周血中分离单核细胞,加入GM-CSF和IL-4体外培养单核细胞成未成熟DC;分别用灭活Cb、Cb LPS、去LPS Cb刺激体外培养未成熟DC,大肠杆菌LPS作为阳性对照刺激因子;刺激后24h,用流式细胞仪(fluorescence activated cell sorter,FACS)检测DC表面分子:成熟标记分子CD83与共刺激分子CD40、CD58、CD80、CD86。结果去LPS Cb刺激DC表面分子表达水平与大肠杆菌LPS刺激最相近,显著强于未刺激DC,而灭活Cb、Cb LPS刺激DC表面分子CD83、CD40、CD80、CD86的表达在一低水平。结论LPS遮盖了Cb激活DC所需的表面分子,除去LPS后暴露的分子与DC相互作用,对DC的成熟刺激作用显著高于灭活Cb、Cb LPS的刺激作用。LPS的存在有利于贝氏柯克斯体逃逸宿主的免疫清除。     

氯仿-甲醇提取贝氏柯克斯体残存组分Q热疫苗的免疫原性及免疫保护性研究

目的实验评价氯仿-甲醇提取贝氏柯克斯体残存组分(CMR)疫苗的免疫特性及免疫保护性。方法采用国内分离贝氏柯克斯体新桥株制备CMR疫苗,用CMR免疫Balb/c小鼠;采用间接免疫荧光法检测CMR免疫小鼠血清特异性抗体水平和用淋巴细胞增殖试验评价CMR疫苗体外刺激小鼠脾细胞增殖的能力;以贝氏柯克斯体攻击免疫小鼠和用贝氏柯克斯体特异的荧光定量PCR检测感染小鼠血和脾脏样本。结果CMR免疫第4周起,小鼠血清中检出高水平的特异性抗体,CMR加氢氧化铝佐剂免疫小鼠的血清特异性抗体显著高于未加佐剂组。CMR在体外刺激正常小鼠和免疫小鼠脾淋巴细胞增殖水平显著高于对照组,WCV则抑制正常脾淋巴细胞增殖。三种剂量(30μg、10μg、1μg/只)CMR免疫小鼠血和脾脏样本贝氏柯克斯体含量显著低于未免疫组,以30μg组及加佐剂免疫小鼠的样本含菌量更显著低于对照组。结论采用我国分离株制备的CMR疫苗能诱导机体产生高效特异性体液免疫和细胞免疫应答,使机体抵抗大剂量的贝氏柯克斯体感染,具有良好的免疫原性和免疫保护性;氢氧化铝佐剂能显著增强CMR疫苗的免疫保护效能。     

HIV酶联免疫吸附试验检测设置灰区的必要性北大核心

国内、外酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）试剂生产厂家均未对其试剂设置灰区,而有没有必要设置灰区以及灰区范围如何设置,一直是实验室讨论的焦点。国内大量文献报道,灰区样本中存在一定数量的阳性结果,特别是在乙型肝炎和丙型肝炎项目上,而艾滋病病毒（Human immune deficiency virus,HIV）和苍白球密螺旋体（Treponema pallidum,TP）灰区样本的确证实验少有阳性报道,故对HIV检测灰区的样本进行确证实验和核酸检测（Nucleic acid amplification test,NAT）,探讨灰区设置的必要性。     

酶联免疫吸附试验不稳定因素的分析

酶联免疫吸附试验 (Enzyme linked immunosorbent assay,简称 EL ISA)是本世纪 70年代发展起来的一种检测技术 ,具有敏感、特异、操作简便、重复性好等优点 ,已在疾病诊断、科研等医学领域中得到广泛应用。由于该技术涉及因素较多 ,在使用中常常遇到试验不够稳定的问题 ,笔者对不稳定因素进行了分析并将解决这些问题的一些经验和体会叙述如下。1　产品质量的影响1.1　酶标板 :目前广泛应用的固相载体有两种 ,即聚苯乙烯和聚氯乙烯微量反应板 ,简称酶标板。聚苯乙烯板质地坚硬 ,易于操作 ,但吸附能力较聚氯乙烯板差 ;聚氯乙烯吸附能力强 ,…     

