BAFF-R—IgG4mut融合蛋白对BXSB狼疮鼠B淋巴细胞的影响

目的研究BAFF—R—IgG4mut融合蛋白对BXSB狼疮鼠B淋巴细胞的影响。方法体外观察BAFF-R—IgG4mut融合蛋白对BAFF刺激的B细胞活性的影响;100ul的PBS、200ug人IgG4和100ug BAFF-R—IgG4rout融合蛋白分别经腹腔注射10周龄雄性BXSB狼疮鼠,每周注射3次,共注射5周。分别检测狼疮鼠外用血BAFF水平、外周血和脾脏组织中B220^＋CD5^-、CD3^＋CD4^-、CD8^＋T和CD3^＋、CD4^＋、CD8^-T细胞的表达以及狼疮鼠的存活率。结果BAFF-R—IgG4mut融合蛋白组外周血BAFF以及外周血、脾脏组织中B220＋CD5-细胞较对照组下降（P〈0．01）,实验组狼疮鼠存活率较对照组延长（P〈0．01）。结论BAFF-R—IgG4mut融合蛋白可抑制BXSB粮寤鼠B细胞活性．     

狼疮鼠骨髓树突状细胞的分离培养和免疫学特性

目的对狼疮鼠骨髓树突状细胞进行分离、培养并分析其免疫学特性,为进一步研究和应用狼疮鼠骨髓来源树突状细胞(DC)奠定基础。方法分离、纯化6周龄雄性BXSB狼疮鼠骨髓单核细胞,以含10%胎牛血清、2ng/ml重组小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和20ng/ml重组小鼠白细胞介素-4的RPMI-1640培养基培养,以脂多糖(LPS,1μg/ml)刺激24h体外诱导BXSB狼疮鼠骨髓细胞分化为DC,倒置显微镜动态观察细胞形态学变化,流式细胞仪分析细胞表面分子,混合淋巴细胞反应检测其刺激T细胞增殖能力。结果经体外诱导培养第2～8天可见大量细胞集落形成,培养的DC具有典型树突状形态,同时DC可显著刺激同种异体混合淋巴细胞增殖。结论体外诱导培养可稳定获得BXSB狼疮鼠骨髓来源DC。     

脾脏CD4^＋T、CDl9^＋B淋巴细胞凋亡在狼疮性BXSB小鼠发病机制中的意义

目的对♀、♂狼疮性BXSB小鼠外周血T、B淋巴细胞分布及脾脏T、B淋巴细胞凋亡进行比较探讨脾脏CD4^＋T、CDl9^＋B淋巴细胞凋亡在狼疮性BXSB小鼠发病机制中的意义。方法运用流式细胞术、免疫双荧光染色法检测外周血CD4^＋T、CD8^＋T、CDl9^＋B细胞分布及脾脏CD4^＋T、CDl9^＋B细胞凋亡;直接免疫荧光法观察♀、♂狼疮性BXSB小鼠肾脏免疫组化。结果与早BXSB小鼠比较,6BXSB小鼠外周血CD4^＋T、CD8^＋T细胞分布明显降低（P〈0．01）,外周血CDl9^＋B细胞分布及脾脏CD4^＋T、CDl9^＋B凋亡率明显升高（P〈0．01）;6BXSB小鼠绝大多数肾小球毛细血管襻上可见大量IgG呈片状沉积,而早BXSB小鼠肾脏几乎无IgG沉积。结论6BXSB小鼠发病较早BXSB小鼠重,细胞凋亡在BXSB小鼠发病机制中具有重要意义。     

不同体质MRL／lpr狼疮鼠B淋巴细胞刺激因子及其受体基因及蛋白质的表达

目的：建立MRL／lpr狼疮鼠体质的区分方法,并于不同周龄观察肾脏B淋巴细胞刺激因子（ BAFF）、B淋巴细胞刺激因子受体（ BAFF-R）基因及蛋白质的表达,以考察狼疮鼠体质差异的物质基础。方法将12周龄MRL／lpr小鼠按体质分为寒体质、常体质及热体质,随机选取不同体质的小鼠各20只为寒体组、热体组、常体组。分别于12周龄时及20周龄时取材。通过RT-PCR、West-ern Blot等检测方法,检测肾脏 BAFF mRNA、BAFF-R mRNA 及其蛋白质表达。结果寒体质MRL／lpr狼疮鼠肾组织BAFF mRNA及蛋白质、BAFF-R蛋白质的表达均较常体质、热体质低,但各组BAFF-R mRNA的表达无明显差异。结论 MRL／lpr狼疮鼠体质差异可能与肾脏组织BAFF mRNA及蛋白质、BAFF-R蛋白质的表达有关。     

