活化的肝星状细胞促进调节性T细胞的表达

目的 越来越多的研究证实,活化的肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSCs)具有免疫抑制功能.本研究观察了HSCs对T细胞介导的适应性免疫应答的影响及其与调节性T细胞(regulatory T cells,Treg)的关系.方法 分离培养小鼠HSCs,运用混合淋巴细胞反应(mixed lymphocyte reaction,MLR),体外观察活化的HSCs对T细胞增殖和Treg细胞的影响.结果 活化的HSCs能导致树突状细胞(dendritic cells,DCs)介导的适应性免疫应答中T细胞的低反应性:抑制T细胞的增殖,同时诱导Treg细胞的表达.结论 活化的HSCs能通过促进Treg细胞表达而诱导适应性免疫应答中T细胞的活化无能,促进免疫耐受.     

洛伐他汀对系膜细胞凋亡及Bcl-2和Bax基因表达的影响

目的 观察洛伐他汀对系膜细胞凋亡及Bcl-2和Bax基因表达的影响。并探讨其作用的可能机制。方法 用不同浓度的洛伐他汀处理大鼠系膜细胞，用流式细胞仪观察细胞凋亡指数，吖啶橙荧光活体染色观察细胞凋亡率，电镜观察凋亡细胞形态，免疫印迹法及细胞免疫结合图文分析观察洛伐他汀对系膜细胞Bcl-2和Bax基因表达的影响。结果 洛伐他汀对系膜细胞凋亡有明显诱导作用，呈一定剂量依赖性；并能明显抑制Bcl-2基因表达，促进Bax基因表达，致使两者比例明显下降。结论 洛伐他汀可剂量依赖性地诱导大鼠系膜细胞凋亡，其机制可能通过对凋亡抑制或促进基因的调控，改变Bcl-2/Bax比值而诱导MC的凋亡。     

共培养条件下骨髓基质细胞与嗅鞘细胞的相互作用

[目的]研究骨髓基质细胞与嗅鞘细胞共培养条件下,两种细胞之间的相互作用,为进一步行细胞联合体内移植提供理论基础。[方法]取大鼠骨髓基质细胞和嗅鞘细胞进行分离培养纯化及鉴定,将纯化后的骨髓基质细胞和嗅鞘细胞共培养,对共培养细胞进行形态学观察,检测间充质干细胞标记物Vimentin、NGF受体标记物P75、神经干细胞标记物Nestin。[结果]共培养部分细胞形态上具有神经细胞特征;经免疫荧光观察一部分细胞呈p75阳性,另一部分细胞呈Vimentin阳性,它们呈条索状包绕p75阳性细胞,细胞簇中央的细胞呈Nestin阳性。[结论]骨髓基质细胞和嗅鞘细胞能在体外共同存活、生长,且通过细胞的相互作用,能激活BMSCs向神经元样细胞分化的潜力,提示借助于细胞间的相互作用,采取恰当的细胞联合移植干预有可能弥补单一细胞类型自身的不足,这为BMSCs和OECs体内联合移植的可行性提供了理论依据。     

芸香诱导K562细胞凋亡机制探讨

目的:研究芸香诱导白血病K562细胞凋亡过程中Caspase-3基因的表达.方法:体外培养白血病K562细胞,生长曲线观察芸香对K562细胞的细胞抑制作用,MTT法观察芸香的细胞毒作用,测定IC50,Hoechst 33342/PI双荧光染色后,荧光显微镜下观察细胞核形态,流式细胞仪检测细胞周期,RT-PCR观察Caspase-3的表达,CaspACETM分析系统检测Caspase-3酶活性.结果:芸香浓度为2×10-5mol/L、4×10-5mol/L、8×10-5mol/L时,细胞生长受到显著抑制;不同浓度quercetin处理K562细胞48 h 后,IC50为4×10-5mol/L;Hoechst 33342/PI双荧光染色可观察到明显核固缩、凝集等细胞凋亡表现;流式细胞仪检测芸香处理后细胞发现G2期细胞显著增多(64.7%),DNA合成受抑,凋亡率增加;以Caspase-3 基因和内参照β-actin序列设计引物,PCR产物经过琼脂糖凝胶电泳,紫外透射仪下明显观察到约300 bp 条带;CaspACETM分析系统检测Caspase-3酶活性明显升高(P＜0.05).结论:芸香诱导白血病细胞Caspase-3基因表达,细胞发生凋亡,caspase-3途径诱导凋亡是芸香作用机制之一.     

