人肿瘤浸润淋巴细胞用TNF－a基因作逆转录病毒的转导

通过逆转录病毒将肿瘤坏死因子（ＴＮＦ）基因转导到取自卵巢癌和胰腺癌病人的肿瘤浸润淋巴细胞（ＴＩＬ）。我们发现ＴＮＦ基因转导的ＴＩＬ（ＴＮＦ－ＴＩＬ）产生的ＴＮＦ水平比新霉素磷酸转移酶基因转导的ＴＩＬ（ｎｅｏ－ＴＩＬ）产生的ＴＮＦ水平更高。尤其重要的是ＴＮＦ－ＴＩＬ对某些建株的肿瘤细胞株和自身肿瘤细胞的细胞毒性作用也比ｎｅｏ－ＴＩＬ更强。ＴＮＦ基因转导的ＴＩＬ有希望在临床上用于癌症的过继免疫治疗。     

人肿瘤浸润淋巴细胞用TNF－a基因作逆转录病毒的转导

通过逆转录病毒将肿瘤坏死因子（ＴＮＦ）基因转导到取自卵巢癌和胰腺癌病人的肿瘤浸润淋巴细胞（ＴＩＬ）。我们发现ＴＮＦ基因转导的ＴＩＬ（ＴＮＦ－ＴＩＬ）产生的ＴＮＦ水平比新霉素磷酸转移酶基因转导的ＴＩＬ（ｎｅｏ－ＴＩＬ）产生的ＴＮＦ水平更高。尤其重要的是ＴＮＦ－ＴＩＬ对某些建株的肿瘤细胞株和自身肿瘤细胞的细胞毒性作用也比ｎｅｏ－ＴＩＬ更强。ＴＮＦ基因转导的ＴＩＬ有希望在临床上用于癌症的过继免疫治疗。     

肿瘤坏死因子α基因转染人脑胶质瘤浸润淋巴细胞的实验研究

采用脂质体转染技术将能表达肿瘤坏死因子α（ＴＮＦ－α）基因的重组逆转录病毒质粒ｐＬ（ＴＮＦ－α）ＳＮ导入病毒包装细胞ＰＡ３１７，在细胞培养上清液中得到重组病毒，滴度为１．４×１０９ＣＦＵ／Ｌ。将此病毒上清液感染人脑胶质瘤浸润淋巴细胞（ＴＩＬ），用Ｇ４１８筛选出能表达标记基因ＮｅｏＲ的阳性克隆，ＥＬＩＳＡ法测得ＮｅｏＲ阳性ＴＩＬ培养上清液中存在ＴＮＦ－α，可达５３０ｎｇ／Ｌ，Ｌ９２９依赖细胞法并测出上清液中有ＴＮＦ－α生物学活性。结果表明，我们构建的重组逆转录病毒可介导ＴＮＦ－α基因在人脑胶质瘤ＴＩＬ中的表达     

逆转录病毒中介TNF基因导入肿瘤浸润淋巴细胞的研究

利用重组有ＴＮＦ－α基因的逆转录病毒载体ＰＬＪ－ＴＮＦ转染包装细胞系φＣＲＩＰ和φ－ＣＲＥ，经Ｇ４１８选择后，分离到能产生重组ＴＮＦ－α基因的病毒粒子分泌细胞克隆ＰＬＪＣ－５，继而感染从胃癌组织中分离的肿瘤浸润淋巴细胞（ＴＩＬ），并对基因转导后的ＴＩＬ细胞的增殖、表型、抗癌活性及ＴＮＦ分泌量进行了检测。结果表明：转导ＴＮＦ基因的ＴＩＬ对其细胞增殖和免疫分型无明显影响，而其抗瘤活性和ＴＮＦ分泌量较转导前有明显地提高。     

MTT比色法检测MGC803^T细胞毒效应的研究

用插入突变的膜结合型ＴＮＦ－α基因的重且逆转录病毒载体转染人胃癌细胞ＭＧＣ，获得膜结合型ＴＮＦ－α基因转染阳性的人胃癌细胞ＭＧＣ８０３（ＭＧＣ８０３＾Ｔ）。用ＭＴＴ比色法、＾３Ｈ－ＴｄＲ释放法检测ＭＧＣ８０３＾Ｔ及未转染的人胃癌细胞ＭＧＣ８０３（ＭＧＣ８０３＾Ｎ）细胞表面ＴＮＦ－α的细胞毒效应。结果表明，ＭＧＣ８００＾Ｔ对鼠纤维肉瘤细胞Ｌ９２９有杀伤作用，而对照细胞ＭＧＣ８００＾Ｎ无杀伤作用，说明     