重组人BAFF对多发性骨髓瘤细胞BAFF-R表达调控的初步研究

目的 :研究多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)中重组人B淋巴细胞刺激因子(recombinant human B lymphocyte stimulator,rh BAFF)对其特异性受体(B lymphocyte stimulator receptor,BAFF-R)基因、蛋白水平表达的影响;并进一步研究重组人BAFF与JNK信号通路之间的作用与BAFF-R之间的关系。方法:应用RT-PCR、酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)、细胞免疫荧光技术检测BAFF-R在MM细胞KM3中的表达、功能及调节;Western Blot分析BAFF/BAFF-R对NF-κB信号通路的激活情况。结果:细胞免疫荧光结果显示BAFF-R定位在KM3细胞的细胞膜上;重组人BAFF(50 ng/m L)能够促进BAFF-R m RNA和蛋白的表达;可溶性BAFF(50 ng/m L)促进p-JNK表达的上调,且随作用时间的延长而增加。结论 :重组人BAFF对BAFF-R表达有重要的影响,JNK信号通路可能参与了MM的发生发展过程。     

钩吻素子对免疫磁珠分离纯化的小鼠CD4+T细胞体外增殖的影响

目的 探讨小鼠脾脏CD4⁺T细胞的分离方法,观察钩吻素子(Kou)对小鼠脾脏CD4⁺T细胞体外增殖的影响.方法 以免疫磁珠分选法从小鼠脾脏细胞中分离CD4⁺T细胞,流式细胞术检测所得细胞的纯度,台盼蓝法检测细胞活力.将10～20μg/ml Kou分别作用于经刀豆蛋白A或植物血凝素刺激的小鼠T淋巴细胞,四唑盐比色法检测细胞增殖情况,用酶联免疫法检测细胞上清中IL-2的含量.结果 经过流式细胞仪测定分离后的小鼠脾脏CD4⁺T细胞纯度达到90.%±5.8%:0.2%台盼兰染色细胞活力为94.9%±.6%;增殖试验表明分离后未加Kou的CD4⁺T细胞对刀豆蛋白A、植物血凝素的刺激保持了良好的增殖能力,当浓度范围为20～20μg/ml时,Kou均能抑制淋巴细胞的增殖(P<0.05),且表现出一定的剂量相关性;不同浓度的Kou(20、100、200μgm1)作用后,CD4⁺T细胞培养上清中的IL-2水平明显低于对照组(P<0.05).结论 免疫磁珠阴性分选法操作简单、快速,可获得较高纯化率、有活性的CD4⁺T细胞;Kou明显抑制小鼠CD4⁺T淋巴细胞增殖反应,此抑制作用可能与Kou抑制小鼠CD4⁺T细胞IL-2的分泌及免疫抑制作用相关.     

脾脏CD4+T、CD19+B淋巴细胞凋亡在狼疮性BXSB小鼠发病机制中的意义

目的对♀、♂狼疮性BXSB小鼠外周血T、B淋巴细胞分布及脾脏T、B淋巴细胞凋亡进行比较探讨脾脏CD4 T、CD19 B淋巴细胞凋亡在狼疮性BXSB小鼠发病机制中的意义。方法运用流式细胞术、免疫双荧光染色法检测外周血CD4 T、CD8 T、CD19 B细胞分布及脾脏CD4 T、CD19 B细胞凋亡;直接免疫荧光法观察♀、♂狼疮性BXSB小鼠肾脏免疫组化。结果与♀BXSB小鼠比较,♂BXSB小鼠外周血CD4 T、CD8 T细胞分布明显降低(P<0.01),外周血CD19 B细胞分布及脾脏CD4 T、CD19 B凋亡率明显升高(P<0.01);♂BXSB小鼠绝大多数肾小球毛细血管襻上可见大量IgG呈片状沉积,而♀BXSB小鼠肾脏几乎无IgG沉积。结论♂BXSB小鼠发病较♀BXSB小鼠重,细胞凋亡在BXSB小鼠发病机制中具有重要意义。     

