冷冻前后脐带间充质干细胞造血支持能力的比较

背景：低温冻存脐带间充质干细胞已成为研究热点,但关于冻存后其造血支持能力变化的报道甚少。目的：比较冷冻前后脐带间充质干细胞体外支持成人骨髓单个核细胞造血集落生成的能力。方法：分别将冷冻前后的人脐带间充质干细胞和人骨髓来源的间充质干细胞培养至第3代,经2.5g/L丝裂霉素C处理制备为细胞滋养层,与成人异体骨髓单个核细胞共培养。体外培养至35d应用甲基纤维素法检测造血干/祖细胞集落的增殖状态。结果与结论：冷冻人脐带间充质干细胞组集落形态、大小上与骨髓间充质干细胞组和未冷冻人脐带间充质干细胞组相似,3者均比空白组集落数量多,差异有显著性意义（P〈0.05）。与未冷冻人脐带间充质干细胞组相比,冷冻人脐带间充质干细胞组集落数更少,差异有显著性意义（P〈0.05）。实验结果说明冷冻前后人脐带间充质干细胞与骨髓间充质干细胞对骨髓单个核细胞均有造血刺激作用,但人脐带间充质干细胞冷冻后的造血支持作用有所减弱。     

脐血单个核细胞与骨髓间充质干细胞滋养层的共培养

背景:骨髓间充质干细胞具有维持骨髓正常造血功能,在造血调控中发挥重要的作用。目的:观察骨髓间充质干细胞的生物学性状和多向分化能力,并检测其在体外支持造血的能力。方法:利用密度梯度培养法分离骨髓单个核细胞进行培养,流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞表型;接种脐血单个核细胞于骨髓间充质干细胞滋养层培养板上共培养,观察粒-单系祖细胞集落变化。结果与结论:骨髓间充质干细胞呈典型的成纤维样细胞形态,强表达CD44,CD29,不表达CD34和CD106。可促进脐血单个核细胞扩增并形成造血祖细胞集落。提示骨髓间充质干细具有造血支持作用。     

人羊膜间充质干细胞支持造血的体外实验

背景:骨髓是目前间充质干细胞的主要来源,但由于取材不便、细胞数量受年龄限制等原因,其应用具有一定局限性.近年来,羊膜作为间充质干细胞的新来源受到越来越广泛的关注.目的:探讨人羊膜来源间充质干细胞在体外对造血干细胞的扩增是否有支持作用,以及怎样提高羊膜间充质干细胞和造血干细胞共移植成功率.方法:利用组织块培养法,从足月分娩的人羊膜中分离培养羊膜间充质干细胞.密度梯度离心法分离脐血单个核细胞,采用免疫磁珠分选技术分选其中 CD34+细胞.分别用脐血单个核细胞和 CD34+细胞与羊膜间充质干细胞共培养,连续 4 周,每周计悬浮细胞浓度,并以骨髓间充质干细胞组及无滋养层组作为对照.采用集落形成实验,把扩增的脐血单个核细胞和CD34+细胞分别接种至甲基纤维素半固体培养基中,14 d 后根据典型形态特征计数造血集落数.结果与结论:羊膜间充质干细胞可促进人脐血单个核细胞和 CD34+细胞扩增,扩增后两者在甲基纤维素半固体培养基中能够形成造血祖细胞集落,其造血支持作用与骨髓间充质干细胞相似,两者对比无明显统计学差异.提示,羊膜间充质干细胞体外具有与骨髓间充质干细胞相似的造血支持作用,有可能为造血干细胞体外扩增及临床间充质干细胞与造血干细胞联合移植、提高造血干细胞移植成功率提供一种更加理想的间充质干细胞新来源.     

人骨髓和脐带来源间充质干细胞体外支持造血能力的比较研究

本研究分离鉴定人骨髓和脐带来源的间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSC）,比较两种间充质干细胞体外支持长期造血的能力。用密度梯度离心或酶消化方法分离骨髓和脐带间充质干细胞,通过贴壁培养的方法进一步纯化Msc。检测骨髓和脐带MSC的表型以及成脂、成骨分化潜能。通过LTC—IC（long—term culture—initiating cells）实验,检测骨髓和脐带间充质千细胞体外支持长期造血的能力,并在培养的第3、5、7周分析两种MSC组悬浮细胞的表型。结果表明,骨髓和脐带间充质干细胞体外培养时均呈纺锤形、贴壁生长,2种MSC均表达CD90、CD105、CD73、CD29、CD54、CD166和HLA—ABC,不表达HLA—DR、CD34和CD45。化学染色证实,2种MsC体外能分化为脂肪细胞和成骨细胞。LTC—IC实验第5周脐带间充质干细胞组CFC（colony forming cell）的产率与骨髓间充质干细胞组比较无统计学差异（P〉0．05）;第6、7、9周,脐带MSC组CFC的产率均低于骨髓MSC组（P〈0．05）。第3、5、7周悬浮细胞表型检测结果显示,随着培养时间的延长,2种MSC组CD34和CD117的阳性率均明显下降,而CD33、CD13、CD11b的阳性率逐渐上升。结论：从人骨髓和脐带组织中成功分离并鉴定出间充质干细胞,脐带间充质干细胞能够在体外支持长期造血,但其造血支持能力弱于骨髓间充质干细胞。     