转染TNFα基因对胶质瘤细胞致瘤性的影响

目的 研究转染肿瘤坏死因子α（ＴＮＦα）基因的胶质瘤的致瘤性。方法 运用ＭｏＭＬＶ逆转录病毒载体,将ＴＮＦα基因转导至人胶质瘤细胞ＳＨＧ－４４,用Ｇ４１８筛选出阳性细胞克隆,以细胞培养检测细胞生长抑制,以裸鼠接种研究其致瘤性。结果 转染细胞培养上清液中ＴＮＦα含量分别为（５１９８．７±３７５７．４）和（３２１７．４±１１８０．６）ｐｇ／ｍｌ（Ｐ〈０．０５）,其生物活性达３２０．０ｕ／ｍｌ。运用ＲＴ     

转染TNFα基因对胶质瘤细胞致瘤性的影响

研究转染肿瘤坏死因子α（ｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒα,ＴＮＦα）基因的胶质瘤细胞的致瘤性。方法运用ＭｏＭＬＶ逆转录病毒载体,将ＴＮＦα基因转导至人胶质瘤细胞ＳＨＧ－４４,用Ｇ４１８筛选出阳性细胞克隆,以细胞培养检测细胞生长抑制,以裸鼠接种研究其致瘤性。结果转染细胞培养上清液中ＴＮＦα含量分别为（５１９８．７±３７５７．４）和（３２１７．４±１１８０．６）ｐｇｍｌ（Ｐ＜０．０５）,其生物活性达３２０．０ｕｍｌ。运用ＲＴ－ＰＣＲ检测ＴＮＦαｍＲＮＡ特异性表达。细胞培养发现：转染ＴＮＦα基因的细胞生长受抑制,Ｇ２－Ｍ期缩短而Ｇ０－Ｇ１期延长。裸鼠接种试验发现转染ＴＮＦα基因的胶质瘤细胞致瘤性下降,早期出现明显坏死。未转染ＴＮＦα基因的胶质瘤细胞混有１０％的转染ＴＮＦα基因的细胞,其生长也受到抑制。结论转染ＴＮＦα基因的胶质瘤细胞的致瘤性下降。     

外源性TNF－α基因修饰口腔鳞癌DNL的实验研究

采用缺陷型逆转录病毒转导人ＴＮＦ－α基因至口腔癌ＤＮＬ，并应用ＰＣＢ技术、ＴＮＦ－α活性检测技术、Ｇ４１８筛选试验对ＤＮＬ中外源基因及其上清液中的ＴＮＦ－α活性进行了检测。结果：１．转导基因的ＤＮＬ中有外源基因存在；２．转导基因的ＤＮＬ上清液中有高活性的ＴＮＦ－α；３．转导基因ＤＮＬ能在Ｇ４１８培养基中生长。表明缺陷型逆转录病毒载体能够将ＴＮＦ－α基因导入口腔鳞癌ＤＮＬ中表达，转导基因ＤＮＬ能够分泌高活性的ＴＮＦ－α。该结果为在口腔癌领域开展细胞因子基因治疗奠定了基础。     

逆转录病毒介导癌基因疗法体外安全实验

从逆转录病毒ｐＬＸＳＮ与人ＩＬ－２ｃＤＮＡ基因进行重组，包括ＰＡ３１７细胞，建立逆转录病毒包装体系细胞ＰＡ３１７／ｐＬＩＬ－２ＳＮ。用病毒上清液转导人淋巴细胞（ＴＩＬ，ＰＢＬ）和３株人腺癌细胞株（ＳＰＣ－Ａ１，ＭＫＮ－ＨｅｐＧ２）对转ＩＬ－２基因的淋巴细胞（ＴＩＬ／ＩＬ－２，ＰＢＬ／ＩＬ－２）和转ＩＬ－２基因的人癌细胞（ＳＰＣ－Ａ２／ＩＬ－２，ＭＫＮ－４５／ＩＬ－２，ＨｅｐＧ２／ＩＬ２）进行体外安     