B细胞活化因子的双向性:促进调节性T细胞分泌白细胞介素-35

目的研究B细胞活化因子(B cell activation factor of the tumor necrosis factor family,BAFF)对调节性T细胞(Tregs)分泌抑制性细胞因子白细胞介素-35(interleukin-35,IL-35)的影响,验证系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)中BAFF对免疫反应的双向调节机制。方法磁珠分选狼疮模型鼠Tregs,经BAFF刺激后采用qRT-PCR及流式细胞术检测其分泌IL-35浓度。比较正常对照鼠、狼疮模型鼠及经尾静脉注射抗BAFF蛋白后狼疮模型鼠脾脏Tregs频率及分泌IL-35情况。结果BAFF能够有效促进Tregs分泌IL-35。相对于正常对照鼠,狼疮模型鼠(血清中BAFF升高)脾脏Tregs分泌较高浓度的IL-35,而中和其循环中BAFF后,Tregs分泌IL-35减少。结论在SLE发病机制中,BAFF不仅是重要的致病因素,还能够通过促进Tregs细胞分泌IL-35发挥负向免疫调节效应。     

大鼠间充质干细胞对BALB/c小鼠体外淋巴细胞实验的影响

目的 研究大鼠间充质干细胞(MSC)对BALB/c小鼠淋巴细胞增殖和CD4+CD25+调节性T细胞亚群的变化。方法 分离、扩增SD大鼠MSCs,流式细胞术检测表面标志以鉴定。取第5代MSC与分离的小鼠淋巴细胞在刀豆蛋白(ConA)刺激下共培养5天 ,流式细胞仪测定细胞增殖,CD4+CD25+调节性T细胞亚群比例的变化。结果 当淋巴细胞: MSCs在1:10及1:50时均可抑制ConA刺激下可抑制小鼠淋巴细胞增殖,淋巴细胞: MSCs在1:10 时CD4+CD25+调节性T细胞亚群比例明显升高。结论 大鼠MSC具有异种基因免疫抑制作用     

应用iDC从G-CSF动员的外周血中诱导产生CD4+CD25+调节性T细胞

目的探讨在粒细胞集落刺激因子(G-CSF)动员的外周血单个核细胞(PBMC)中诱导产生CD4+CD25+调节性T细胞(Treg)的可行性及其表型和功能。方法收集G-CSF动员和未动员的BALB/c♀鼠的PBMC,采用磁活性标记的细胞分选法(MACS)分选BALB/c♀鼠的CD4+CD25-T细胞和CD4+CD25+T细胞及C57BL/6♂鼠的CD11c+未成熟树突细胞(iDC),建立细胞培养体系,经iDC体外诱导G-CSF动员和未动员的CD4+CD25-T细胞转换为CD4+CD25+Treg细胞(iTreg)。分别应用流式细胞术、混合淋巴细胞反应技术检测诱导后细胞的CD25、Foxp3的表达水平以及抑制功能,比较G-CSF动员与非动员组间iTreg的表型和抑制功能的差异。结果 iDC诱导G-CSF未动员和动员的组间CD25+分子表达率分别为(76.8±4.1)%和(90.4±5.3)%,差异有统计学意义(P<0.01);两组诱导产生的CD25+T细胞的Foxp3表达水平分别为(64.1±2.7)%和(59.5±3.2)%,差异有统计学意义(P<0.05)。iDC诱导G-CSF未动员和动员的外周血产生的iCD4+CD25+Treg均表现出免疫抑制功能,其中动员后诱导生成的iTreg的免疫抑制效应明显增强。结论应用iDC从G-CSF动员的外周血中诱导产生的iCD4+CD25+Treg具有更强的体外抑制效应,为自身免疫性疾病的治疗提供新的思路和手段。     