骨髓增生异常综合征患者间充质干细胞的生物学特性及其支持造血的体外研究

为了解骨髓增生异常综合征（MDS）患者间充质干细胞（MSC）的生物学特性,探讨其对体外造血的支持能力,采集MDS的骨髓标本,分离、培养和扩增MSC,进行细胞形态观察和免疫表型、成骨分化及增殖能力检测,并对骨髓细胞进行成纤维细胞集落（CFU-F）形成分析.对MDS患者的MSC进行贴壁培养,接种脐血单个核细胞（MNC）,以观察细胞数和CFU-GM的变化,作为MDS患者MSC支持造血体外实验.结果表明：来自MDS患者的MSC呈典型的成纤维样细胞形态,表型鉴定CD34,CD45阴性,SH2（CD105）,SH3（CD73）,Thy-1（CD90）阳性,体外诱导可向成骨细胞分化,其增殖能力和CFU-F形成能力与源于正常供者的MSC相当.支持造血的体外实验显示,实验组培养上清中的细胞总数和CFU-GM计数在第2周后均显著低于对照组（P＜0.05）.结论：来源于MDS患者骨髓的间充质干细胞的生物学特性与正常供者的MSCs无差异,但其体外支持造血的功能较后者显著减弱.     

两种来源的单个核细胞的培养比较

[目的] 观察体外分离培养的两种来源（脐血与骨髓）的单个核细胞，探讨其培养特点和差异。[方法] 体外分离、纯化和培养脐血与骨髓中单个核细胞（MNC），观察其形态和生长特性。[结果] 分离18份脐血，脐血标本的个体差异非常大，只有12份获得了贴壁细胞，MNC体外培养可以获得贴壁细胞，但形态不均一，主要为破骨样细胞和纤维样细胞，传代不超过二次。分离12份骨髓，均获得了贴壁细胞，MNC体外培养可以获得形态均一的纤维样间充质干细胞（MSC），可多次传代。[结论] 脐血不能获得典型的间充质样干细胞，骨髓中存在典型的间充质干细胞。     

脐带血来源的间充质干细胞对CD34~+细胞增殖的支持作用及其机制（英文）

目的:探讨脐带血来源的间充质干细胞体外支持造血干细胞扩增的能力及所涉及的可能机制。方法:将来源于脐血的造血干细胞与间充质干细胞共培养14 d,然后计数造血干细胞数与集落形成单位。ELISA方法检测间充质干细胞培养上清中含有的细胞因子。结果:与间充质干细胞共培养的造血干细胞增殖率明显高于单独培养的造血干细胞(P0.05)。此外,在培养体系中添加外源性细胞因子可明显提高造血干细胞增殖率(P0.05)。间充质干细胞能分泌多种细胞因子,包括GM-CSF、IL-7、IL-8、IL-11、SCF和SDF-1α。结论:脐带血间充质干细胞作为细胞滋养层可用于体外扩增造血干细胞,间充质干细胞分泌的细胞因子可能介导MSC对HSC增殖的支持作用。     

人骨髓间充质干细胞与脐血单个核细胞对混合淋巴细胞反应及PHA诱导转化的抑制

为研究和比较人骨髓间充质干细胞 (MSC)和脐血单个核细胞在体外的免疫调控能力 ,从人骨髓分离培养间充质干细胞 ,用Ficoll分离得到脐血单个核细胞 ,分别以不同剂量加入到外周血混合淋巴细胞培养体系和植物血凝素 (PHA)刺激的外周血淋巴细胞转化体系中 ,用MTT还原法测定细胞增殖 ,分别观察MSC和脐血单个核细胞对混合淋巴细胞反应和淋巴细胞转化的影响。结果显示 ,5× 10 4 ,1× 10 4 MSC以及 2× 10 5脐血单个核细胞均抑制混合淋巴细胞反应和PHA诱导的淋巴细胞增殖 ,而 <1× 10 4 MSC和 <2× 10 5脐血单个核细胞对混合淋巴细胞反应和PHA诱导的淋巴细胞增殖的抑制作用均不明显 ;5× 10 4 MSC对淋巴细胞增殖的抑制能力明显强于 2× 10 5脐血单个核细胞。结论 :大剂量的骨髓间充质干细胞和脐血单个核细胞在体外对混合淋巴细胞反应和PHA诱导的淋巴细胞转化均具有抑制作用 ,而且间充质干细胞的抑制能力强于脐血单个核细胞。     