导入TNF-αcDNA片断鼠LAK细胞对小鼠移植肿瘤治疗的初步观察

利用逆转录病毒中介的基因转移技术，将重组人ＴＮＦ－αｃＤＮＡ功能片断导入小鼠脾ＬＡＫ细胞中，然后用此细胞对荷瘤小鼠局部治疗，并以导入ＮｅｏＲ基因的ＬＡＫ细胞做对照。结果，经导有ＴＮＦ－α基因的ＬＡＫ细胞治疗的小鼠肿瘤明显变小，甚至消失，小鼠寿命亦明显高于对照组。说明ＴＮＦ－α基因的导入在小鼠体内具有明显的抗瘤效应     

白细胞介素12基因修饰的Lewis肺癌瘤苗的抗肿瘤免疫作用

目的：研究白细胞介素12（IL-12）基因修饰的Lewis肺癌瘤苗的抗肿瘤免疫作用。方法：用含IL-12基因的腺病毒载体,在体外以不同感染系数感染Lewis肺癌细胞,并分别接种于C57BL/6小鼠皮下,观察其致瘤性的变化;并用Lewis肺癌细胞及B16黑色素瘤细胞再 次攻击免疫后的C57BL/6小鼠,观察肿瘤发生情况。 结果：以各种感染系数AdCMVIL-12制备的瘤苗,接种于小鼠皮下后,无肿瘤生长,完全消除了Lewis肺癌细胞的致瘤性;瘤苗注射6 d后,用Lewis肺癌细胞再次攻击,仍无肿瘤生长,抑瘤率达100%;用B16黑色素瘤细胞攻击,10~12 d均有肿瘤生长,说明此瘤苗具有肿瘤特异性。结论：AdCMVIL-12能消除Lewis肺癌细胞的致瘤性,并能诱导显著的抗肿瘤免疫反应,对肿 瘤的复发及转移有较好疗效。     

两种重组腺相关病毒介导增强型绿色荧光蛋白转染大鼠成骨细胞效率的体外研究

目的 比较2种不同重组腺相关病毒(rAAV)介导的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)对大鼠成骨细胞的转染效率,评价其作为成骨细胞病变基因治疗载体的可行性.方法 采用Ⅰ型胶原酶阶段消化法分离培养大鼠成骨细胞并鉴定,rAAV-EGFP按转染复数(MOI) 1×10~3、1×10~4、1×10~5、5×10~5分为只加rAAV和rAAV与腺病毒(ADV)共同转染组转染成骨细胞,倒置荧光显微镜观察转染后荧光强度随转染时间的变化,流式细胞仪检测rAAV2/6-EGFP和rAAV2/9-EGFP对成骨细胞的转染效率及荧光强度,确定转染的较佳MOI值,以此值用MTT法描绘细胞生长曲线,观察rAAV对细胞的毒性.结果 分离培养的细胞具有体内成骨细胞的生物学行为,rAAV对成骨细胞的转染效率随MOI值的增加而提高,ADV(-)组荧光强度在第5 d达到高峰,当MOI为1×10~5时,rAAV2/6-EGFP和rAAV2/9-EGFP的转染效率分别为90.2%、66.1%,MOI值增到5×10~5时转染效率无显著提高;ADV(+)组荧光强度在第3 d即达高峰,MOI值为5×10~5时,rAAV2/6-EGFP和rAAV2/9-EGFP的转染效率为47.6%、30.5%.细胞生长正常,rAAV对细胞活性影响小.结论 两种病毒载体对成骨细胞转染效率均较高,其中rAAV2/6高于rAAV2/9,是一种理想的基因治疗载体.     

肝癌术后应用白介素12及白介素2诱导的自体肿瘤浸润淋巴细胞的临床观察

目的 观察肝癌患者术后单用白细胞介素2(IL-2)培养和IL-12+IL-2培养的自体肝癌肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)输注后,其特异性杀伤力、增殖能力、细胞因子的改变以及细胞免疫功能和临床症状的变化.方法 将手术切除的原发性肝癌组织进行体外分离,分别用含IL-2的培养液和含IL-12+IL-2的培养液培养,诱导TIL的生长.培养10-14 d测定细胞杀伤率、细胞因子和增殖能力,待细胞扩增达108-9/ml时进行输注,随访观察临床疗效.结果 ①输注IL-12+IL-2组TIL对自体肝癌细胞的细胞杀伤率、细胞扩增能力、细胞因子IFN-γ和TNF-α水平均比IL-2组明显增高;②输注IL-12+IL-2诱导的TIL组与IL-2诱导的TIL组输注后CD3+、CIM+、CD8+均升高,以CD3+、CD8+升高为主.与输注前比较,差异均有统计学意义;IL-12+IL-2组与IL-2组间比较,前者CD3+、CD8+、CD 56+上明显高于后者,差异均有统计学意义.③输注后两组患者的临床症状均比输注前改善明显,但两组间比较无明显差异.④接受TIL自体输注治疗的患者,其1年、3年、5年生存率均有所提高,IL-12+IL-2组与IL-2组与同期非TIL治疗组相比较(P＜0.05).结论 白介素12诱导肝癌TIL可明显增强TIL细胞的特异性细胞毒作用且增殖能力明显增强.肝癌患者术后输注IL-12+IL-2诱导的自体肝癌肿瘤浸润淋巴细胞比输注IL-2诱导的肝癌肿瘤浸润淋巴细胞能更有效地提高肝癌患者机体免疫机能,延长1年生存期,减少复发.     