白芍总苷对系统性红斑狼疮CD4+ T细胞ITGAL基因表达和启动子甲基化修饰的影响

目的: 探讨白芍总苷(total glucosides of peony, TGP)对系统性红斑狼疮(SLE)患者外周血CD⁴⁺ T细胞甲基化敏感基因ITGAL(CD11a)表达及启动子甲基化修饰的影响。方法: 利用磁珠分选获得外周血CD⁴⁺ T细胞,用不同浓度TGP(0,62.5,312.5和1562.5 mg/L)处理SLE患者CD⁴⁺ T细胞,48 h后收集细胞。MTT法检测处理后CD⁴⁺ T细胞的活力。定量PCR检测ITGAL基因mRNA表达水平。流式细胞术检测CD⁴⁺ T细胞表面CD11a分子表达水平。亚硫酸盐测序法分析ITGAL基因启动子甲基化水平。结果: TGP处理48 h后,各浓度组CD⁴⁺ T细胞活力无明显差异。与对照组相比,高浓度组(1562.5 mg/L)ITGAL基因mRNA表达水平显著降低(P<0.01),CD⁴⁺ T细胞表面CD11a表达水平亦显著降低(P<0.01)。进一步DNA甲基化水平检测显示高浓度TGP处理组ITGAL基因启动子甲基化水平较对照组显著升高(P<0.01)。结论: TGP可通过升高ITGAL基因启动子甲基化水平降低SLE患者外周血CD⁴⁺ T细胞中CD11a表达水平,初步揭示了TGP抑制SLE自身免疫反应的分子机制。     

系统性红斑狼疮患者外周血T细胞CTLA-4表达及其临床意义的研究#

目的：研究系统性红斑狼疮（Systemic Lupus Erythematosus, SLE）T细胞中CTLA-4的表达及临床意义。 方法：分离正常人和SLE患者的外周血单个核细胞（PBMCs）,以抗-CD3、抗-CD28刺激培养48h,刺激培养前后收取细胞,以流式细胞术（FCM）检测CD4+和CD8+T细胞中CTLA-4+细胞比例,并分析其与SLE疾病活动性指数（SLE Disease Activity Index,SLEDAI）和肾损害的关系。再以ELISA法检测培养上清中游离的CTLA-4水平。 结果：SLE患者刺激前的CD4+和CD8+T细胞中、主要是CD25+T细胞中CTLA-4+细胞的比例较正常人显著增高,且与SLEDAI呈正相关;而其CD8+CD28- T细胞中CTLA-4+细胞比例也显著高于正常人,但与SLEDAI之间无显著相关性;经抗-CD3、抗-CD28抗体刺激后,其CD4+CD25+T细胞、CD8+CD25+T细胞或CD8+CD28- T细胞中CTLA-4+细胞的比例却显著低于正常人,但与SLEDAI之间无显著相关性,仅在活动性SLE患者中有肾损组的CD8+CD28- T细胞中CTLA-4+细胞的比例显著低于非肾损组;而且经刺激培养后SLE患者PBMC上清中游离的CTLA-4水平也显著低于正常人。结论：SLE患者新鲜分离的T细胞（CD4+及CD8+）中CTLA-4表达异常增高,反映T细胞异常活化和疾病活动;另一方面,SLE患者T细胞又存在CTLA-4诱导性表达障碍,可能与SLE T细胞体外再活化的能力减弱有关。     

双向电泳-质谱法分析人CD4+CD25+T细胞与CD4+CD25-T细胞蛋白质组差异

目的 用双向凝胶电泳-质谱法(2．DE／MS)分析人CD4^ CD25^ T细胞和CD4^ CD25^-T细胞表达的蛋白质组，建立二者之问的差异表达谱。方法 提取人脾脏源CD4^ CD25^ T细胞和CD4^ CD25^-T细胞总蛋白质，双向电泳分离蛋白，比较两种细胞的蛋白质组表达差异，对差异蛋白质点用基质辅助激光解析电离飞行时间问质谱(Matrix-assisted laser des-orpfion／ionization time of flying maass spectrometry，MAIDI-TOF-MS)进行鉴定。结果 胶图差异分析发现25个表达水平存在明显差异的蛋白质点，其中17个点在CD4^ CD25^-T细胞上调，8个点在CD4^ CD25^ T细胞上调。质谱初步鉴定出15个差异蛋白质点。结论 CD4^ CD25^ T细胞和CD4^ CD25^-T细胞表达蛋白质组存在差异，这种蛋白质组的差异分析有助于进一步研究调节性T细胞功能相关蛋白质。     