两种不同初筛酶联免疫吸附试验试剂联合检测以替代艾滋病病毒抗体蛋白印迹试验确认检测的对比分析

目的 为评价两种不同初筛酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂联合检测艾滋病病毒（HIV）抗体的可靠性，以替代艾滋病病毒（HIV）蛋白印迹（Western blotting,WB)确认法。方法 79份初检与HIV抗体阳性的吸毒人员血清，重新统一用两种抗体初筛ELISA试剂（Vironostika HIV Uni-FormⅡ plus 0和UBI HIV-1/2EIA)进行复测，之后随机选择前51份样品进一步做WB确认，并做对比分析。结果 51份血清中，有49份样品2次初筛复测时至少有1次复测的结果显示为S／CO≥6，它们的WB确认结果均为HIV抗体阳性；其余的2份样品2次初筛复测时，其S／CO均＜6，但其中1份（样品“05”）的WB结果为HIV抗体阴性，1份（样品“584”）为HIV抗体阳性。确认为HIV阴性的样品“05”，在整个初筛的3次检测中曾2次出现过S／CO＞1；确认为HIV抗体阳性的样品“584”，虽然3次初筛检测中S／CO值均＞1，但因本试验中2次复测得到的S／CO都＜6，因而其确认结果亦显示出较少抗原带，即只有p24和Gp160。结论 两种不同原理的ELISA试剂（最好为进口试剂）联合检测HIV抗体可替代WB确认法，以监测具有一定HIV流行率的风险人群（如哨点监测人群）的HIV／艾滋病疫情。报告为HIV抗体阳性的临界判断指标采用2次初筛S／CO≥6应是可靠的；初筛中，对6＞S／CO≥1的样品在报告群体疫情时需用WB法进一步证实。凡涉及通知被检测者本人结果的样品，为慎重起见，应该采用WB法确认，即使2次初筛结果均为HIV抗体阳性的样品也需如此。     

酶联免疫吸附试验检测猪血清的乙型脑炎抗体的评价

本文报告用酶联免疫吸附试验捕获法和间接法分别检测猪血清乙型脑炎IgM和IgG抗体。酶标法测得的IgM和IgG滴度与血凝抑制试验滴度显著相关。但前者可测出70％的IgG型抗体和63.3％的IgM型抗体,而后者仅56.7％阳性。在乙脑流行季节,两种类型的乙脑抗体出现几乎同样快。IgG可持续终身。IgM仅在短期内检测到,当表示猪乙脑新感染。     

四种抗原间接酶联免疫吸附试验诊断广州管圆虫病实验研究

用广州管圆线虫雌虫全虫及其消化系统、生殖系统、体壁分别制备四种粗抗原，用间接酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）检测广州管圆线虫感染大鼠血清、曼氏迭宫绦虫裂头蚴抗原免疫大鼠血清，猪蛔虫抗原免疫大鼠血清及日本血吸虫感染大鼠血清抗体。结果，对广州管圆线虫感染大鼠血清四种抗原，ＥＬＩＳＡ阳性率和ＯＤ比值比较，差异无显著性，均具有较高敏感性和特异性。所用四种粗抗原分别与三种异源性血清进行交叉试验，结果，除一份猪蛔虫抗原免疫大鼠血清外均为阴性，广州管圆线虫感染大鼠血清ＯＤ比值均高于三种异源性血清。     

用于布鲁氏菌病酶联免疫吸附试验的三类抗原比较研究

应用布鲁氏菌超声波破碎抗原、脂多糖抗原和试管凝集反应抗原做ELISA分别对实验性布鲁氏菌感染豚鼠及慢性期布鲁氏菌病患者血清抗体的比较研究,初步结果表明,这三类抗原制剂均可做ELISA,用于布鲁氏菌病机体血清抗体的检测。并且与常规布鲁氏菌病血清学试验相比,不仅特异性较好,而且敏感性更高。在这三类抗原制剂中,以超抗的敏感性为最高,SAT抗原次之,而LPS抗原为最差。     