脐带血来源的间充质干细胞对CD34+细胞增殖的支持作用及其机制

目的:探讨脐带血来源的间充质干细胞体外支持造血干细胞扩增的能力及所涉及的可能机制.方法:将来源于脐血的造血干细胞与间充质干细胞共培养14 d,然后计数造血干细胞数与集落形成单位.ELISA方法检测间充质干细胞培养上清中含有的细胞因子.结果:与间充质干细胞共培养的造血干细胞增殖率明显高于单独培养的造血干细胞(P＜0.05).此外,在培养体系中添加外源性细胞因子可明显提高造血干细胞增殖率(P＜0.05).间充质干细胞能分泌多种细胞因子,包括GM-CSF、IL-7、IL-8、IL-11、SCF和SDF-lα.结论:脐带血间充质干细胞作为细胞滋养层可用于体外扩增造血干细胞,间充质干细胞分泌的细胞因子可能介导MSC对HSC增殖的支持作用.     

人骨髓间充质干细胞的培养与鉴定

目的探索体外培养和鉴定人骨髓间充质干细胞（mesenchymal stemcell,MSC）的方法,为人骨髓间充质干细胞移植于受损心脏、改善心脏功能的研究打下基础。方法采用Percoll（1．073g／ml）密度梯度离心法分离人骨髓中单个核细胞,用含10％的胎牛血清低糖DMEM培养液体外培养扩增骨髓MSC,并通过FCM对其纯度进行鉴定。结果Percoll液能成功分离出骨髓间充质干细胞。原代及传代培养显示人骨髓间充质干细胞具有活跃的增殖倍增能力。体外扩增的人骨髓间充质干细胞表达CD29、CD166等表面抗原,不表达CD34、CD45等表面抗原。结论人骨髓间充质干细胞作为一种具有多分化潜能的多能干细胞,具有强大的分裂增殖能力,体外培养无明显的分化倾向．     

人脐血单个核细胞和脐带间充质干细胞移植用于大鼠脊髓损伤的实验研究

目的:探讨人脐血单个核细胞和脐带间充质干细胞(MSCs)移植对脊髓损伤功能恢复的影响,寻找一种更适合治疗脊髓损伤的细胞源。方法:采集新鲜人脐带血和脐带,分离培养单个核细胞和MSCs。将脊髓损伤模型随机分成3组:单个核细胞移植组、MSCs移植组和低糖必需培养基(L-DMEM)培养组。采用免疫组化和免疫荧光检测细胞移植后1—4周细胞在脊髓内的存活情况和迁移情况,使用BBB行为学评分评估大鼠脊髓功能恢复情况。结果:L-DMEM培养液组在术后各时间点观察评分无明显差异,而细胞移植组脊髓功能处于逐渐恢复过程,与L-DMEM培养液比较,差异有显著性意义。单个核细胞移植组对损伤脊髓功能的修复作用较MSCs移植组显著,且差异有显著性意义。结论:与MSCs相比较,人脐血单个核细胞更适合作为治疗脊髓损伤的细胞源。     