系统性红斑狼疮患者外周血CD4+CD25+T细胞亚群的初步研究

目的研究系统性红斑狼疮(SLE)患者外周血中CD4+CD25+T细胞亚群的比率改变.方法采用微量全血三色标记法,以流式细胞技术检测SLE患者外周血CD4+、CD4+CD25+、CD4+CD25+CD45RO+T细胞亚群,分析阳性细胞百分率和平均荧光强度(Mean fluorescence intensity,MFI).结果SLE患者外周血中CD4+T细胞百分率,活动期(29.29%±8.86)%和非活动期(29.55±8.96)%均低于正常对照(37.41±3.29)%(P均＜0.05);CD4+CD25+T细胞百分率SLE活动期(10.30±5.60)%显著高于正常对照(5.39±1.43)%(P＜0.05),非活动性SLE病人组(5.63±2.49)%和正常组差异无显著性(P＞0.05);CD4+CD25+CD45RO+T细胞百分率SLE活动期(3.96±3.51)%显著高于正常对照(1.39±0.63)%,非活动期(0.75±0.66)%显著低于正常对照(P均＜0.05).平均荧光强度分析表明SLE患者组和正常组的CD25和CD45RO抗原密度差异并无显著性(P均＞0.05).结论SLE患者外周血中存在CD4+CD25+及CD4+CD25+CD45RO+T细胞亚群比率异常增高,且与病情活动性相关.     

CTLA-4Ig对复发性单纯疱疹性角膜基质炎的抑制作用

目的：研究CTLA-4Ig对复发性单纯疱疹性角膜基质炎（HSK）的抑制作用。方法：采用复发性HSK的BALB/c鼠模型，经紫外线B光照射角膜诱导HSK复发；使用CTLA-4Ig作为负性调节因子，观察其对复发性HSK的影响。结果：注射CTLA-4Ig的小鼠，复发性HSK的角膜混浊程度及角膜炎性细胞浸润明显减轻，迟发型超敏反应明显减弱，外周血中CT4^ T细胞减少了92.8％。结论：CTLA-4Ig通过阻断B7:CD28/CTLA-4协同刺激途径，抑制了CD4^ T细胞的增殖，阻止了复发性HSK的发展。     

人CD4+CD25+T细胞和CD4+CD25-T细胞蛋白质组的双向电泳分析

目的 用双向电泳技术分析人CD4^ CD25^ T细胞和CD4^ CD25^-T细胞表达的蛋白质组，建立二者之间的差异表达谱。方法 从人脾脏分选CD4^ CD25^ T细胞和CD4^ CD25^-T细胞，用双向电泳技术分析两种细胞蛋白质组的表达差异。结果 分选细胞纯度分别为CD4^ CD25^ T细胞82.3%,CD4^ CD25^-T细胞96.5%，双向电泳分析发现有4个蛋白点明显仅于CD4^ CD25^ T细胞检测到表达，有9个蛋白点明显仅于CD4^ CD25^-T细胞检测到表达。结论 CD4^ CD25^-T细胞和CD4^ CD25^-T细胞表达蛋白质组有明显差异。     