邻苯二甲酸二丁酯孕期暴露导致性发育期子代大鼠睾丸细胞凋亡和空泡化

目的:探讨邻苯二甲酸二丁酯(DBP)孕期暴露对性发育期子代大鼠睾丸细胞凋亡的影响。方法:受孕SD大鼠10只,随机分为空白对照组和DBP染毒组,妊娠12~19 d,空白对照组和DBP染毒组分别给予橄榄油1 ml/d和DBP 500 mg/(kg·d)灌胃,于性发育期(PND45)取出睾丸标本,透射电镜观察睾丸细胞结构,HE染色观察各级生精细胞发育情况,TUNEL法检测睾丸细胞凋亡情况,免疫组化和Western印迹观察凋亡调控蛋白Bcl-2、Bcl-XL、Bax和p53的表达。结果:电镜观察见DBP染毒后性发育期子代大鼠睾丸细胞凋亡增加和细胞空泡化,HE染色见各级生精细胞明显减少,TUNEL检测结果显示DBP染毒组细胞凋亡指数明显高于空白对照组(12.00±5.22 vs 3.17±1.47,P0.01),免疫组化和Western印迹提示DBP染毒组促凋亡蛋白Bax和p53的表达较空白对照组显著升高(P0.05)。结论:DBP孕期染毒导致性发育期雄性子代大鼠睾丸生殖细胞和支持细胞凋亡增加及细胞空泡化,促凋亡蛋白Bax和p53的表达明显增高。     

婴幼儿血管瘤中周细胞的分布及其演变

目的观察婴幼儿血管瘤中周细胞的分布、表型及其演变。方法52例婴幼儿血管瘤标本,应用α-SMA作为标记抗原观察血管瘤中周细胞的分布,应用透射电镜和TUNEL染色观察周细胞的凋亡状况。结果增生早期和中期,血管瘤细胞团中有大量周细胞,周细胞与内皮细胞共同进行微血管发生;增生晚期,血管瘤周细胞大量凋亡;消退早期,微血管周围有少数周细胞;此后微血管逐渐闭塞,血管瘤周细胞也逐渐消失。结论周细胞是血管瘤的主要组成细胞之一,血管瘤周细胞和内皮细胞共同进行微血管发生和发展而主导婴幼儿血管瘤的病理演变过程。     

三氧化二砷诱导乳腺癌细胞系MCF-7凋亡的实验研究

目的观察不同浓度的三氧化二砷(As2O3)作用不同时间后对乳腺癌细胞系MCF-7的影响及其作用机理。方法应用不同浓度的As2O3作用于乳腺癌细胞后,观察As2O3对乳腺癌细胞生长状态的影响;用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法观察其对MCF-7细胞增殖的影响;应用琼脂糖凝胶电泳和脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)检测As2O3对MCF-7细胞凋亡的诱导作用。结果不同浓度的As2O3作用于乳腺癌细胞有明显的时间和剂量依赖性,As2O3作用后细胞生长明显受抑制,并出现明显的凋亡特征性改变(细胞膜完整、染色质固缩、核碎裂、凋亡小体形成);经1、2、4及8μmol/L4个剂量的As2O3处理48h后,琼脂糖凝胶电泳检测到细胞发生凋亡时DNA降解形成梯形分子条带;4μmol/LAs2O3作用24、48及72h后TUNEL法可检测到细胞凋亡水平显著性升高。结论As2O3可明显抑制乳腺癌细胞的生长,其机理主要是诱导乳腺癌细胞凋亡。     

大鼠肝脏Kupffer细胞的分离、纯化

目的建立简单、有效而稳定的大鼠肝脏Kupffer细胞分离、纯化的实验方法。方法①大鼠肝脏的胶原酶离体灌注；②Percoll液不连续梯度离心分离Kupffer细胞；③选择性贴壁纯化Kupffer细胞；④吞噬墨汁实验、DAB染色，光镜、电镜下观察鉴定Kupffer细胞。结果最终获得的大鼠肝脏Kupffer细胞活性〉90％，纯度为95％，光镜下Kupffer细胞具有较强的贴壁及吞噬碳粒能力，DAB染色呈黄色煎蛋样结构；新分离的Kupffer细胞呈圆形，形态大小一致；2d后，细胞发生伸展，呈多角形或星形。电镜下观察可见典型特点：有伪足及杯口状改变，有丰富的溶酶体和吞噬体。结论本实验建立的大鼠肝脏Kupffer细胞的分离培养方法效果稳定，同时培养的细胞具有良好的生物学性状。     