不同培养基培养人脐血间充质干细胞的差异

背景：脐血间充质干细胞为干细胞领域的研究热点,但目前传代及扩增此类细胞尚无简单、有效、完美培养方法.目的：采用不同的培养基分离培养融合状态的间充质干细胞,以筛选一种较好的体外培养人脐血间充质干细胞的方法.方法：无菌条件下取正常足月剖宫产新生儿的脐血,随机分为5组：低糖DMEM（Dulbecco改良的Eagle培养基）组、高糖DMEM组、α-DMEM组、低糖DMEM＋干细胞因子组、低糖DMEM＋骨髓间充质干细胞培养上清组.用淋巴细胞分离液分离脐血的单个核细胞.将脐血单个核细胞接种于含体积分数为10%胎牛血清的上述培养基中,放置于37℃、体积分数为5%的CO2培养箱内培养,倒置显微镜观察细胞数量和形态的变化并用流式细胞技术分析细胞的表面抗原.结果与结论：①各组间充质干细胞培养48 h后贴壁细胞数和细胞存活率的比较：低糖DMEM＋干细胞因子组、低糖DMEM＋骨髓间充质干细胞培养上清组的贴壁细胞数明显多于低糖DMEM组、高糖DMEM组、α-DMEM组（P〈0.05）,细胞存活率亦明显高于低糖DMEM组、高糖DMEM组、α-DMEM组（P〈0.05）.②各组间充质干细胞在不同培养时间下生长状态的比较：培养第3,6,9,12,15,18,21天低糖 DMEM＋干细胞因子组、低糖 DMEM＋骨髓间充质干细胞培养上清组细胞增殖的速度均快于低糖DMEM组、高糖DMEM组、α-DMEM组（P 〈0.05）.低糖DMEM＋干细胞因子组与低糖DMEM ＋骨髓间充质干细胞培养上清组比较差异无显著性意义.结果可见人脐血间充质干细胞与骨髓间充质干细胞培养上清或干细胞因子共孵育,对脐血间充质干细胞体外分离培养及扩增有支持作用.     

脐血间充质干细胞支持下脐血单个核细胞扩增的研究

目的 探讨脐血源间充质干细胞联合外源性细胞因子对脐血单个核细胞体外扩增的支持作用.方法 从脐血中分离、培养出间充质干细胞并检测其细胞表面抗原;以此间充质干细胞作为细胞滋养层.将脐血单个核细胞接种于无血清培养体系中培养18天,在第0、7、10、14及18天检测有核细胞总数、CD34+、CDl33+细胞数、集落形成单位数和(G2+M+S)期细胞含量变化.结果 ①从脐血中分离、培养出的间充质干细胞能稳定表达CD29、CD105和CD44,但不表达CD34和CD133;②外源性细胞因子及脐血源间充质下细胞均支持脐血间充质干细胞扩增,但以细胞因子联合脐血源间充质干细胞组效果最好,在第10天上述榆测指标达到峰值,分别为第0天的(6.91±1.91)、(7.75±1.24)、(6.49±1.33)、(15.62±1.29)和(28.26±6.58)倍,且维持造血至少18天.结论 ①从脐血巾能成功分离、培养出间充质下细胞,并完成细胞表型的初步鉴定;②外源性细胞因子联合脐血源间允质干细胞可有效扩增脐血单个核细胞.     

大鼠脐带源间充质干细胞的分离及生物学性状

背景:关于大鼠骨髓来源的间充质干细胞用于移植免疫耐受及进行组织修复的研究很多,但尚无脐带来源间充质干细胞的相关研究.目的:建立从大鼠脐带分离间充质干细胞的方法,并观察其生物学性状.方法:大鼠脐带经酶消化和组织块培养两种方法进行分离培养,于DMEM-LG培养基中培养,倒置显微镜观察细胞形态,细胞计数绘制生长曲线,流式细胞仪测定细胞周期及细胞表型,免疫组织化学染色检测其体外诱导成脂肪和成骨分化的能力.结果与结论:两种方法均能成功地从大鼠脐带中获得大量的间充质干细胞:原代培养显示,胶原酶消化法比组织块培养法的效率更高,大约10 d就可以进行传代,而组织块培养法要14 d才能传代:传代扩增两者之间没有差别.免疫表型分析显示,大鼠脐带源细胞表达黏附分子和基质细胞标记CD90、CD106,不表达造血细胞标记CD34、CD45.体外诱导实验证实,大鼠脐带间充质干细胞具有成脂肪和成骨分化的能力.     

脐带血干细胞制备的检测分析

目的对脐带血干细胞制备进行检测,为临床安全、有效地应用提供依据。方法测定母体和脐带血标本的人类免疫缺陷病毒(HIV)、乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)、丙型肝炎病毒(HCV)、梅毒螺旋体(TP)、巨细胞病毒(CMV)、内毒素、支原体和病原微生物。应用体外分离纯化试剂盒,分离干细胞,计数提取后单个核细胞数,经台酚兰染色检测干细胞活力。应用流式细胞仪检测CD34干细胞、淋巴细胞亚群。结果提取后有核细胞数为(5.4±1.09)×107,脐血的量和提取干细胞数成正相关。干细胞活力检测分离的活性率为(98.7±1.3)%。流式细胞仪测得脐血干细胞CD34+为(1.55±0.67)%(n=19)。淋巴细胞亚群检测结果显示,脐血CD3细胞数较少,CD4和CD8细胞数之和明显高于CD3细胞数,且选择脐血CD4/CD8小于1.3,这也是脐血移植时GVHD表现轻微的一个重要原因。结论脐血干细胞制剂的制备,符合细胞治疗的相关安全性指标。     