人VEGF基因腺病毒表达载体修饰大鼠骨髓间充质干细胞

目的 探讨含人血管内皮细胞生长因子(VEGF)基因腺病毒表达载体Ad-VEGF转染大鼠骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)的可行性.方法 采用贴壁培养筛选法富集大鼠BM-MSCs.将HEK293细胞中扩增并经效价分析后的Ad-VEGF转染大鼠BM-MSCs,通过对细胞转染效率、生长和活力的观察分析,以确定理想的感染复数(MOI)值.结果 本实验经HEK293细胞扩增制备的Ad-VEGF的病毒效价达8×108 pfu/ml;当MOI值为50时,Ad-VEGF转染大鼠BM-MSCs效率可达最高值53％;而MOI值高于50时,Ad-VEGF转染对BM-MSCs活性抑制明显.结论 成功实现Ad-VEGF转染大鼠BM-MSCs,其最适MOI值为50.     

携载增强型绿色荧光蛋白基因慢病毒标记小鼠脐带间充质干细胞示踪方法

目的 探讨慢病毒载体介导增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorecent protein,eGFP)转染小鼠脐带间充质干细胞(umbilical cord mesenchymal stem cells,UCMSCs)的最佳感染复数(multiplicity of infection,MOI)。方法 通过组织贴壁法得到mUCMSCs;用生长增殖曲线、成骨、成软骨及成脂分化进行鉴定;以MOI为50、100、150、200携载eGFP的慢病毒载体介导转染mUCMSC,倒置显微镜下观察荧光表达,确定荧光表达率最高的MOI组。结果 eGFP慢病毒以MOI=150转染mUCMSC,效率较高,可直接用于体内示踪。结论 用小鼠脐带可以分离出mUCMSCs,MOI=150时携载eGFP的慢病毒传染mUCMSCs效果最好。     

1型重组腺相关病毒介导增强型绿色荧光蛋白基因转染人脐静脉内皮细胞的体外研究

目的 评价1型重组腺相关病毒(rAAV1)作为新生血管性角膜病变基因治疗载体的可行性.方法 rAAV1-EGFP按转染倍数(MOI)5×103,5×104,5×105转染ECV304细胞,转染后在倒置荧光显微镜下观察ECV304细胞中GFP阳性表达情况和细胞生长形态特点等,流式细胞仪检测rAAV1-EGFP对EVE304细胞的转染效率.MTT法检测rAAV1-EGFP对EVC304细胞增殖的影响.结果 转染后2 d,MOI=5×105组细胞中的GFP开始表达;表达强度随MOI值的增高而增强,同时GFP的表达强度随着时间延长而逐渐增强,转染后第7天达到高峰,此时流式细胞仪检测rAAV1-EGFP对ECV304细胞的转染率分别为45.90％(MOI=5×103),58.56％(MOI=5×104),68.31％(MOI=5×105).AAV1-EGFP转染ECV304细胞后.细胞生长及形态正常.MTT法显示转染后72、96 h各转染组与未转染组之间A值无显著性差异.结论 rAAV1-EGFP对ECV304细胞转染稳定、有效,重组腺相关病毒对细胞增殖无明显抑制,重组腺相关病毒可作为基因治疗角膜新生血管性病变的载体.     