机制微粒皮对皮肤细胞的影响

目的　观察微粒皮机制作微粒皮对皮肤细胞的损伤情况。　方法　将微粒皮机与人工剪制的微粒皮分成A、B两组 ,以透射电镜分别对两组微粒皮边缘细胞进行观察 ;用酶法试剂盒测定两组微粒皮上清液中琥珀酸脱氢酶的活性 ;以3 H TdR掺入法观察微粒皮细胞增殖情况。同时选择2 0例烧伤患者进行两组微粒皮移植 ,观察创面愈合时间。　结果　透射电镜观察显示 :A组微粒皮边缘细胞损伤较轻 ;其细胞培养上清液中琥珀酸脱氢酶的活性明显低于B组 ;3 H TdR掺入率明显高于B组。A组创面愈合时间明显短于B组 (P <0 .0 5 )。　结论　机制微粒皮对微粒皮边缘细胞的损伤轻 ,创面愈合时间短。     

靶向Survivin基因的短发卡RNA对U251细胞生长和凋亡的影响

目的观察Survivin基因特异性短发卡RNA（shRNA）对人脑胶质母细胞瘤U251细胞体外生长和细胞凋亡的影响。方法对U251细胞，稳定转染Survivin基因shRNA真核表达载体pWH1-SR的U251-SR细胞，以及稳定转染空载体pWH1的U251-P细胞。分别采用细胞计数法绘制生长曲线和平板克隆形成实验观察各组细胞的体外生长情况；采用流式细胞术（FCM）定量测定各组细胞的细胞周期和凋亡细胞数量；采用HE染色、Hoechst染色和原位末端标记（TUNEL）方法观察各组细胞形态学特征。结果与U251和U251-P细胞相比，U251-SR细胞生长明显减缓（P〈0．01），细胞克隆形成明显减少（P〈0．01）；U251-SR细胞G1期细胞增多，S期细胞减少，凋亡细胞增加至20．9％，并呈现典型的细胞凋亡形态学改变。结论靶向Survivin基因的特异性shRNA能够在体外明显抑制U251细胞的生长并诱导其发生大量凋亡。     

纯二氧化碳气体对卵巢癌细胞生长及运动能力的影响

目的:观察纯CO2气体环境对卵巢癌细胞SKOV-3生长及运动能力的影响。方法:将体外培养的卵巢癌SKOV-3细胞悬液接种于96孔板,将培养板分别暴露于纯CO2环境1、2、3h,对照组放入常规细胞培养箱培养。纯CO2处理后24、48、72、96、120h,用四唑盐(MTT法)比色试验测定各组细胞的比色值,观察细胞生长情况,绘制细胞生长曲线,观察各组细胞倍增时间。采用划痕(W ound-assay)试验测定各组细胞随机运动能力的变化。结果:卵巢癌细胞SKOV-3暴露于纯CO2环境后第24、48、72小时MTT值与对照组无显著性差异,第96小时后其MTT值明显高于对照组,其差异程度与暴露于纯CO2环境时间呈正相关。实验组细胞倍增时间较对照组缩短。各组细胞随机运动能力无显著性差异。结论:纯CO2气体环境对卵巢癌细胞SKOV-3生长的影响与作用时间有关,卵巢癌细胞暴露于纯CO2环境短时间(1~2h)内,对细胞生长无明显影响,3h后对肿瘤细胞的生长有明显促进作用。纯CO2环境对肿瘤细胞的随机运动能力无明显影响。     

hRMSCs的生物打印初步研究

目的 初步确立hBMSCs的二维生物打印方法 ,实现对细胞喷射过程的控制并保持打印后细胞活力. 方法 取健康志愿者骨髓5 mL,常规培养hBMSCs至第2代,调整为1×106个/mL单细胞悬液.实验分3组:打印组1细胞先行碘化丙啶(propidium iodide,PI)荧光标记,快速成型组织打印机进行二维细胞打印,x轴间隔300 μm,Y轴间隔1 500μm,激光共聚焦显微镜观察.打印组2细胞未行PI标记,经生物打印后培养2 h,Live/Dead viability Kit测定细胞活力,激光共聚焦显微镜观察细胞荧光染色情况;取1份未经Live/Dead viability Kit测试的打印组2细胞,培养7d后倒置显微镜观察细胞形态,贴壁后常规培养,动态观察细胞生长状态.对照组除细胞悬液不行打印,其余操作同打印组2. 结果 打印组1细胞激光共聚焦显微镜观察,"细胞墨滴"在二维组织中规则且均匀分布,满足二维设计细胞打印要求;每个"细胞墨滴"包含细胞15～35个.打印组2细胞经活力测试,细胞孵育30 min后激光共聚焦显微镜观察显示细胞荧光染色情况.对照组细胞活力与打印组2无明显区别.打印后细胞常规培养7 d,细胞可正常贴壁生长,形态、生长状态良好. 结论 通过生物打印技术可实现hBMSCs在二维平面上的定向、定量规则分布,并为进一步的细胞三维打印乃罕器官打印体系奠定基础.     