低剂量还原型谷胱甘肽可促进人脐血干细胞增殖

背景：获得足够数量的细胞是细胞移植治疗中面临的一个关键问题，有研究表明可以通过合理的刺激促进干细胞增殖。 目的：观察还原型谷胱甘肽对人脐血间充质干细胞的生物学特性的影响。 方法：实验分为两组，对照组为正常人脐血间充质干细胞，实验组为使用0.15 g/L质量浓度的还原型谷胱甘肽处理的人脐血间充质干细胞。 结果与结论：MTT实验结果显示，干预后第5，7，9天，实验组细胞的吸光度值明显高于对照组（P＆lt;0.05）。流式细胞术显示，实验组还原型谷胱甘肽对人脐血间充质干细胞的表面标志分子 CD29／CD44／CD45／CD105的表达无影响。实时 PCR 结果显示，还原型谷胱甘肽可以促进人脐血间充质干细胞中细胞外信号调节激酶mRNA的表达（P＆lt;0.05）。结果证实，质量浓度0.15 g/L的还原型谷胱甘肽可促进人脐血干细胞增殖。     

脐血血浆替代胎牛血清培养脐带间充质干细胞及冷冻保存

背景：采用胎牛血清扩增培养及冷冻保存的间充质干细胞,在临床应用中存在一定的风险。目的：探讨以脐血血浆替代胎牛血清体外分离培养、扩增及冷冻保存脐带间充质干细胞的可行性。方法：选择符合广州脐血库供者合格性筛选标准的脐血,收集脐血干细胞制备过程中去除的血浆,经病原学及微生物检测合格,多份混合用于细胞培养。采用酶消化法从健康足月分娩新生儿的脐带组织分离获得脐带间充质干细胞,分为两组,分别以DMEM/F12为基础培养基,添加胎牛血清或混合脐血血浆,经培养扩增后,采用流式细胞仪检测细胞免疫表型,并进行间充质干细胞成骨、成脂分化鉴定。在含有10%二甲基亚砜的DMEM/F12培养基中,分别添加体积分数为20%的胎牛血清或混合脐血血浆作为冷冻保存液,对扩增至第3代的细胞冷冻保存至6个月以上,观察复苏后细胞的活率、贴壁情况、增殖、免疫表型及向成骨细胞分化的能力。结果与结论：两种培养体系下的脐带间充质干细胞均呈现典型的梭形漩涡状生长,间充质干细胞免疫表型的表达谱系基本无差异,均具有成骨、成脂分化的能力,但脐血血浆培养条件下细胞的增殖速度显著高于胎牛血清。冻存复苏后的细胞可正常贴壁,且具有向成骨细胞分化的能力,采用脐血血浆冻存的细胞具有更高的贴壁效率及扩增能力。上述结果表明,脐血血浆可以替代胎牛血清用于脐带间充质干细胞的扩增培养及冷冻保存,并维持了间充质干细胞的基本生物学特性,是大量扩增间充质干细胞用于临床治疗较为安全的选择。     

人脐带间充质干细胞的体外分化及对犬外周血淋巴细胞增殖的影响

目的 通过体外实验检测人脐带间充质干细胞的体外多向分化及对犬T淋巴细胞增殖的影响,探讨其作为组织工程种子细胞的可能性.方法 体外培养人脐带间充质干细胞,分别使用含有地塞米松、转化生长因子、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤的培养基诱导其成骨、成软骨、成脂肪三系分化后进行染色鉴定,并将经丝裂霉素处理的人脐带间充质干细胞与植物凝集素刺激下的犬外周血T淋巴细胞共培养,5d后多功能酶标仪检测吸光度值.结果 人脐带间充质干细胞体外生长良好,呈长梭形,形态均一,使用成骨、成软骨和成脂培养基分别诱导分化后碱性磷酸酶（ALP）染色、骨钙素免疫细胞化学染色、茜素红染色、亚甲基蓝染色和油红0染色分别呈阳性,人脐带间充质干细胞与犬外周血T淋巴细胞混合组吸光度值较单纯犬外周血T淋巴细胞组吸光度值明显降低.结论 人脐带间充质干细胞具有多向分化能力,并能够抑制犬外周血淋巴细胞的增殖,有望成为创伤组织及骨组织修复的种子细胞.