初发SLE患者外周血中CD4+ T细胞表面趋化因子受体的表达及其意义

目的了解初发系统性红斑狼疮(SLE)外周血CD4+T细胞表面趋化因子受体的表达情况并探讨在发病中的意义。方法流式细胞术检测18例初发SLE患者(有肾炎10例,无肾炎8例)及10例正常对照外周血CD4+T细胞表面趋化因子受体CCR1、CCR3、CCR5的表达情况,比较SLE治疗前后以及正常对照CD4+CCR1+、CD4+CCR3+、CD4+CCR5+T细胞亚群占全部CD4+T细胞比例的差异。结果SLE患者CD4+CCR1+、CD4+CCR5+T细胞亚群百分率显著低于对照组(P均<0.001);CD4+CCR3+T细胞亚群百分率在SLE和对照组间差异无统计学意义。三种T细胞亚群在肾炎组及无肾炎组的差异均不显著(P均>0.05)。CD4+CCR1+T细胞亚群百分率治疗后显著升高(P=0.022);CD4+CCR5+T细胞亚群百分率治疗后升高(1.81±0.95%和2.88±1.42%),但无统计学意义(P=0.065);CD4+CCR3+T细胞亚群百分率治疗后变化无显著性。结论CD4+CCR1+和CD4+CCR5+T细胞亚群可能参与SLE发病机制。     

免疫代谢与系统性红斑狼疮

Systemic lupus erythematosus (SLE) is a highly heterogeneous autoimmune disease,characterized by production of pathogenic autoantibodies and wide involvement of multiple systems. Damageofimmune tolerance and imbalance of immune homeostasis lead to the production of autoantibodies and the injuries of multiple organs and systems. In recent years,plenty of studies have identified that immunometabolism affects survival status of certain cells,also cell activation,differentiation and effector functions. Conversely,immune cells with different functions or differentiational status upregulate specific me-tabolic pathways to maintain their identities. In response to outer stimulations,naive immune cells dif-ferentiate into activated cells,accompanied with a series of immunometabolism changes. Therefore,abnormal immunometabolism can induce global imbalance of immune homeostasis,which further results in the initiation and development of autoimmune diseases,including SLE. Multiple abnormalities of immunometabolism have been found in patients with SLE or mouse models of lupus. Immune cells involved in the development of SLE,such as T cells,B cells,dendritic cells and macrophages present various metabolic abnormalities and pathological phenotypes. Among these cells,CD4 ⁺ T cells play predominant roles in the pathogenesis of SLE. Lots of studies demonstrated that CD4 ⁺ T cells and their subsets were in abnormal immunometabolic status,which further resulted in the development of SLE. In CD4 ⁺ T cells from patients with SLE or mouse models of lupus,both levels of glycolysis and oxidative phosphorylation are significantly higher compared with healthy controls. However,mitochondrial abnormalities,decreased ATP production and increased level of oxidative stress also have been found in these cells,which play important roles in the production of reactive oxygen intermediates and autoantibodies. Aggregated lipids rafts and increased synthesis of glycosphingolipid and cholesterol also have been observed in the CD4 ⁺ T cells from patients with SLE,leading to the abnormally elevated TCR signaling. Moreover,mechanistic target of rapamycin (mTOR) signaling is activated in the CD4 ⁺ T cells from both patients with SLE or mouse models of lupus and participate in the metabolic abnormalities of pathological CD4 ⁺ T cells. Progressive understanding of immunometabolism give us new insights of the pathogenesis of SLE and provide us with more therapeutic targets in the treatment of SLE.     

系统性红斑狼疮BXSB小鼠骨髓B细胞系细胞的分化发育

目的:研究Yaa基因与骨髓B细胞系细胞的分化发育是否有相互关系.方法:用Whitlock-Witte法从骨髓细胞中培养纯化出B细胞系细胞,继而检测B细胞系细胞对脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)刺激后的表型、增殖反应和抗DNA抗体的产生以及对地塞米松诱导后的凋亡情况.结果:用Whitlock-Witte法成功地从骨髓细胞中培养分离出B细胞系细胞.经LPS刺激后,雌雄BXSB小鼠B细胞系细胞膜表面CD19抗原和膜表面Ig的分布相似,都出现较强的增殖反应和产生IgM类型的抗ssDNA和dsDNA 抗体,但是对地塞米松诱导的凋亡作用不敏感.结论:Yaa基因对BXSB小鼠骨髓中B细胞系细胞的分化发育无影响,提示Yaa基因仅在外周免疫器官的成熟B细胞中表达活性;并且BXSB小鼠骨髓中的自身反应性B细胞系细胞未被删除,可能是产生自身抗体的内在原因之一.