大鼠膀胱ICC样细胞与逼尿肌神经调控关系的形态学研究

目的 从形态学上探讨膀胱ICC样细胞在逼尿肌神经调控中的作用.方法 采用透射电镜观察大鼠膀胱内ICC样细胞、神经和逼尿肌细胞之间的超微结构关系.通过c-kit免疫荧光染色对大鼠膀胱ICC样细胞进行鉴定,并通过c-kit与PGP9.5免疫荧光双标观察ICC样细胞与神经的结构关系.结果 透射电镜显示,ICC样细胞与逼尿肌细胞紧密相邻处可见典型缝隙连接.在局部区域可见ICC样细胞的突起与神经末梢联系紧密.c-kit免疫荧光染色显示,大鼠膀胱内ICC样细胞主要位于黏膜下层、肌束边缘以及肌细胞间.c-kit与PGP9.5免疫荧光双标显示ICC样细胞与神经末梢在结构上关系紧密.结论 从形态学上看,膀胱内ICC样细胞具备参与逼尿肌神经调控的结构基础,进一步从功能学上予以证实将有助于全面阐明逼尿肌神经调控理论.     

烧伤血清刺激对大鼠肠上皮细胞结构和粘弹性的影响

目的　动态观察烧伤血清对体外肠上皮细胞 (IEC)骨架和细胞生物力学 (粘弹性 )的影响。　方法　培养大鼠肠上皮细胞株IEC 6 ,用烧伤血清刺激后 ,通过细胞骨架免疫组化、细胞ELISA法定量分析以及粘弹性测定技术 ,动态观察IEC致伤前后的变化。　结果　IEC在烧伤血清作用早期 ,骨架蛋白的表达即明显降低 ,微丝、微管蛋白阳性信号减弱 ,细胞粘弹性下降。　结论　细胞骨架的损伤可引起细胞脆性增加、粘弹性下降 ,导致细胞生物力学特性的改变。这种变化 ,可能直接参与烧伤后肠上皮细胞损伤的发生。     

鼻粘膜干细胞来源施万样细胞与PC12高分化细胞共培养研究

[目的]研究大鼠鼻粘膜来源干细胞(REMSCs)分化为施万样细胞与PC12高分化细胞共培养后髓鞘形成及轴突生长情况。[方法]取大鼠鼻甲组织分离、培养及鉴定REMSCs,使用Heregulin、血小板源性生长因子、成纤维细胞生长因子和Forskolin将REMSCs诱导分化为施万样细胞。将分化后形成的施万样细胞与PC12高分化细胞共培养。倒置显微镜下观察形态,免疫细胞化学染色检测细胞表面标志,电镜观察髓鞘形成能力,Western blot检测MBP。[结果]大鼠REMSCs表达外胚层标志物:nestin,SOX10和Vimentin。REMSCs诱导后形成的施万细胞成双极纺锤状,并且能够在体外持续增殖。倒置显微镜观察到施万样细胞沿PC12高分化细胞轴突生长并且促进PC12高分化细胞轴突延长,电镜显示施万样细胞和PC12高分化细胞形成髓鞘样结构。Western blot显示MBP在共培养3,6,9 d呈递增趋势。[结论]从下鼻甲分离的REMSCs诱导后可形成施万样细胞,施万样细胞具有形成髓鞘及促进轴突生长能力。     

硫化砷对骨肉瘤细胞生长和凋亡的影响

目的 研究硫化砷对骨肉瘤细胞生长和凋亡的影响，并探讨其可能的机制。方法 应用噻唑蓝（MTT）比色法检测细胞生长抑制率、倒置显微镜观察细胞形态、AnnexinV法检测细胞凋亡、逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）法检测bcl-2及bax基因的表达，观察硫化砷对骨肉瘤细胞株MG-63诱导凋亡的作用。结果 硫化砷可明显抑制MG-63细胞的增殖，1．0mg／L浓度的硫化砷作用24h后，MG-63细胞的抑制率可达26．43％。倒置显微镜观察被硫化砷抑制的MG-63细胞呈典型的凋亡改变．流式细胞仪检测凋亡率与硫化砷处理时间、处理浓度呈正相关。在硫化砷的作用下，MG-63细胞的bcl-2表达下调，而bax表达无明显改变．结论 硫化砷可有效地诱导骨肉瘤细胞凋亡，bcl-2表达下调是诱导细胞凋亡的重要机制。     