TMSG-1基因转染对肿瘤转移表型的影响

目的：研究肿瘤转移抑制基因TMSG-1对肿瘤转移表型的影响。方法：将含TMSG-1全长开放阅读框架的1.5kb cDNA克隆于pcDNA3，构建正义及反义TMSG-1 cDNA真核表达载体，以脂质体转染人肺巨细胞癌PG的高转移亚系BE1，挑选G418抗性克隆，RT-PCR检测正义或反义TMSG-1cDNA在转染细胞中的表达，进行转染细胞体外肿瘤生物学行为检测。结果：RT-PCR显示正义TMSG-1cDNA转染的BE1细胞（BE1-S）中TMSG-1表达明显高于BE1及空载体对照细胞，反义TMSG-1cDNA转染细胞（BE1-AS）中TMSG-1表达低于空载体对照细胞。与BE1及空载体对照细胞（BE1-V）相比，BE1-AS细胞体外生长较快，软琼脂克隆形成能力明显增强；而BE1-S细胞体外生长能力没有显著改变，但其穿越Matrigel的能力及软琼脂克隆形成能力明显减弱。流式细胞仪分析结果显示BE1-S的G0、G1期的细胞较BE1-V细胞比例增多，并且BE1-S出现了细胞凋亡峰。结论：实验结果表明反义TMSG-1基因转染可增强BE1细胞的体外生长、体外侵袭能力及克隆形成能力。而正义TMSG-1基因转染则使BE1细胞的侵袭能力及软琼脂克隆形成能力减弱，而对细胞体外生长能力无明显影响。结论支持TMSG-1是一个肿瘤转移抑制基因。     

腺病毒介导的HSV-tk体外抗喉癌作用

目的 :观察 HSV- tk/ GCV系统对喉癌细胞的杀伤作用。方法 :将带有报告基因 Lac Z的 5型缺陷性腺病毒载体 Ad CMVL ac Z感染喉癌细胞 Hep- 2 ,X- gal染色 ,测定腺病毒的转染率。利用同源重组技术构建含 HSV- tk基因的重组腺病毒载体 Ad CMVtk。Ad CMVtk感染 Hep- 2细胞后 ,加入 10 mg/ LGCV,观察瘤细胞存活率及旁观者效应。结果 :随着腺病毒感染复数量 (multiplicity of infection,MOI)增加 ,对 Hep- 2细胞转染率亦增加 ,10 0 %转染所需的 MOI为 2 0 0。 Ad CMVtk/ GCV对 Hep- 2细胞的杀伤强度与 Ad CMVtk量呈正向关系 ,即有浓度依赖性。此杀伤作用存在旁观者效应 ,但较弱。结论 :腺病毒介导的 HSV- tk/ GCV具有杀伤喉癌细胞作用     

瘤细胞αv整合素对腺病毒载体转染的影响

目的：探讨瘤细胞α_v整合素在腺病毒载体转染瘤细胞中的作用。方法：带有报告基因LacZ的5型缺陷性腺病毒（AdCMVLacZ）感染肿瘤细胞,X-gal染色,检测腺病毒对肿瘤细胞的转染率;比较M21黑色素瘤细胞及缺乏α_v整合素的M21-L对腺病毒转染的易感性;观察含有RGD序列的合成肽GRGDSP对腺病毒转染的影响。结果：腺病毒对各种人瘤细胞系的转染率是不同的,当腺病毒感染复数量(MOI)为50时,A549细胞的转染率最高,达90.2％,Hela细胞的转染率最低,只有7.6％;各种人瘤细胞达到100％转染所需腺病毒量（MOI）是不同的,A549最少,只需75 MOI。在相同MOI下,M21的转染率高于缺乏α_v整合素的M21-L。100%转染所需MOI量,M21为100,M21-L为400。M21经GRGDSP处理后对腺病毒转染的易感性降低。结论：肿瘤细胞对腺病毒转染的易感性与瘤细胞α_v整合素有关。     

Inhibitory Effect of Pulmonary Carcinoma by Adenovirus-Mediated CD/UPRT Gene

The cell killing effects and bystander effects of double suicide gene on pulmonary carcinoma cells were explored. Lung adenocarcinoma cells (A549) were transfected with different liters of adenovirus vector and followed with different concentrations of 5-FC after a recombinant adenovirus vector carrying CD/UPRT gene (Ad-CD/UPRT) was constructed. The cell viability was measured by MTT assay 4 days later. The cell viability was dropped to 30.57 %-8.62 % after 10 MOI of Ad-CD/UPRT transfected and 5-FC (10-1000μg/mL) administration. Furthermore, Ad-CD/UPRT-infected A549 cells showed a profound neighbor cell killing effect in the same methods. These results suggested that Ad-CD/UPRT/5-FC system can effectively suppress growth of lung adenocarcinoma cells, which may provide a novel and powerful candidate for lung cancer gene therapy strategies.