两种不同初筛酶联免疫吸附试验试剂联合检测以替代艾滋病病毒抗体蛋白印迹试验确认检测的对比分析

目的　为评价两种不同初筛酶联免疫吸附试验 (ELISA)试剂联合检测艾滋病病毒 (HIV)抗体的可靠性 ,以替代艾滋病病毒 (HIV)蛋白印迹 (Westernblotting ,WB)确认法。 方法　79份初检为HIV抗体阳性的吸毒人员血清 ,重新统一用两种抗体初筛ELISA试剂 (Vironostika○RHIVUni FormⅡ plus 0和UBIHIV 1 / 2EIA)进行复测 ,之后随机选择前 51份样品进一步做WB确认 ,并做对比分析。 结果　51份血清中 ,有 49份样品 2次初筛复测时至少有 1次复测的结果显示为S/CO≥ 6 ,它们的WB确认结果均为HIV抗体阳性 ;其余的 2份样品 2次初筛复测时 ,其S/CO均 <6 ,但其中 1份 (样品“0 5”)的WB结果为HIV抗体阴性 ,1份 (样品“584”)为HIV抗体阳性。确认为HIV抗体阴性的样品“0 5” ,在整个初筛的 3次检测中曾 2次出现过S/CO >1 ;确认为HIV抗体阳性的样品“584” ,虽然 3次初筛检测中S/CO值均 >1 ,但因本试验中 2次复测得到的S/CO都 <6 ,因而其确认结果亦显示出较少抗原带 ,即只有p2 4和Gp1 60。 结论　两种不同原理的ELISA试剂 (最好为进口试剂 )联合检测HIV抗体可替代WB确认法 ,以监测具有一定HIV流行率的风险人群 (如哨点监测人群 )的HIV/艾滋病疫情。报告为HIV抗体阳性的临界判断指标采用 2次初筛S/CO≥ 6应是可靠的 ;初筛中     

酶联免疫吸附试验室内质控影响因素的分析

酶联免疫吸附试验（ELISA）检测法具有敏感性高、特异性强、快速等优点而被临床广泛使用，但是由于该方法的影响因素较多，其室内质量控制一直是各试验室的难题。但为了确定评价实验室工作的可靠程度以及报告能否发出，室内质控是必须和必要的。我科室多年来一直重视室内质量控制，并经常参加全国和全军室间质控评价，用以验证我室检测结果的灵敏度和准确度。本文就我科室在建立ELISA室内质控过程中遇到的影响因素分析如下。     

酶联免疫吸附试验法测定抗结核菌抗原的IgG抗体在肺结核诊断中的价值

本文以酶联免疫吸附试验法对痰菌阳性肺结核、痰菌阴性肺结核、矽肺合并活动性肺结核患者和健康对照组(四组共191例)行血中抗结核菌抗原的IgG 抗体测定,四组的阳性率分别为94.4%、90.8%、89.5%和6%.结果表明该抗体的测定时肺结核的诊断具有一定的临床价值.对矽肺和合并结核两者具有鉴别诊断价值.     

应用酶联免疫吸附试验诊断肺螨病的观察

本文采用生物素一亲和素及葡萄球菌A蛋自酶联免疫吸附试验(ABC-ELISA和SPA-ELISA),检测了经证实为肺肺病的51名患者血清的尘螨性抗体,结果ABC-ELISA阳性率为82.35％,SPA-ELISA阳性率为52.94％,初步认为ABC-ELISA检测尘螨性抗体可作为一种简便实用的肺螨病辅助诊断方法。     

阴道毛滴虫整虫抗原和单克隆抗体进行斑点酶联免疫吸附试验条件的探讨

以阴道毛滴虫整虫抗原和单克隆抗体进行ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ试验，分别观察了不同的虫体数量、孵育时间、封闭剂型、抗原类型、ＮＣ膜及抗原保存时间与温度等条件对试验效果的影响。结果显示以２．５×１０７细胞／ｍｌ的虫数制备抗原膜，用０．５％脱脂奶粉１次性封闭１ｈ（３７℃），单克隆抗体和酶分别孵育１ｈ（３７℃）为最佳条件。在４℃和－２０℃温度下，抗原可保存４个月。