缺氧、氧损伤对肾小管上皮细胞α3整合素表达及粘附性的影响

目的 观察体外培养肾小管上皮细胞缺氧，氧损伤后细胞粘附性及α3整合素的改变，为细胞粘附性改变在急性缺血性肾功能衰竭发病机制中的作用提供理论依据。方法 采用化学缺氧与氧损伤模型。免疫荧光激光共聚焦显微镜观察培养人肾小管上皮细胞α3整合素分子表达及分布的改变，微管吸吮法观察细胞与基质以及细胞间粘附力的改变。结果 单纯氧损伤后肾小管上皮细胞α3整合素的表达无显著改变，缺氧损伤后其极性分布减弱，缺氧-氧损伤后极分布改变显著，这种分布改变与细胞和基质间的粘附性减弱和细胞间粘附性增强显著相关，结论 缺氧，氧损伤后肾小管上皮细胞α3整合素的极性分布改变对肾小管与基质和细胞间的粘附性均有显著影响。这种改变有可能在急性缺血性肾功能衰竭中发挥作用。     

成年大鼠嗅鞘细胞的分离培养及形态学研究

目的：探讨成年大鼠嗅鞘细胞（olfactory ensheathing cells,OECs）的分离培养和纯化方法,并观察其形态学变化及免疫组织学特性,为研究脊髓损伤后神经再生获得丰富嗅鞘细胞来源奠定理论基础。方法：采用原代培养技术,从成年SD大鼠的嗅球分离培养嗅鞘细胞,用Nash差速贴壁法和阿糖胞苷抑制相结合的方法培养纯化,倒置相差显微镜下观察嗅鞘细胞的形态变化特点及其生长情况,并行神经生长因子受体（NGFRp75）和胶质纤维酸性蛋白（GFAP）免疫组织化学染色鉴定以及纯度检测。结果：体外培养的成年大鼠嗅鞘细胞主要为双极或三极细胞,其突起细长。未经纯化则成纤维细胞生长迅速而占据优势,而纯化培养后的嗅鞘细胞纯度可达90％以上。免疫细胞化学染色显示,培养的嗅鞘细胞呈现NGFRp75和GFAP染色阳性。结论：成年大鼠嗅鞘细胞的原代培养中细胞纯化是必要且必须的;而在脊髓损伤修复的研究中,Nash差速贴壁法和化学药物法不失为一种简单、经济、实用的嗅鞘细胞纯化方法。     

20 kHz超声联合微泡诱导人前列腺癌PC3细胞的细胞自噬及早期凋亡

目的探讨低频、低功率超声联合微泡造影剂诱导人雄激素非依赖性前列腺癌PC3细胞早期细胞凋亡及自噬。方法以频率20kHz、声功率80mW超声连续波辐照人前列腺癌PC3细胞悬液60s,之后分为单纯微泡组(A)、单纯超声组(B)、超声联合微泡组(C)、空白对照组(D),分别给予相应处理。辐照后继续培养24h,以流式细胞仪检测细胞早期凋亡情况,吖啶橙染色荧光显微镜观察细胞胞浆内酸性囊泡,透射电镜观察细胞自噬泡。结果 4组细胞早期凋亡率差异有统计学意义(P0.01);两两比较,除A组与D组差异无统计学意义(P0.05)外,余差异均有统计学意义(P0.01)。C组细胞核基本正常,胞浆内可见大量发红色荧光的酸性囊泡及大量由双层膜包裹的自噬泡或自噬体。D组细胞形态基本正常,胞浆内未见到明显自噬泡形成。结论低频低功率超声联合微泡造影剂能明显提高人雄激素非依赖型前列腺癌PC3细胞的早期凋亡率,并可促进细胞自噬。     

胰岛素样生长因子-1抑制人椎间盘细胞凋亡及促进基质代谢的研究

胰岛素样生长因子1(IGF1)在软骨形成和软骨自稳态调节中起关键作用。有研究表明,IGF1能刺激软骨细胞分裂增殖,并可延缓及阻止多种体细胞的凋亡[1]。我们通过体外培养人椎间盘细胞,观察不同浓度胰岛素生长因子对椎间盘细胞凋亡、增殖及细胞外基质代谢的影响。一、材料与方法1.材料:取自8例施行脊柱侧凸前路松解术的患者,其中男4例,女4例,年龄12～17岁,平均15.2岁。2.椎间盘细胞原代培养及形态学观察:用倒置相差显微镜观察原代及传代培养的椎间盘细胞。3.IGF1对人椎间盘细胞凋亡及细胞外基质代谢的影响:Tunel法检测椎间盘细胞凋亡情况;收…